李 陽，郭曉江，唐華蘋，雷越堃，張連全1，，劉登才1，，王際睿1，，魏育明1，，鄭有良1，，蒲至恩*

（1.西南作物基因資源發(fā)掘與利用國家重點實驗室，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學小麥研究所，成都 611130；4.成都市鵑農(nóng)智慧農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，成都 611730）

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最基本的生產(chǎn)資料，種子活力是評價種子品質(zhì)的一項重要指標。高活力種子可以提高作物的出苗率、出苗速度和幼苗健壯度，影響田間成苗率、生長狀況和最終產(chǎn)量，增強種子的耐儲性、不良播種條件的耐性和病蟲草害的抵抗能力，為作物的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)打下良好的基礎(chǔ)[1]。種子活力是多基因控制的數(shù)量性狀[2-4]，同時受種子結(jié)構(gòu)、收獲期、貯藏期及環(huán)境[5-7]等因素的影響。隨著種子的逐漸成熟，種子活力逐漸升高，真正成熟時達到頂峰，隨之進入逐漸衰老的不可逆過程，這一過程產(chǎn)生的綜合效應(yīng)被稱為老化(aging)[8]。在老化的過程中，種子活力逐漸下降，從而影響田間幼苗形態(tài)建成，最終影響產(chǎn)量。

前人針對作物種子活力和種子貯藏過程中的種子生理進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)種子在儲藏過程中內(nèi)部會發(fā)生一系列的復雜的生理變化[9-11]，包括蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)受到損害，蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生降解等。研究種子活力與蛋白質(zhì)的關(guān)系對于利用蛋白質(zhì)標記檢測種子活力、監(jiān)測種子發(fā)育具有重要意義[12]?？字斡械萚13]研究了人工加速老化對小麥種子可溶性蛋白含量存在影響；胥鵬宇等[14]揭示了不同老化條件下水稻種子的部分胚蛋白的表達與種子的快速老化相關(guān)；孔令琪[15]研究表明不同含水量的燕麥種子老化后蛋白含量下調(diào)；劉美惠[16]采用蛋白質(zhì)組學和分子生物學方法探究古代蓮子老化的分子機理，但對于種子活力下降過程中具體蛋白質(zhì)變化還有待深入，同時對種子活力的遺傳研究還需要進一步深入研究。

種子活力具有明顯的基因型差異[17]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)人工合成小麥的種子活力表現(xiàn)優(yōu)異。人工合成小麥是小麥遺傳改良和增加環(huán)境適應(yīng)性的有效基因資源[18]，研究表明，人工合成小麥在產(chǎn)量相關(guān)的重要性狀上具有更豐富的多樣性、具有耐生物/非生物脅迫等特性[19-22]。為了將來自四倍體小麥（T.turgidum）與節(jié)節(jié)麥（Ae.tauschii）的有利基因能夠在六倍體遺傳背景下正常表達，一些來源于節(jié)節(jié)麥的D 族優(yōu)異基因通過人工合成小麥被導入到普通小麥，增加普通小麥的環(huán)境適應(yīng)性。但有關(guān)人工合成小麥種子活力這一與小麥產(chǎn)量息息相關(guān)的性狀的遺傳研究相對較少。

我國稻麥輪作面積常年在467 萬hm2以上，主要分布于長江流域，包括四川、江蘇和安徽等省，水稻收獲后耕層土壤緊實，透氣性差，出苗環(huán)境較差，而高活力種子具有出苗整齊度高、幼苗生長潛勢好、植株抗逆能力強的特點，有利于幼苗形態(tài)建成，是保證小麥高產(chǎn)的第一步。結(jié)合我們前期對人工合成小麥活力的研究結(jié)果，為了進一步明晰種子活力較高的機理，以人工合成小麥為親本構(gòu)建重組自交系（RIL）群體進行種子活力相關(guān)性狀定位。

