毛乾興 李卓穗 卞國良 范文杰 徐獻剛 尚旭嵐

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037) (句容市磨盤山林場) (南京林業(yè)大學(xué))

青錢柳(Cyclocaryapaliuru)屬胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬(Cyclocarya),是中國特有的單種屬植物,主要分布于我國亞熱帶地區(qū)[1]。青錢柳常以葉入藥,或制成茶葉代茶飲[2],在民間已有悠久的歷史。藥理研究表明,青錢柳葉提取物具有降血糖、降血壓和抗氧化等生物活性[3-6]。前期研究發(fā)現(xiàn),青錢柳在自然界中存在二倍體與同源四倍體兩種細胞型[7]。

多倍化是推動植物進化的一個重要因素。由于染色體倍性的提高,多倍體植物常表現(xiàn)為器官的巨大性和較強的抗逆性,而且由于基因的重組,加大了基因表達上的復(fù)雜程度,改變了各種代謝途徑中酶的活性,從而提高了次生代謝產(chǎn)物的質(zhì)量分數(shù)[8-9]。但Tan et al.[10]對紅橘(Citrusreticulata)的研究發(fā)現(xiàn),基因組加倍抑制了果實中黃酮類物質(zhì)的積累;劉瑛琦[11]的研究也發(fā)現(xiàn),藍花丹(Plumbagoauriculata)同源四倍體較二倍體植株地上和地下部分的白花丹素質(zhì)量分數(shù)顯著降低。植物次生代謝產(chǎn)物通常是利用初生代謝產(chǎn)物合成或分解代謝而來,其合成也需要能量和額外的營養(yǎng)投入[12]。因此,初生代謝產(chǎn)物的分配需要在初生生長和次生代謝間保持一個平衡[13]。已有研究者對不同種源或家系青錢柳苗期生長規(guī)律,和黃酮、三萜、多酚等次生代謝產(chǎn)物的積累規(guī)律進行了研究[14-15],但尚未見從不同倍性角度開展相關(guān)研究的報道。

本研究以二倍體和四倍體青錢柳當年生容器苗為材料,通過定期測定其苗高和地徑,對其年生長規(guī)律進行模型擬合,比較兩種倍性苗木的生長性狀、碳氮養(yǎng)分質(zhì)量分數(shù)和主要次生代謝產(chǎn)物積累的差異,并探究兩種倍性青錢柳苗木初生生長和次生代謝的關(guān)系,為青錢柳種質(zhì)資源的選育和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

試驗材料：采種母樹均來自湖北五峰土家族自治縣,2020年春季取莖尖,采用常規(guī)壓片法制片進行染色體計數(shù),確定母樹倍性分別為二倍體(2n=2x=32)和四倍體(2n=4x=64),于2020年10月分單株采種,陰干去翅后,室外自然層積至種子萌發(fā)。2022年4月,將株高為3～5 cm的實生苗移栽至無紡布容器(口徑8 cm×高度11 cm)中,擺放于南京林業(yè)大學(xué)園林實驗教學(xué)中心遮蔭大棚下,遮光度約為60%。所用基質(zhì)為江蘇興農(nóng)科技有限公司生產(chǎn)的育苗基質(zhì),主要由泥炭、椰糠和珍珠巖組成,并添加腐殖酸有機肥。移栽成活后,從二倍體和四倍體中各選擇生長一致的苗木180株進行觀測,每個倍性3個重復(fù),每個重復(fù)60株。

苗高、地徑的測定：從2022年4—12月,每月初分別用鋼卷尺和游標卡尺測定所有苗木的苗高和地徑。地徑和苗高曲線擬合采用邏輯斯諦(Logistic)擬合方程y=k/(1+ae-bx),其中,y為苗高或地徑生長量;x為時間;a、b為待定系數(shù);k為既定條件的苗高或地徑生長可能達到的極限值,可用等差三點法計算求得。

形態(tài)指標和生物量的測定：2022年10月上旬,每個重復(fù)選取15株長勢一致且健壯的標準株,二倍體和四倍體各45株,取從上往下數(shù)第四復(fù)葉,用WZNDENDRO根系掃描儀分析系統(tǒng)進行掃描,測其面積。同時,每個重復(fù)隨機挑選6個標準株帶回實驗室,將根部清洗干凈,主根與須根分離并平鋪在同一平面,用根系掃描儀分析系統(tǒng)進行掃描,獲得各徑級根系的長度、面積、體積。將掃描后的葉片、根系與莖分別測定鮮質(zhì)量,后將其分別放入烘箱內(nèi)60 ℃烘干至恒定質(zhì)量,測其干質(zhì)量,即獲得單株葉生物量、單株莖生物量、單株根系生物量和整株生物量。

