蔣 云，張連全，郝 明，范超蘭，甯順腙，姜 博，楊苗苗，張 潔，呂季娟，劉登才*

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，成都 610061；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，成都 611130；3.四川省種子站，成都 610041）

小麥胚乳中含有的貯藏蛋白賦予了小麥面團(tuán)彈性和延伸性，因而極大地豐富了小麥加工終產(chǎn)品的多樣性。谷蛋白是小麥貯藏蛋白的主要組成部分之一，根據(jù)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），可將谷蛋白分為高分子量麥谷蛋白亞基（HMW-GS）和低分子量麥谷蛋白亞基（LMW-GS）。其中，編碼小麥HMW-GS 的基因位于小麥染色體1A、1B 和1D 長(zhǎng)臂的Glu-1的位點(diǎn)上，分別被稱為Glu-1A、Glu-1B和Glu-1D位點(diǎn)。每個(gè)位點(diǎn)由2個(gè)緊密連鎖的基因組成，分別編碼一個(gè)分子量較大的x型亞基和一個(gè)分子量較小的y型亞基。大量研究證實(shí)，HMW-GS 的組成和數(shù)量對(duì)谷蛋白聚合體的數(shù)量和質(zhì)量有重要作用，與小麥面團(tuán)加工品質(zhì)關(guān)系密切[1-2]。

研究表明，Glu-1D對(duì)加工品質(zhì)的影響效應(yīng)大于Glu-1A和Glu-1B。Glu-1D的等位基因中最重要的是5+10 和2+12[3]，雖然針對(duì)5+10 和2+12 品質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)較多，但大多數(shù)研究以分離群體、自然群體或姊妹系為材料，遺傳背景的差異影響了結(jié)果準(zhǔn)確性。而近等基因系排除了遺傳背景對(duì)加工品質(zhì)的干擾，能夠更加準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)單個(gè)HMW-GS亞基或亞基組合對(duì)面團(tuán)品質(zhì)參數(shù)和終端產(chǎn)品品質(zhì)的影響。利用HMW-GS 近等基因系，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)5+10 和2+12 的品質(zhì)效應(yīng)開展了一系列研究。上述研究表明，大多數(shù)情況下5+10 和2+12 亞基對(duì)籽粒蛋白質(zhì)含量[4-16]、Zel 沉降值[10-13]及面團(tuán)形成時(shí)間[7,10-11]的影響不明顯，5+10 對(duì)谷蛋白大聚體的合成[4-6,17]、面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間[8-7,14-15,18]、拉伸面積[10-11,14-15]、最大拉伸阻力[7,10-11,14-16]及面包評(píng)分[7,10-14]有正向影響，對(duì)終端產(chǎn)品品質(zhì)的研究主要集中于面包烘焙品質(zhì)，饅頭、面條研究比較缺乏[19-20]，而餃子、餅干未見相關(guān)報(bào)道。

目前，四川優(yōu)質(zhì)小麥品種缺乏，發(fā)掘優(yōu)良育種基因仍是四川小麥品質(zhì)育種的重要基礎(chǔ)工作[21-22]。但目前尚不清楚在四川寡日照、多陰雨等特殊生態(tài)條件下，5+10 和2+12 亞基在小麥品質(zhì)育種上的利用價(jià)值。本研究創(chuàng)制了HMW-GS 近等基因系蜀麥1764A 和蜀麥1764B，其Glu-A1和Glu-B1位點(diǎn)亞基類型為1和20，Glu-D1位點(diǎn)分別為5+10和2+12，代表了四川省絕大多數(shù)小麥品種（系）Glu-D1位點(diǎn)的類型[3]。進(jìn)一步，評(píng)價(jià)了二者在四川省多點(diǎn)試驗(yàn)和區(qū)域試驗(yàn)中的綜合農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量、品質(zhì)參數(shù)和終產(chǎn)品品質(zhì)，為四川寡日照生態(tài)條件下小麥加工品質(zhì)改良提供了參考。