本試驗對人工合成小麥RIL群體收獲后新收獲種子、人工加速老化、自然老化1年和5年的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢進行測定，利用Wheat 660K SNP 芯片標記構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜，分析影響種子活力的QTL 位點和候選基因，同時對RIL 群體小麥老化種子的活力變化與貯藏蛋白醇溶蛋白和麥谷蛋白亞基組成及其含量變化關(guān)系進行驗證，探究老化后高低活力品系間貯藏蛋白變化的差異。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗以132 份“SHW-L1×川麥32”RIL 群體(F9)為材料，其中SHW-L1(AABBDD,2n=42是利用節(jié)節(jié)麥AS60 (Ae.tauschiissp.tauschii,DD,2n=14)與圓錐小麥AS2255 (T.turgidumssp.turgidum,AABB,2n=28)雜交后，F(xiàn)1(ABD)經(jīng)秋水仙堿染色體加倍處理所得[23]，將RIL群體（F9)于2017年、2021年和2022年種植于四川農(nóng)業(yè)大學崇州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地，材料收獲晾干后保存于干燥低溫密閉的種子桶內(nèi)。

1.2 試驗方法

1.2.1 人工加速老化試驗

參照國際種子檢驗規(guī)程高溫高濕（40 ℃，99%RH）法[24]進行老化試驗，老化結(jié)束后，取出種子在室溫下風干至原始水分狀態(tài)。

1.2.2 發(fā)芽試驗

對新收獲種子和3 種不同老化處理（自然老化1年、5年和人工加速老化）的種子按照國際種子檢驗規(guī)程進行發(fā)芽試驗[24]，發(fā)芽試驗結(jié)束后，第4天統(tǒng)計發(fā)芽勢(GP)，第7天統(tǒng)計發(fā)芽率(GR)，分別計算種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢。

發(fā)芽勢/%=4天內(nèi)發(fā)芽種子粒數(shù)/50×100

發(fā)芽率/%=7天內(nèi)發(fā)芽種子粒數(shù)/50×100

1.2.3 遺傳圖譜

利用已構(gòu)建好的RIL 群體的遺傳圖譜，共計7 218個Wheat660K標記，圖譜平均密度為0.148 cM[23]，進行QTL位點分析。

1.2.4 谷、醇溶蛋白提取

選取老化前后發(fā)芽率變化差異顯著的極端材料進行谷蛋白、醇溶蛋白分析。參照張玲麗等[25]的方法對高分子量麥谷蛋白提取，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）方法測定。參考B.A.Marchylo[26]和Yan Y.[27]描述的方法提取醇溶蛋白，使用RP-HPLC 試驗方法對其進行分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和QTL定位

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用Microsoft Excel 2019和SPSS軟件。利用軟件QTL IciMapping 4.2（Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing,China）采用完備區(qū)間作圖法(Inclusive Composite Interval Mapping，ICIM) 對發(fā)芽率進行QTL 檢測，測得小麥RIL 發(fā)芽率的加性QTL 和上位性QTL。LOD 值為1 000 次排列測驗的臨界值，用LOD>2.50作為QTL閾值。

1.2.6 候選基因篩選

將檢測到的主效QTL 置信區(qū)間對應(yīng)的中國春基因組(Chinese Spring IWGSC v1.0)區(qū)間已知基因調(diào)出，進行候選基因的篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體發(fā)芽勢和發(fā)芽率

對新收獲、人工加速老化、自然老化1年和5年的種子發(fā)芽率進行表型分析(表1)，除自然老化1年的材料外，RIL群體親本SHW-L1的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均顯著高于川麥32。人工老化后和儲存5年群體的變異系數(shù)高于當年收獲和儲藏1年的種子；人工老化后種子發(fā)芽率與儲存5年種子的發(fā)芽率相當。不同自交系人工加速老化后的種子間表現(xiàn)出巨大的差異，發(fā)芽率極差達到84%（圖1)，部分自交系種子全部失去活力（如RIL42），部分自交系仍有旺盛的生命力(如RIL102)，可以在群體中選擇到高活力植株。

圖1 材料RIL42、RIL102老化后發(fā)芽表現(xiàn)Figure 1 The Germination performance of RIL42 and RIL102 after artificial aging