全碳、全氮質(zhì)量分數(shù)的測定：將測定生物量后的葉、莖、根,分別研磨成粉末,過孔徑為0.15 mm的篩子,將過篩后的樣品充分混合。每個樣品稱取100 mg,用錫箔紙包好,均采用元素分析儀(德國碳氮元素分析儀)測定全碳、全氮質(zhì)量分數(shù)。

次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)的測定：取葉、莖、根粉末樣品,參照林源等[16]的方法進行提取?？傸S酮質(zhì)量分數(shù)的測定參照Zhou et al.[17]的方法,總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)的測定參照Fan et al.[18]的方法,總多酚質(zhì)量分數(shù)的測定參照游見明等[19]的方法。次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)以1 g青錢柳葉干樣中含有次生代謝產(chǎn)物的質(zhì)量表示(單位為mg·g-1);次生代謝產(chǎn)物積累量以次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)與相應(yīng)葉生物量的乘積表示(單位為mg·株-1)。

數(shù)據(jù)處理：運用Excel 2019軟件將試驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,用SPSS 26.0軟件對各指標進行獨立樣本t檢驗,苗高和地徑進行邏輯斯諦(Logistic)非線性回歸分析,并對初生生長指標與次生代謝指標進行相關(guān)性(Person)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青錢柳二、四倍體苗期生長節(jié)律差異

為了解不同倍性青錢柳1年生苗的年生長節(jié)律,運用邏輯斯諦方程分別擬合二倍體和四倍體的苗高和地徑生長過程,方差分析結(jié)果和擬合方程見表1。兩種倍性苗高、地徑的邏輯斯諦方程擬合模型回歸關(guān)系均達到極顯著水平。

由圖1可知,二倍體與四倍體青錢柳的苗高和地徑生長節(jié)律基本相似,呈S型曲線增長。5月份的生長速率較緩,6月開始加快,8月達到最大生長速率,9月生長逐漸趨于平緩。根據(jù)邏輯斯諦方程求導(dǎo)所得拐點(表1)及移栽時間(4月9日),可將1年生苗的生長階段劃分為生長初期、速生期、生長后期3個時期。

結(jié)合實際觀測和理論計算,將二倍體1年生苗的苗高生長劃分為,生長初期(4月9日—6月2日)、速生期(6月3日—9月2日)、生長后期(9月3日—11月末);四倍體1年生苗的苗高生長劃分為,生長初期(4月9日—6月14日)、速生期(6月15日—9月26日)、生長后期(9月27日—11月末)。二倍體苗高速生期持續(xù)時間為91d,四倍體苗高速生期持續(xù)時間為103 d,四倍體苗高速生期比二倍體速生期延長12d。速生期內(nèi),二、四倍體1年生苗苗高生長量分別約占總生長量的48.9%、51.2%。

二倍體1年生苗的地徑生長劃分為,生長初期(4月9日—6月10日)、速生期(6月11日—8月30日)、生長后期(8月31日—11月末);四倍體1年生苗的地徑生長劃分為,生長初期(4月9日—6月12日)、速生期(6月13日—9月15日)、生長后期(9月16日—11月末)。二倍體地徑速生期持續(xù)時間為80 d,四倍體持續(xù)時間為94 d,四倍體地徑速生期比二倍體速生期延長14 d。速生期內(nèi),二、四倍體1年生苗地徑生長量分別約占總生長量的47.5%、49.7%。

表1 1年生青錢柳苗高和地徑的邏輯斯諦回歸方程

圖1 1年生青錢柳苗高和地徑的邏輯斯諦擬合曲線

2.2 青錢柳二、四倍體生長性狀及生物量差異

青錢柳二倍體和四倍體生長性狀情況見表2。四倍體青錢柳復(fù)葉面積比二倍體增加了23.6%,根體積增加了16.2%,都達到顯著差異水平(P<0.05),直徑大于2 mm的根系體積比二倍體增加了57.4%,達到極顯著差異水平(P<0.01)。另外,四倍體青錢柳總?cè)~生物量、莖生物量、根生物量及總生物量比二倍體分別增加了44.0%、16.8%、52.6%、40.0%,均達到顯著差異水平。結(jié)合根系掃描圖片(圖2)分析,四倍體主根較粗大,根系生物量的積累主要集中在主根,側(cè)根較二倍體少?？梢?四倍體青錢柳在葉片和主根的性狀上表現(xiàn)出巨大性。