1 材料和方法

1.1 研究材料

新品系蜀麥1764 來(lái)自雜交組合Syn-SAU-43/030080//N07-361/3/川麥42（圖1），其中Syn-SAU-43 為人工合成六倍體小麥，其他為四川小麥品種（系）。Syn-SAU-43 來(lái)自于栽培二粒小麥PI113961與節(jié)節(jié)麥AS2404 遠(yuǎn)緣雜種的染色體自動(dòng)加倍[23]。中國(guó)春（chinese spring，CS）用作高分子量谷蛋白亞基分析的對(duì)照材料。

圖1 蜀麥1764選育過(guò)程Figure 1 Breeding process of Shumai 1764

1.2 研究方法

1.2.1 SDS-PAGE檢測(cè)

利用SDS-PAGE 在蜀麥1764（F7代）的混收種子中檢測(cè)HMW-GS 剩余變異。SDS-PAGE 檢測(cè)參考鄭柯等[24]的方法。

1.2.2 SNP芯片檢測(cè)

55K SNP 芯片檢測(cè)委托中玉金標(biāo)記(北京)生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行，數(shù)據(jù)處理參考Hao M.等[25]的方法，用Microsoft Excel 365 和Python 3.9 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用R 3.0.4軟件作圖。

1.2.3 農(nóng)藝及品質(zhì)性狀調(diào)查

2018—2019年度，近等基因系蜀麥1764A 和1764B 在四川省5 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行多點(diǎn)品比試驗(yàn)（綿陽(yáng)、郫都區(qū)、廣漢、內(nèi)江、射洪）；2019—2020年度，二者參加了四川省小麥區(qū)域試驗(yàn)，共8 個(gè)試點(diǎn)（綿陽(yáng)、新都、內(nèi)江、射洪、南充、廣元、雙流、樂山），2年共13點(diǎn)次。各試點(diǎn)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、田間管理和調(diào)查規(guī)范按照四川省區(qū)域試驗(yàn)要求進(jìn)行。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，小區(qū)面積13.34 m2。調(diào)查的農(nóng)藝性狀包括產(chǎn)量、全生育期、單株分蘗數(shù)、單株有效穗、株高、有效穗、千粒重、穗粒數(shù)和粒質(zhì)。單株分蘗數(shù)=最高苗/基本苗，單株有效穗=有效穗/基本苗。

品質(zhì)性狀測(cè)試，從各個(gè)試點(diǎn)的3 次重復(fù)中取等量籽粒，分別形成蜀麥1764A和蜀麥1764B的混樣，委托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（哈爾濱）進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試指標(biāo)及測(cè)試方法，包括容重（GB/T 5498-2013）、出粉率（NY/T1094.1-2006）、粗蛋白（干基）（NY/T 3-1982）、降落數(shù)值（GB/T 10361-2008）、濕面筋（14% 水分）（GB/T 5506.2-2008）、沉淀指數(shù)（GB/T 2119-2007）、粉質(zhì)儀指標(biāo)（吸水量、面團(tuán)形成時(shí)間、面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間、弱化度、粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)、評(píng)價(jià)值GB/T14614-2019）、拉伸儀指標(biāo)（最大拉伸阻力、延伸性、能量、R/E比值 GB/T14615-2019）、硬度（GB/T 21304-2007）、面包（GB/T14611-2008）、餃子（LS/T3203-1993）、面條（GB/T17320-2013）、饅頭（GB/T17320-2013）、酥性餅干（LS/T3206-1993）總評(píng)分及分項(xiàng)評(píng)分。計(jì)算蜀麥1764A高于或低于1764B的百分比。

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析用Microsoft Excel 365 和DPS 7.55完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 近等基因系創(chuàng)制與鑒定