表1 小麥親本及 RIL群體的發(fā)芽勢、發(fā)芽率表型分析Table 1 Phenotypic analysis for artificial aging and germination rate of the parents and RIL population

新收獲、人工加速老化、自然老化1年和5年的種子進行發(fā)芽勢和發(fā)芽率的統(tǒng)計分析（圖2）。結(jié)果表明，自然老化1年的種子與新收獲種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率偏度統(tǒng)計均小于-1（表2），呈偏態(tài)分布，93%的材料發(fā)芽率達到90%以上。人工老化與自然老化5年的種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率顯著降低，偏度統(tǒng)計趨近于0，接近正態(tài)分布。說明盡管收獲時的發(fā)芽品質(zhì)一致，但種子發(fā)芽率隨著貯藏時間和環(huán)境的變化而變化，由于基因型的差異，導致后續(xù)不同自交系種子活力表現(xiàn)差異。

圖2 保存1年、5年、新收獲和人工老化種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的平均值表現(xiàn)Figure 2 The average performance of the germination potential and germination rate of newly harvested and artificially aged seeds stored for 1 year and 5 years

對不同老化程度種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢進行方差分析(表3)，種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率差異都達到極顯著水平。無論是發(fā)芽勢和發(fā)芽率群體基因型間均在0.01%水平表現(xiàn)顯著差異，證實了種子自然衰老和加速老化的速率與基因型是密切相關(guān)的。

表3 發(fā)芽勢和發(fā)芽率的方差分析結(jié)果Table3 Variance analysis of seed artificial aging and germination rate

2.2 連鎖圖譜及QTL定位結(jié)果

根據(jù)構(gòu)建的圖譜，利用完備區(qū)間作圖法對當年新收獲的種子與3 種不同老化處理的種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率進行QTL分析，在新收獲的種子發(fā)芽試驗上未檢測到QTL，老化處理下共檢測到4 個發(fā)芽勢QTL，分布在3B 和7D 染色體上，6 個發(fā)芽率QTL 分布在1B、2D、3A、3B 和7D 染色體上，單一 QTL 可解釋表型變異的2.07%～7.84% (表4)。

表4 重組自交系種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率的QTL分析Table 4 Summary of QTLs for artificial aging and germination rate

2.2.1 自然老化1年種子QTL定位

在7D 染色體上定位到2 個影響自然老化1年種子發(fā)芽的QTL。QGpy.sicau-7D-1、QGpy.sicau-7D-2分別位于標記 AX-95224541-AX-110397334、AX-108787526-AX-110534854 區(qū)間。表型貢獻率最高的為7D 染色體上QGpy.sicau-7D-1座位，可解釋表型變異5.25%，具有提高發(fā)芽率的效應(yīng)，增效等位基因來自SHW-L1（表4）。

2.2.2 自然老化5年種子QTL定位

在3B染色體上定位到1個影響自然老化5年種子發(fā)芽的QTL，QGrf.sicau-3B、QGpf.sicau-3B為同一座位，位于標記AX-109072467-AX-95185927 區(qū)間。表型貢獻率為7.23%～7.53%，具有提高發(fā)芽率的效應(yīng)，增效等位基因來自SHW-L1（表4）。不同自然老化處理的材料未定位到一致的QTL，說明在種子貯藏過程中QTL是動態(tài)變化的。

2.2.3 人工加速老化種子QTL定位

在1B、2D、3A和7D染色體上定位到6個影響加速老化種子發(fā)芽勢的QTL。QGra.sicau-7D-1、QGra.sicau-7D-2、QGra.sicau-7D-3、QGra.sicau-1B、QGra.sicau-2D、QGra.sicau-3A，分別位于標記AX-109583841-AX-110916832、 AX-95224541-AX-110397334、AX-108787526-AX-110534854、AX-109881506-AX-108833976、 AX-95120131-AX-110540289、AX-86179525-AX-95230967區(qū)間，表型貢獻率最高的為2D 染色體上的QGPa.sicau-2D座位，可解釋表型變異7.84%，具有降低發(fā)芽率的效應(yīng)，增效等位基因來自川麥32（表4）。

