張玉清，王宜，杜志強(qiáng)，楊彩俠

（長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

雞ZZ/ZW 染色體遺傳體系異于哺乳動(dòng)物的XY/XX 體系，其雌性還具有獨(dú)特的兩側(cè)性腺不對(duì)稱發(fā)育方式[1]。雞胚胎孵化到E6.5 期性腺分化，E8.5期雌性胚胎的左右卵巢開始出現(xiàn)差異，左側(cè)卵巢繼續(xù)發(fā)育，而右側(cè)卵巢逐步退化。雞原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cell, PGC）是卵子的始祖細(xì)胞，其通過血流遷移到達(dá)并定植于生殖嵴。于E8.0～E10.0期，PGC 開始迅速增殖并形成卵原細(xì)胞，E12.5 期增殖減慢，減數(shù)分裂相關(guān)基因開始表達(dá)。E15.5 期卵原細(xì)胞開始進(jìn)入第一次減數(shù)分裂，至E17.5 期多數(shù)卵母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂，E18.5 期絕大部分卵母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂，且多個(gè)卵母細(xì)胞會(huì)形成細(xì)胞簇，其后卵母細(xì)胞停滯在第一次減數(shù)分裂前期的雙線期，直至孵化出雛[2]。

表觀修飾是不改變序列順序，通過修飾DNA/RNA/組蛋白, 從而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，影響基因的表達(dá)活性，這種效應(yīng)可以遺傳[3]。研究表明表觀修飾在生理、病理等多方面發(fā)揮重要作用，例如配子發(fā)生與早期胚胎生長(zhǎng)發(fā)育過程[4]。DNA 5mC 甲基化發(fā)生在胞嘧啶的C5 位置（C5-methylcytidine，5mC）, 主要由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 （DNA methyl-transferase,DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）作為甲基供體，將CG 兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶選擇性地添加甲基，而其去甲基則由TET（teneleven translocation）酶催化。DNA 5mC 甲基化廣泛存在于真核生物細(xì)胞核中，調(diào)控基因表達(dá)，參與卵子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育[5-6]。DNMT1、DNMT3A 和TET 酶影響雌性動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和早期胚胎發(fā)育[7-9]。RNA 的m6A 甲基化發(fā)生在腺嘌呤的N6位置（N6-methyladenosine, m6A），由甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3 和METTL14 催化添加、去甲基化酶ALKBH5 和FTO 去除甲基，參與調(diào)控性腺發(fā)育、雌性生殖和卵子減數(shù)分裂等生殖生理過程[10-12]。組蛋白H3 在其不同賴氨酸殘基位點(diǎn)可以添加1～3 個(gè)甲基進(jìn)行修飾，由甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶催化其動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，影響多種生物學(xué)過程，包括性腺發(fā)育[13-14]。

本研究旨在研究雞胚左側(cè)卵巢卵母細(xì)胞由開始到全部進(jìn)入減數(shù)分裂，其后阻滯，直至孵化出雛前的時(shí)間段，DNA/RNA/組蛋白H3 甲基化修飾酶基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律，結(jié)果為揭示雞胚卵巢中卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)入和阻滯的表觀調(diào)控提供基因表達(dá)基礎(chǔ)信息，從而為優(yōu)化家禽種業(yè)的擴(kuò)繁系統(tǒng)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

AA 肉雞種蛋，購自湯陰縣全達(dá)家禽育種有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

孵化箱（KFZ528，德州科裕孵化設(shè)備有限公司）、分光光度計(jì)（Nano-400A，杭州奧盛儀器有限公司）、梯度PCR 儀（Nexus gradient，德國Eppendorf）、電泳儀（HS120，北京萊普特科學(xué)儀器有限公司）、熒光定量PCR 儀（CFX96，美國Bio-Rad）。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

Trizol（15596026，Thermo Scientific）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit,K1622，Thermo Scientific）、PCR 引物合成（上海生物工程有限公司）、DEPC 水（Biosharp）、瓊脂糖（Biosharp）、定量PCR 試劑（ChamQ Universal SYBR qPCR Master mix，Q711- 02，諾唯贊）。