2016年秋播前，隨機(jī)選取蜀麥1764 的F7代種子，通過(guò)SDS-PAGE 進(jìn)行HMW-GS 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)由3 種HMW-GS 亞基組成，分別為A 型（1、20、5+10）、B 型（1、20、2+12）和H 型，H 型為A 型和B 型的雜合（1、20、2+12/5+10）。在分析的384 粒種子中，篩選出雜合種子共3粒，雜合種子的頻率為0.86%。3種類型的單株收獲后，分別隨機(jī)檢測(cè)90 粒種子，發(fā)現(xiàn)A、B兩種類型的HMW-GS組成不分離。但是，H型仍能分離出A 型、B 型和H 型（圖2），將分離出的A 型和B 型植株分別擴(kuò)繁成系，命名為蜀麥1764A（含5+10亞基）和蜀麥1764B（含2+12亞基）。

圖2 蜀麥1764 Glu-D1位點(diǎn)雜合型單株后代HMW-GS分離情況Figure 2 HMW-GS isolation from a heterozygous single plant at Glu-D1 locus of Shumai 1764

SNP 數(shù)據(jù)用于近等基因系蜀麥1764A 和蜀麥1764B的遺傳背景分析。結(jié)果表明，99.82%（37878/37947）的標(biāo)記在蜀麥1764A和1764B間的分型結(jié)果一致，說(shuō)明二者遺傳背景高度一致。分型結(jié)果不一致的69 個(gè)位點(diǎn)中，有58 個(gè)位點(diǎn)集中于1D 染色體403-414 MB 區(qū)間（圖3），表明二者的差異主要在該區(qū)間。根據(jù)中國(guó)春參考基因組序列IWGSC_Ref-Seq_v1注釋，Glu-1D位點(diǎn)位于1D染色體412-413 MB之間。由此從遺傳上證明了蜀麥1764A 和蜀麥1764B為Glu-1D位點(diǎn)有差異的近等基因系。

圖3 蜀麥1764A和1764B基因組差異對(duì)比Figure 3 The genomic differences between Shumai 1764A and 1764B

農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量方面。2018—2019年度的多點(diǎn)品比試驗(yàn)和2019—2020年度的四川省區(qū)域試驗(yàn)中，二者在所有農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量上無(wú)顯著差異（圖4，表1）。這表明，源自1D 染色體的403～414 MB 區(qū)間差異，對(duì)農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量影響小。從四川省小麥區(qū)域試驗(yàn)資料可知，近等基因系蜀麥1764A和蜀麥1764B綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)良，比區(qū)域試驗(yàn)對(duì)照品種綿麥367分別增產(chǎn)2.2%和1.9%，千粒重分別增加了15.5%和17.5%，有效穗分別增加了26.2%和7.4%，但穗粒數(shù)比對(duì)照分別降低了13.1%和16.6%，二者均屬穗數(shù)型品系。

表1 蜀麥1764A和1764B 2年多點(diǎn)農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Statistical analysis of the agronomic traits of Shumai 1764A and B in two-year multi-point experiment

圖4 蜀麥1764A(左)和蜀麥1764B(右)單株Figure 4 Single plants of Shumai 1764A (left) and Shumai 1764B (right)

2.2 品質(zhì)性狀分析

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（哈爾濱）測(cè)試結(jié)果表明，有的參數(shù)在年度之間變動(dòng)很大，有的參數(shù)年度間表現(xiàn)一致穩(wěn)定（表2）。相比蜀麥1764B，蜀麥1764A 2年均表現(xiàn)較高的品質(zhì)參數(shù)有容重、出粉率、穩(wěn)定時(shí)間、粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)、最大拉伸阻力（Rm,135）、能量、R/E比值(拉伸比)和硬度。其中，有5個(gè)參數(shù)的差異十分明顯，差異大小依次為：①R/E比值(拉伸比)，蜀麥1764A 比1764B 兩年平均高139.3%；② 最大拉伸阻力（Rm,135），蜀麥1764A 比1764B 高123.0%；③ 面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間，蜀麥1764A 比1764B 長(zhǎng)103.5%；④ 能量，蜀麥1764A 比1764B 高97.88%；⑤ 粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)，蜀麥1764A 比1764B 長(zhǎng)45.9%。連續(xù)2年蜀麥1764A均比蜀麥1764B降低的參數(shù)有粗蛋白、吸水量、弱化度和延伸性（E,135）。其中，弱化度的降低最大，其次為延伸性。