表2 青錢柳二倍體與四倍體生長性狀及生物量

倍 性d≥2mm根體積/cm3葉生物量/g莖生物量/g根生物量/g總生物量/g二倍體(3.38±0.07)b(1.82±0.06)b(1.55±0.12)b(2.30±0.03)b(5.67±0.18)b四倍體(5.32±0.10)a(2.62±0.01)a(1.81±0.10)a(3.51±0.13)a(7.93±0.02)a四倍體比二倍體增幅/%57.4 44.0 16.8 52.640.0

A為青錢柳四倍體葉片形態(tài),B青錢柳二倍體葉片形態(tài);a為青錢柳四倍體根系形態(tài),b為青錢柳二倍體根系形態(tài)。

2.3 青錢柳二、四倍體碳氮養(yǎng)分質(zhì)量分數(shù)差異

由表3可知,四倍體青錢柳葉片的氮質(zhì)量分數(shù)顯著低于二倍體(P<0.05),碳質(zhì)量分數(shù)在兩種倍性間無顯著差異,碳、氮質(zhì)量分數(shù)比則四倍體顯著高于二倍體(P<0.05);四倍體青錢柳莖的碳質(zhì)量分數(shù)顯著高于二倍體(P<0.05),氮質(zhì)量分數(shù)和碳、氮質(zhì)量分數(shù)比在兩種倍性間均無顯著差異;四倍體青錢柳根系碳、氮質(zhì)量分數(shù)均顯著低于二倍體(P<0.05),但碳、氮質(zhì)量分數(shù)比四倍體顯著高于二倍體(P<0.05)。

表3 青錢柳二倍體與四倍體碳氮養(yǎng)分質(zhì)量分數(shù)比較

2.4 青錢柳二、四倍體次生代謝產(chǎn)物積累差異

青錢柳植株各器官次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)的測定結(jié)果見表4,青錢柳四倍體葉片中總黃酮、總多酚質(zhì)量分數(shù)顯著低于二倍體(P<0.05),三萜質(zhì)量分數(shù)無顯著差異;青錢柳四倍體與二倍體莖總黃酮、總多酚和總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)均無顯著差異;青錢柳四倍體根系總黃酮、總多酚和總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)顯著低于二倍體(P<0.05)。

青錢柳次生代謝產(chǎn)物積累量結(jié)果顯示,四倍體莖和根系黃酮積累量顯著高于二倍體(P<0.05);四倍體葉片多酚積累量顯著高于二倍體(P<0.05);四倍體葉片三萜積累量顯著高于二倍體(P<0.05);其余各器官的次生代謝產(chǎn)物積累量均未呈現(xiàn)顯著差異。

表4 青錢柳二、四倍體葉、莖、根次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)與積累量

倍性總多酚質(zhì)量分數(shù)/g·kg-1葉莖根總多酚積累量/mg·株-1葉莖根二倍體(35.45±0.40)a(12.50±1.56)a(33.68±1.32)a(64.60±0.72)b(18.44±1.03)a(75.10±3.79)a四倍體(31.35±0.89)b(17.45±2.69)a(23.26±4.18)b(81.99±2.33)a(29.76±5.22)a(79.24±3.94)a

倍性總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)/g·kg-1葉莖根總?cè)品e累量/mg·株-1葉莖根二倍體(25.41±0.29)a(20.01±2.64)a(45.04±2.10)a(46.30±0.53)b(29.92±1.91)a(100.07±2.71)a四倍體(26.98±0.27)a(26.36±4.34)a(28.56±5.55)b(70.54±0.70)a(48.11±6.48)a(98.15±4.06)a

2.5 青錢柳苗期生長性狀與次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)與積累量的相關(guān)性分析

從表5可見,兩種倍性青錢柳的苗高、地徑、復(fù)葉面積、根體積、葉生物量和根系生物量之間均呈極顯著正相關(guān);比葉質(zhì)量與苗高、地徑、復(fù)葉面積、根體積、葉生物量、根生物量、葉碳、氮質(zhì)量分數(shù)比呈顯著或極顯著正相關(guān);葉碳、氮質(zhì)量分數(shù)比與苗高、地徑、復(fù)葉面積、根體積、葉生物量、莖生物量、根生物量呈顯著正相關(guān)。