人工老化與自然老化1年條件定位到一致的QTL 位點，位于7D（QGpy.sicau-7D-1和QGra.sicau-7D-1、QGpy.sicau-7D-2和QGra.sicau-7D-3）染色體，為人工老化與自然老化共同QTL。

2.2.4 候選基因篩選

對貢獻率最高的QTLs 進行生物信息學分析，將QTL置信區(qū)間與中國春基因組序列比對，從自然老化5年定位區(qū)間篩選出102 個注釋基因，人工老化定位區(qū)間篩選出122 個注釋基因，自然老化1年與人工老化共定位區(qū)間篩選出189個注釋基因。同源比對后，自然老化5年條件下發(fā)現(xiàn)9個候選基因，人工老化條件下發(fā)現(xiàn)5 個候選基因，自然老化1年與人工老化共同發(fā)現(xiàn)13個候選基因（表5）。

表5 各條件下主效QTL區(qū)間候選基因Table 5 Candidate genes of major QTL interval under various conditions

人工老化條件下的候選基因TraesCS2D02G184 800為NADPH 依賴性7-氰基-7-脫氮鳥嘌呤還原酶，TraesCS2D02G185600為二氫黃酮醇-4-還原酶，2 個基因均與NADP 相關(guān)，催化酶的活性并響應(yīng)逆境脅迫，均在根部高表達（圖3）。自然老化條件下的候選基因TraesCS3B02G278000為B3 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子、TraesCS3B02G277200為Ras 類蛋白，均在胚中特異表達，主要調(diào)控植物的生長發(fā)育以及響應(yīng)多種逆境脅迫；TraesCS3B02G278200為胞苷脫氨酶，在籽粒中特異表達，其對DNA復制和損傷修復過程至關(guān)重要。自然老化與人工老化共定位基因TraesCS7D 02G194400為F-box 蛋白，在籽粒中特異表達，其在延緩植物衰老、響應(yīng)逆境脅迫中具有重要作用；TraesCS7D02G197500為CDP-二?；视?-甘油-3-磷酸3-磷脂酰轉(zhuǎn)移酶，在根中特異表達，其在植物生長、發(fā)育和逆境脅迫反應(yīng)方面有著重要的作用；TraesCS7D02G169200為轉(zhuǎn)錄延伸因子SPT5，在胚乳中特異表達，主要是植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和組蛋白甲基化的調(diào)控因子。

2.3 對老化后發(fā)芽勢和發(fā)芽率顯著降低的材料進行麥谷蛋白和醇溶蛋白分析

根據(jù)老化前后種子發(fā)芽率的變化，選取了差異最大的8 份材料（RIL49、RIL64、RIL76、RIL78、RIL80、RIL102、RIL160、RIL177），進行了麥谷蛋白(圖4)和醇溶蛋白分析（表6），其中RIL49、RIL80、RIL102 為高活力材料（老化后平均發(fā)芽率：89.06%），RIL64、RIL76、RIL78、RIL160、RIL177（老化后平均發(fā)芽率：29.77%）為低活力材料。從谷蛋白的結(jié)果來看，材料RIL76、RIL78、RIL80 的大分子量譜帶在老化狀態(tài)下出現(xiàn)了降解，小分子譜帶消失的現(xiàn)象。供試材料谷蛋白的含量也有所下降，其蛋白條帶的亮度和粗度都較當年收獲和儲藏一年的材料低。

圖4 不同處理小麥種子HWM-麥谷蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Figure 4 SDS-PAGE electrophoresis pattern of wheat seeds under different treatments

表6 不同處理下不同小麥品種醇溶蛋白含量與出峰時間方差分析Table 6 Analysis of variance between gliadin content and peak time in different wheat varieties under different treatments