表2 蜀麥1764A和1764B 2年試驗(yàn)品質(zhì)參數(shù)比較Table 2 Comparison of quality parameters between Shumai 1764A and B in two-years

終產(chǎn)品品質(zhì)上，2年資料均表明蜀麥1764A 比蜀麥1764B 有更高的面包總評(píng)分和饅頭總評(píng)分，但面條總評(píng)分較低（表3）。餃子和餅干總評(píng)分在年度間高低不一致。進(jìn)一步分析單項(xiàng)評(píng)分發(fā)現(xiàn)，對(duì)于面包，蜀麥1764A的面包體積2年均比蜀麥1764B高，而其余單項(xiàng)年度間高低不一致。對(duì)于饅頭，比容、高度、表面色澤、表面結(jié)構(gòu)、表面形狀、芯結(jié)構(gòu)和黏性的2年平均數(shù)均是1764A 更高，而重量和體積則是1764B更高，彈性、韌性和口感二者一致。對(duì)于面條，1764B 的色澤、黏彈性比1764A 更出色，而表觀狀態(tài)、硬度則1764A 較高，光滑性和食味二者均表現(xiàn)一致。

表3 蜀麥1764A和1764B加工產(chǎn)品評(píng)分Table 3 Total and itemized score of end-use products of Shumai 1764A and B

3 討論

HMW-GS近等基因系的培育方法上，目前報(bào)道的多是回交法獲得[12-15]。該方法通過(guò)輪回親本和供體親本雜交、回交，后代通過(guò)分子標(biāo)記或SDS-PAGE檢測(cè)，從而創(chuàng)制基于輪回親本遺傳背景的HMW-GS近等基因系。該方法創(chuàng)制的近等基因系，其綜合農(nóng)藝性狀類似于輪回親本。本研究則利用高世代株系的剩余雜合體篩選創(chuàng)制HMW-GS近等基因系，從F7代品系中篩查剩余雜合變異，獲得了HMW-GS近等基因系蜀麥1764A 和1764B。這2 個(gè)系主要的遺傳差異在于包含HMW-GS 位點(diǎn)的1D 染色體403～414 MB 區(qū)間。2年田間農(nóng)藝性狀分析未發(fā)現(xiàn)二者有顯著差異，因此盡可能地排除了遺傳背景對(duì)品質(zhì)分析帶來(lái)的影響。對(duì)于易受環(huán)境和遺傳背景影響的復(fù)雜性狀和數(shù)量性狀，這樣的近等基因系是遺傳研究的理想材料[26-28]。在作物遺傳育種實(shí)踐中，可以通過(guò)篩查剩余雜合體的方法創(chuàng)制不同的近等基因系，將特色品種選育和遺傳研究緊密結(jié)合起來(lái)。

由于歐美小麥的終產(chǎn)品以面包為主，因此西方學(xué)者對(duì)HMW-GS 的評(píng)價(jià)主要是針對(duì)面包的烘烤品質(zhì)，并據(jù)此提出了HMW-GS 的優(yōu)質(zhì)亞基和劣質(zhì)亞基[8-10]。大多數(shù)報(bào)道認(rèn)為5+10亞基的面包加工品質(zhì)優(yōu)于2+12[8-11,14-18]，但也有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)某些遺傳背景下二者差異不顯著[14-17,19]或2+12 更優(yōu)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)亞基5+10 的面包體積和總評(píng)分均大于2+12，和國(guó)內(nèi)外多數(shù)學(xué)者研究結(jié)果一致。本研究表明5+10 亞基在四川“陰雨多、寡日照”特殊氣候條件下，仍然對(duì)面包加工品質(zhì)有促進(jìn)作用。從具體參數(shù)看，HMW-GS 對(duì)面團(tuán)品質(zhì)的差異主要體現(xiàn)在面筋強(qiáng)度上。與2+12相比，5+10亞基的R/E比值(拉伸比)、最大拉伸阻力（Rm，135）分別增加了139.3%、123.0%（表2），表明具有5+10亞基的面團(tuán)彈性好、韌性大、筋力強(qiáng)，發(fā)酵時(shí)面團(tuán)膨脹會(huì)受阻，面團(tuán)更堅(jiān)硬不易形變。這與面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間表現(xiàn)一致，5+10亞基的穩(wěn)定時(shí)間較2+12 延長(zhǎng)約1 倍，說(shuō)明面團(tuán)穩(wěn)定性好，反映5+10對(duì)剪切力降解有較強(qiáng)的抵抗力，也就意味著其麥谷蛋白的二硫鍵更牢固，面粉筋力越強(qiáng)。能量方面，5+10 比2+12 亞基高約1 倍，表示拉伸過(guò)程中所做的功越多，面筋筋力越強(qiáng)。有研究表明，5亞基比2 亞基多一個(gè)半胱氨酸，可增加面團(tuán)中二硫鍵數(shù)量，對(duì)蛋白質(zhì)2級(jí)結(jié)構(gòu)影響顯著，能增強(qiáng)亞基間交聯(lián)度，有利于谷蛋白大聚合體（glutenin macropolymer，GMP)聚合以形成更為致密的面筋網(wǎng)絡(luò)，從而改善了面團(tuán)品質(zhì)[29]。