青錢柳苗高、地徑、復(fù)葉面積、葉生物量、根生物量和葉碳、氮質(zhì)量分數(shù)比與葉片黃酮和葉片多酚質(zhì)量分數(shù)呈顯著或極顯著負相關(guān);苗高、地徑、復(fù)葉面積、根體積、葉生物量和根生物量與葉三萜質(zhì)量分數(shù)呈顯著正相關(guān);莖碳、氮質(zhì)量分數(shù)比與莖黃酮質(zhì)量分數(shù)呈顯著負相關(guān)。

青錢柳苗高、地徑、復(fù)葉面積、根體積、葉生物量、比葉質(zhì)量、莖生物量、根生物量與葉多酚、葉三萜和莖黃酮積累量呈顯著或極顯著正相關(guān);苗高、地徑、復(fù)葉面積、葉生物量、根生物量與根黃酮積累量呈顯著正相關(guān);葉片氮質(zhì)量分數(shù)與葉三萜積累量、莖黃酮和莖三萜積累量、根黃酮積累量呈顯著負相關(guān);葉片碳、氮質(zhì)量分數(shù)比與葉多酚、葉三萜、莖黃酮、莖多酚和莖三萜積累量呈顯著正相關(guān)。

3 討論

多倍體植株普遍表現(xiàn)出更優(yōu)越的農(nóng)藝性狀,如生活力強、生長迅速、器官增大、代謝物質(zhì)量分數(shù)增加等,因而具有較高的育種價值和應(yīng)用前景[20]。林木多倍體育種在短周期森林工業(yè)用材樹種、收獲次生代謝產(chǎn)物的經(jīng)濟林木和生態(tài)防護林木新品種選育等方面都發(fā)揮了重要作用[21]。多倍體培育技術(shù)已應(yīng)用于杜仲(Eucommiaulmoides)[22]、黃梁木(Neolamarckiacadamba)[23]、黃連木(Pistaciachinensis)[24]等木本藥用植物,獲得了生物量和有效成分質(zhì)量分數(shù)高的種質(zhì)材料。

表5 青錢柳苗期生長性狀與次生代謝產(chǎn)物積累的相關(guān)系數(shù)

指標相關(guān)系數(shù)w(YF)w(YP)w(YT)w(JF)w(JP)w(JT)w(GF)w(GP)w(GT)PYFPYPPYTPJFPJPPJTPGFPGPw(YP)0.91?w(YT)-0.84?-0.65w(JF)0.360.45-0.47w(JP)0.500.57-0.370.88??w(JT)0.430.54-0.230.83??0.99??w(GF)0.560.25-0.75-0.70?-0.70?-0.68?w(GP)0.350.10-0.74-0.55-0.54-0.520.92??w(GT)0.320.14-0.68-0.51-0.49-0.460.90??0.99??PYF0.350.260.10-0.200.210.28-0.06-0.31-0.35PYP-0.95??-0.750.95??-0.33-0.37-0.26-0.76-0.56-0.49-0.20PYT-0.98??-0.88?0.92??-0.42-0.47-0.37-0.63-0.48-0.44-0.180.98??PJF-0.97??-0.810.84?-0.38-0.46-0.37-0.60-0.44-0.37-0.430.95??0.95??PJP-0.79-0.670.50-0.21-0.35-0.31-0.36-0.13-0.04-0.750.700.700.88?PJT-0.86?-0.810.53-0.31-0.48-0.46-0.27-0.09-0.05-0.700.720.770.90?0.97??PGF-0.79-0.89?0.69-0.42-0.27-0.20-0.40-0.16-0.140.060.700.82?0.700.510.63PGP-0.43-0.580.19-0.47-0.25-0.230.100.080.11-0.290.260.380.480.630.680.66PGT0.26-0.08-0.22-0.380.040.040.450.210.140.54-0.36-0.21-0.33-0.34-0.230.350.51