在不同品種間和不同處理間醇溶蛋白的出峰時間與醇溶蛋白含量均呈顯著差異（表6），但低活力材料（如RIL76）人工老化后ω-醇溶蛋白和α/β-醇溶蛋白含量差異不顯著，出峰時間差異不顯著，而高活力材料（如RIL102）ω-醇溶蛋白和α/β-醇溶蛋白含量減少，γ-醇溶蛋白增多，出峰時間變早?？梢钥闯霾煌牧系拇既艿鞍鬃兓槐M相同，高活力的醇溶蛋白降解更快（RIL49、RIL102），低活力的降解慢（RIL76、RIL78）。

3 討論

3.1 種子發(fā)芽相關(guān)QTL的檢測

種子可以在干燥狀態(tài)下保存較長時間[28]，但隨時間的推移，種子的生活力會慢慢消失，主要是由于染色體畸變[29]、自由基產(chǎn)生[30]、脂肪酶活性高[31]等諸多原因引起的。在水稻、擬南芥、白菜、番茄、大麥及高粱[32-39]等作物中，對發(fā)芽率的QTL定位多有報道。但小麥的報道相對較少。關(guān)望輝[40]創(chuàng)建導入系（IL）群體對小麥種子活力相關(guān)性狀進行了QTL定位，定位到7個加性QTLs分別位于1D、4D染色體。

本研究共檢測到控制小麥發(fā)芽的QTL 位點10個，分別位于1B、2D、3A、3B、7D 染色體上，貢獻率在2.07%～7.84%，不同老化處理下的主效QTLs分別位于7D（QGpy.sicau-7D-1）、3B(QGrf.sicau-3B）、2D（QGpa.sicau-2D）染色體，其中QGrf.sicau-3B和QGpa.sicau-2D在前人[42]報道中均有相近位點，推測可能為同一位點，另一方面，本研究中自然老化1年與人工老化條件下定位到一致的QTL位點，位于7D染色體，未見前人報道，推測可能為新發(fā)現(xiàn)的位點，后續(xù)將對其進行精細定位。在不同自然老化處理下并未定位到一致QTL 位點，表明不同年份間的QTL 是動態(tài)變化的，與前人［43］研究結(jié)果一致，這也與種子衰老過程中不同階段發(fā)生的生理生化變化不同相吻合。

3.2 候選基因的篩選

種子衰老過程會經(jīng)歷一系列復雜的生理變化，人們希望通過挖掘種子活力相關(guān)基因并解析其遺傳調(diào)控機制，對選育高活力的作物品種具有重要意義。在水稻、玉米、擬南芥[44-46]種子活力的相關(guān)基因報道中基因注釋主要與糖基的消耗、轉(zhuǎn)移、GTP 結(jié)合、跨膜蛋白、金屬離子結(jié)合等相關(guān)。M.Hayashi[47]對YK1轉(zhuǎn)基因水稻植株進行代謝和生化分析，發(fā)現(xiàn)二氫黃酮醇還原酶(DFR)與下游NADP(H)酶基因協(xié)同作用，使水稻對氧化和細菌病害引起的細胞死亡的耐受力升高。Yang T.等[48]對玉米B3 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子Zmabi19進行研究，結(jié)果顯示Zmabi19基因影響玉米醇溶蛋白、淀粉和脂質(zhì)的積累、胚乳的營養(yǎng)庫活性、淀粉和蔗糖代謝。T.Tsutsui 等[49]在擬南芥中ARA6（RAS 家族相關(guān)基因）突變體中發(fā)現(xiàn)，ARA6通過影響Qua-Quine Starch (QQS)基因維持淀粉和糖的穩(wěn)態(tài)。Xue M.D.等[50]研究發(fā)現(xiàn)在高溫環(huán)境下擬南芥中NO80-C 和轉(zhuǎn)錄延伸因子在H2AZ 去除中的協(xié)同作用，誘導植株熱形態(tài)形成，提高植物對高溫適應(yīng)性。結(jié)合候選基因在其他作物中表現(xiàn)出的非生物逆境抗性，本研究未來將繼續(xù)對篩選到的候選基因進行深入研究。