1.2 方法

1.2.1 準(zhǔn)備

孵化前，種蛋消毒并標(biāo)記稱重。蛋重在65.0±5.0 g 范圍內(nèi)的種蛋置于溫度37.8 ℃、相對(duì)濕度為60%的孵化箱孵化。于孵化第5 d、9 d 和13 d 照蛋去除未受精蛋和死胚。于雞胚孵化的E12.5 期、E15.5 期、E17.5 期、E18.5 期和E20.5 期各收集6個(gè)雞胚左側(cè)卵巢放至凍存管中，液氮速凍后，置于-80 ℃保存。

1.2.2 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol 和酚氯仿抽提法提取雞胚左側(cè)卵巢RNA，檢測(cè)RNA 純度和濃度。取1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃2 min，55 ℃15 min,85 ℃5 min。cDNA 稀釋10 倍，-20 ℃保存。

1.2.3 定量PCR

采用Premier5.0 設(shè)計(jì)表觀修飾相關(guān)基因的引物（表1），所設(shè)引物均跨外顯子，防止基因組DNA對(duì)PCR 結(jié)果的影響，NCBI （National Center for Biotechnology Information）上比對(duì)引物擴(kuò)增區(qū)域的唯一性和位置正確性。引物用DEPC 水稀釋至10μM。普通PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶的唯一性和片段大小的正確性（圖1）。普通PCR 條件：94 ℃2 min；94 ℃30 s，60 ℃60 s，35 循環(huán)，72 ℃5 min。定量PCR 采用10 μL的反應(yīng)體系，包括：5 μL 2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master mix，3.4 μL 水，1 μL cDNA，0.6 μL 10 μM 上下游引物。定量PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃10 min；95 ℃15 s, 60 ℃60 s，40 個(gè)循環(huán)。評(píng)價(jià)定量PCR 的溶解曲線確定擴(kuò)增產(chǎn)物為單峰。每個(gè)樣品點(diǎn)3 個(gè)重復(fù)孔，以內(nèi)參基因EEF1A 和RPL15 對(duì)結(jié)果進(jìn)行矯正（兩個(gè)內(nèi)參基因分別標(biāo)準(zhǔn)化后的幾何平均值），用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR 產(chǎn)物的唯一性和片段大小的正確性

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS25.0 軟件中的單因素方差分析和Duncan 檢驗(yàn)對(duì)定量PCR 結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)P＜0.05、0.01 或0.001 時(shí)，分別以*、**或***表示差異顯著、0.01 或0.001 水平上的差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 5mC（去）甲基化酶基因的表達(dá)

對(duì)于DNA 5mC 甲基化酶基因的表達(dá)，RTqPCR 結(jié)果表明，DNMT1 和DNMT3A 在雞胚孵化到E12.5～E20.5 期時(shí)左側(cè)卵巢中的表達(dá)無顯著的變化（P＞0.05；圖2A）。DNMT3B 在E12.5 期表達(dá)最高，跟E12.5 期相比，E15.5 期（1.00 vs. 0.58; P＜0.05）, E17.5 期（1.00 vs. 0.42; P＜0.01），E18.5 期（0.57 vs. 1.00; P＜0.05）和E20.5 期（0.34 vs. 1.00;P＜0.001）的表達(dá)均顯著下降（圖2A）。DNA 5mC 去甲基化酶基因TET1 和TET3 在雞胚卵巢發(fā)育的E12.5～E20.5 期mRNA 的表達(dá)無顯著變化（P＞0.05），而TET2 在E18.5 期的表達(dá)顯著高于E12.5期（2.06 vs. 1.00; P＜0.05）（圖2B）。

圖2 DNA 5mC（去）甲基化酶基因的mRNA 表達(dá)