本研究結(jié)果表明,青錢柳二倍體與四倍體苗木的生長節(jié)律基本相似,都呈“S”型曲線生長,但四倍體較二倍體的速生期延長了約兩周。生長期延長,有利于植株生物量的積累,如賈明良等[25]的研究發(fā)現(xiàn),十六倍體半夏(Pinelliaternata)比八倍體半夏的生長期延長,產(chǎn)量顯著增加。本研究還表明,四倍體青錢柳復(fù)葉面積、根系體積與主根體積均顯著高于二倍體,且葉生物量、根生物量和總生物量均有顯著提升,這說明四倍體青錢柳地上部分與地下部分都表現(xiàn)出了巨大性的特點。張石虎等[26]對黃梁木的研究表明,與二倍體相比,四倍體莖更粗、葉面積更大、生物量更高。林玉鳳[27]對穿心蓮(Andrographispaniculata)的研究發(fā)現(xiàn),四倍體莖更粗、葉面積更大、生物量更高,但植株較矮。青錢柳是我國極具推廣價值的藥食同源植物,目前主要采收葉片進行加工利用,四倍體青錢柳較二倍體有更高的生物量,因此,具有較大的開發(fā)利用潛力。

碳和氮是植物器官以及代謝產(chǎn)物的基本組成元素,化學(xué)計量比與植物生長和代謝密切相關(guān),植物葉片的碳、氮質(zhì)量分數(shù)比在一定程度上反映了植物的營養(yǎng)利用效率,具有重要的生態(tài)學(xué)意義[28-29]。本研究結(jié)果表明,四倍體青錢柳葉片與根系碳、氮質(zhì)量分數(shù)比顯著高于二倍體,相關(guān)性分析結(jié)果也顯示,青錢柳葉碳、氮質(zhì)量分數(shù)比與苗高、地徑、生物量等多個生長指標呈極顯著或顯著正相關(guān),說明四倍體具有更高的營養(yǎng)利用效率,相同的養(yǎng)分條件能獲得更大的生物量。

對青錢柳葉、莖、根中次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)的測定結(jié)果表明,兩種倍性苗木的總黃酮與總多酚質(zhì)量分數(shù)均為葉片中最高,而總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)為根系中最高。通過比較發(fā)現(xiàn),四倍體青錢柳葉片與根系中的總黃酮和總多酚質(zhì)量分數(shù)均顯著低于二倍體,而四倍體根系中總黃酮、總多酚和總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)也顯著低于二倍體。次生代謝過程被認為是植物在長期進化中對生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果,它在處理植物與生態(tài)環(huán)境的關(guān)系中充當著重要的角色[8]。植物的生長與次生代謝之間普遍存在著權(quán)衡關(guān)系,而這種關(guān)系對藥用植物藥效成分的積累至關(guān)重要[12]。相關(guān)性分析結(jié)果表明,青錢柳葉片總黃酮和總多酚質(zhì)量分數(shù)與苗高、地徑、復(fù)葉面積、比葉質(zhì)量、碳氮質(zhì)量分數(shù)比等生長性狀指標呈顯著負相關(guān),說明青錢柳初生生長和次生代謝間存在著一種權(quán)衡關(guān)系。本研究結(jié)果顯示,雖然四倍體葉中總黃酮和總多酚質(zhì)量分數(shù)較低,但由于四倍體葉生物量顯著大于二倍體,因此兩種倍性葉中總黃酮積累量無顯著差異,四倍體葉總多酚和總?cè)品e累量顯著高于二倍體。但應(yīng)注意的是,本研究結(jié)果僅以1年生容器苗為材料觀測所得,隨著苗木的生長發(fā)育,兩種倍性植株的生長和次生代謝會如何改變,還需進行長期的研究。

4 結(jié)論

1年生青錢柳二倍體與四倍體苗木的生長節(jié)律基本相似,但四倍體的速生期較二倍體延長了約兩周;四倍體復(fù)葉面積、根體積、根生物量、葉生物量和總生物量顯著高于二倍體;四倍體葉片和根系碳氮質(zhì)量分數(shù)比顯著高于二倍體,說明四倍體具有更高的營養(yǎng)利用效率,能獲得更大的生物量;四倍體青錢柳葉片中的總黃酮和總多酚質(zhì)量分數(shù)均顯著低于二倍體,四倍體根系中總黃酮、總多酚和總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)也顯著低于二倍體,但由于四倍體葉生物量顯著大于二倍體,因此兩種倍性葉中總黃酮積累量無顯著差異,四倍體葉總多酚和總?cè)品e累量顯著高于二倍體。相關(guān)性分析結(jié)果表明,青錢柳葉片總黃酮和總多酚質(zhì)量分數(shù)與苗高、地徑、復(fù)葉面積、比葉質(zhì)量、碳氮質(zhì)量分數(shù)比等生長性狀指標呈顯著負相關(guān),說明青錢柳初生生長和次生代謝間也存在著一種權(quán)衡關(guān)系。