本研究中對自然老化和人工老化條件下的QTLs 區(qū)間的注釋基因進行同源比對，共發(fā)現(xiàn)27 個候選基因，基因功能主要集中于能量代謝過程、催化活性通路、GTP 結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導過程和植物的抗逆響應(yīng)等。研究表明不論是自然老化還是人工老化，種子都呈現(xiàn)出一致的生理生化變化，即種子細胞完全死亡之前，會依次發(fā)生膜系統(tǒng)受損，酶活性下降，高能量化合物合成速度下降，蛋白質(zhì)及RNA合成速率下降，萌發(fā)及生長緩慢，抗逆境能力下降等反應(yīng)[51]，候選基因篩選結(jié)果也與此過程一致。

3.3 老化后種子的蛋白變化

在萌發(fā)過程中，蛋白質(zhì)儲存液泡中合成的蛋白酶的水解活性引發(fā)了儲存蛋白質(zhì)的分解，從而獲得氨基酸，因此貯藏蛋白對種子的萌發(fā)和早期生長有重要作用[52-54]。張自陽等[55]表示種子活力的喪失與蛋白的消失和新增加的蛋白質(zhì)有關(guān)，種子活力在基因水平的差異也是通過蛋白質(zhì)體現(xiàn)出來的，因此研究種子活力與蛋白質(zhì)的關(guān)系對種子活力的研究也有重要意義。

本研究通過對人工加速老化前后發(fā)芽率差異顯著的材料進行麥谷蛋白和醇溶蛋白分析可以看出，其醇溶蛋白和麥谷蛋白含量下降。谷蛋白大分子條帶降解顯著，部分小分子區(qū)含量增加，但高活力種子與低活力種子差異不明顯。高活力材料的醇溶蛋白降解更快，低活力材料則降解慢，醇溶蛋白在γ 區(qū)蛋白含量升高，與前人[56]研究結(jié)果一致?？赡芤驗榉N子老化過程中發(fā)生了一系列的生理化學反應(yīng)，可誘導合成新的酶蛋白，使其蛋白質(zhì)的種類、數(shù)量發(fā)生改變[12]，種子中的貯藏蛋白下降，甚至出現(xiàn)新的蛋白質(zhì)。劉美慧[16]在對蓮子抗老化機制的蛋白組學研究，鑒定出的蛋白質(zhì)進行功能分析發(fā)現(xiàn)表達蛋白質(zhì)主要集中在氧化應(yīng)激反應(yīng)、大分子生物合成、遺傳信息表達和碳水化合物代謝等方面。結(jié)合候選基因功能主要集中在能量代謝過程、催化活性通路、信號轉(zhuǎn)導過程和植物的抗逆方面，預(yù)測消失和出現(xiàn)的新蛋白應(yīng)該與候選基因相關(guān)。

4 結(jié)論

從構(gòu)建的人工合成小麥SHW-L1×川麥32RIL群體中檢測出10 個發(fā)芽相關(guān)QTLs，不同老化處理的主效QTL（QGpy.sicau-7D-1、QGrf.sicau-3B、QGpa.sicau-2D）分別定位于7D、3B、2D 染色體，不同的自然老化年份間QTL為動態(tài)變化的，人工老化與自然老化共定位到位于7D 染色體位點，是新發(fā)現(xiàn)的種子發(fā)芽相關(guān)QTL，其中提高種子活力的增效位點來源于人工合成小麥。候選基因篩選主要參與種子發(fā)育、萌發(fā)及響應(yīng)逆境的信號轉(zhuǎn)導途徑，后續(xù)將對候選基因進行相關(guān)功能驗證并深入挖掘；人工加速老化與自然老化1年條件下，發(fā)現(xiàn)染色體一致的QTL位點7D（QGpy.sicau-7D-1和QGra.sicau-7D-1、QGpy.sicau-7D-2和QGra.sicau-7D-3），后續(xù)將對此進行精細定位及相關(guān)分析，為進一步人工合成小麥提高種子活力提供了依據(jù)。