2.2 RNA m6A（去）甲基化酶基因的表達(dá)

RNA m6A 甲基化酶METTL3 在雞胚左側(cè)卵巢發(fā)育的E12.5～E20.5 期mRNA 表達(dá)無顯著變化（P＞0.05），METTL14 的表達(dá)E12.5～E15.5 期沒有顯著變化，其后到E20.5 期逐漸上升到最高值，E20.5 期相較于E12.5 期（1.91 vs. 1.00; P＜0.05）、E15.5 期（1.91 vs. 0.90; P＜0.01）和E17.5 期（1.91 vs. 1.16;P＜0.05）表達(dá)呈現(xiàn)顯著上升（圖3A）。RNA m6A 去甲基化酶ALKBH5 的表達(dá)E12.5～E15.5 期沒有顯著的變化，到E17.5 期（0.78 vs. 1.00; P＞0.05）有輕微的下降，E18.5～E20.5 期再逐步升高，其中E20.5期相對(duì)E17.5 期表達(dá)有顯著差異（1.49 vs. 0.78；P＜0.05）（圖3B）。RNA m6A 去甲基化酶FTO 的表達(dá)E12.5～E18.5 期沒有顯著的變化，到E20.5 期顯著升高，與E12.5 期（2.31 vs. 1.00; P＜0.01）、E15.5期（2.31 vs. 0.90; P＜0.01）、E17.5 期（2.31 vs. 0.74;P＜0.001）和E18.5 期（2.31 vs. 1.37; P＜0.05）相比均有顯著上升（圖3B）。

圖3 RNA m6A（去）甲基化酶基因的mRNA 表達(dá)

2.3 組蛋白H3 賴氨酸（去）甲基化酶基因的表達(dá)

組蛋白H3 賴氨酸甲基化酶基因MLL2、SUV39H2、EED 和SETD2 的表達(dá)在雞胚左側(cè)卵巢發(fā)育的E12.5～E20.5 期無顯著變化（P＞0.05；圖4A）。組蛋白H3 賴氨酸去甲基化酶基因KDM4A 的表達(dá)在E12.5～E20.5 期也無顯著變化（P＞0.05），但KDM1B 的表達(dá)在E20.5 期相較于E12.5 期呈顯著上升（3.29 vs. 1.00; P＜0.05），KDM1A 在E15.5 期相較于E12.5 期呈顯著下降（0.60 vs. 1.00; P＜0.05）（圖4B）。

圖4 組蛋白H3 賴氨酸（去）甲基化酶的mRNA 表達(dá)

3 討論

有研究顯示，隨小鼠年齡增長(zhǎng)，DNA 5mC 甲基化酶DNMT1 的mRNA 表達(dá)在卵巢中逐漸降低[15]，而DNMT3A 和DNMT3B 表達(dá)水平顯著升高[16]。敲低DNMT 酶損害胚胎發(fā)育，導(dǎo)致胚胎停滯[7]。RNA m6A 修飾參與了非洲爪蟾減數(shù)分裂與胚胎發(fā)育[17]。敲除RNA m6A 甲基化酶METTL3 導(dǎo)致小鼠胚胎致死，卵泡發(fā)育缺陷、雌性不育[18]。RNA m6A 甲基化酶METTL3/14 和去甲基化酶ALKBH5/FTO 在豬卵母細(xì)胞中表達(dá)，L-抗壞血酸處理顯著降低METTL14 mRNA 水平[19]。卵巢早衰病人卵巢的FTO 表達(dá)顯著降低，RNA m6A 修飾水平升高[20]。本研究表明，雞胚左側(cè)卵巢在孵化的E12.5 ～E20.5 期DNMT1/3A/3B 和TET1/2/3 均表達(dá), 其中DNMT3B 和TET2 mRNA 表達(dá)呈現(xiàn)顯著變化; RNA m6A （去）甲基化酶基因和組蛋白H3賴氨酸（去） 甲基化酶基因在雞胚孵化E12.5～E20.5 期的左側(cè)卵巢表達(dá)，其中METTL14、FTO、ALKBH5、KDM1A 和KDM1B 呈顯著的動(dòng)態(tài)變化。但是，在雞胚發(fā)育中，DNA、RNA 和組蛋白甲基化表觀修飾酶基因的表達(dá)和調(diào)控功能缺乏報(bào)道，因此，本研究在雞胚E12.5～E20.5 期卵巢中鑒定具有表達(dá)和表達(dá)顯著變化的表觀修飾酶基因的調(diào)控功能有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究表明DNA 5mC、RNA m6A 和組蛋白H3賴氨酸（去）甲基化表觀修飾酶基因在雞胚E12.5～E20.5 期左側(cè)卵巢中表達(dá)，且DNMT3B、TET2、METTL14、FTO、ALKBH5、KDM1A 和KDM1B 呈顯著的動(dòng)態(tài)變化，為進(jìn)一步解析這些基因在雞胚左側(cè)卵巢發(fā)育、卵子減數(shù)分裂進(jìn)入和阻滯過程中的表觀調(diào)控功能提供了重要的表達(dá)信息?！?/p>