我國(guó)傳統(tǒng)蒸煮食品的加工品質(zhì)與蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量、淀粉品質(zhì)和磨粉品質(zhì)等均有關(guān)聯(lián)[30]。在我國(guó)傳統(tǒng)食品加工品質(zhì)上，對(duì)HMW-GS的優(yōu)劣評(píng)價(jià)不能簡(jiǎn)單借用面包標(biāo)準(zhǔn)，須專門研究HMW-GS對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)小麥?zhǔn)称菲焚|(zhì)的影響，為專用型小麥品種的選育和應(yīng)用提供依據(jù)。金慧等[21]研究表明，5+10/2+12亞基的差異僅體現(xiàn)在饅頭表面色澤上；鄧志英等[31]認(rèn)為，饅頭品質(zhì)對(duì)HMW-GS 的類型要求不嚴(yán)格，主要受單個(gè)HMW-GS表達(dá)量的影響。本研究發(fā)現(xiàn)5+10比2+12亞基的饅頭評(píng)分有少量增加。但對(duì)于面條，本研究發(fā)現(xiàn)2+12 亞基組合的評(píng)分高于5+10 組合。方正武等[32]研究發(fā)現(xiàn)5+10 亞基顯著提高了面條質(zhì)構(gòu)參數(shù)中的硬度，但一些背景下5+10亞基會(huì)使面條偏硬，其效果不如2+12 亞基。在四川盆地，面條小麥可優(yōu)先考慮2+12 亞基組合。具體到品質(zhì)參數(shù)，2年間2+12 比5+10 的延伸性(E，135)更大，說(shuō)明在發(fā)酵過(guò)程中面團(tuán)的面筋網(wǎng)絡(luò)形成狀態(tài)好、不易破裂。前人認(rèn)為5+10亞基與2+12亞基對(duì)延伸性和拉伸阻力的影響存在負(fù)相關(guān)[33-34]，在本研究中2+12 的延伸性更好，而5+10 的拉伸阻力更大，印證了前人的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)餃子和餅干總評(píng)分在年度間高低不一致，無(wú)法評(píng)估5+10和2+12亞基對(duì)這2種加工產(chǎn)品的影響。

4 結(jié)論

在小麥高代育種群體中篩選剩余雜合體，創(chuàng)制了HMW-GS 的5+10/2+12 近等基因系。在四川生態(tài)條件下，5+10/2+12 亞基對(duì)小麥籽粒蛋白質(zhì)含量沒有顯著影響，但是前者提高了面筋強(qiáng)度、降低了延伸性。對(duì)于面包、饅頭品質(zhì)，5+10 亞基優(yōu)于2+12亞基，但對(duì)于面條品質(zhì)，2+12 亞基優(yōu)于5+10 亞基。5+10/2+12 亞基可能不影響餃子和餅干的加工品質(zhì)。