張成才 ，寧 蓉 ，陳 娜 ，彭藝晨 ，周 麗 ，楊晰宸 ，盧靜怡 ，張彭躍 ，李 蕊

（1）云南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500;2）昆明市第二人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650032）

腦卒中是一種由于腦出血或腦梗塞導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損的急性腦血管病，其中缺血性腦卒中約占總腦卒中的四分之三以上[1]。缺血性腦卒中發(fā)生后會觸發(fā)一系列的神經(jīng)功能障礙，包括炎癥反應(yīng)、能量衰竭、興奮毒性以及神經(jīng)細胞的凋亡、自噬及壞死等[2]，是導(dǎo)致殘疾和死亡的主要原因，給患者、家庭、社會帶來了沉重的負擔(dān)。因此，找到促進腦卒中后神經(jīng)修復(fù)的方法至關(guān)重要。正中神經(jīng)電刺激（median nerve electrical stimulation，MNES）是一種具有廣泛應(yīng)用前景的神經(jīng)調(diào)制技術(shù)[3]，正中神經(jīng)被認為是聯(lián)系中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外周門戶，作用于正中神經(jīng)上的電刺激可沿著上行傳導(dǎo)通路誘發(fā)脊髓和大腦皮層的神經(jīng)可塑性，從而影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重塑和功能修復(fù)[4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，MNES 治療過程中腦雙側(cè)前額氧合血紅蛋白濃度升高，該部位神經(jīng)活動發(fā)生變化，最終改善腦卒中后患者的認知功能[5]，但其作用機制仍尚不明確，且在治療劑量、頻率、療程的選擇上仍缺少臨床指南，尚無確切最佳的電刺激治療處方規(guī)范。因此，本研究通過動物實驗探討正中神經(jīng)電刺激治療對腦卒中的作用機制，為臨床上正中神經(jīng)電刺激的優(yōu)化和推廣以及缺血性腦卒中的防治提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

由湖南斯萊克實驗動物有限公司[SCXK（湘）2019-0004]提供的健康雄性SD 大鼠，體重（250±20）g，于云南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[SYXK（滇）K2022-0004]適應(yīng)性喂養(yǎng)，本研究通過昆明市第二人民醫(yī)院倫理委員會2021（06）號批準，所有實驗操作步驟都嚴格按照動物倫理和相關(guān)實驗動物的實驗要求規(guī)范執(zhí)行。將SD 大鼠隨機分成造模組和假手術(shù)組（Sham），在造模24 h 后對腦缺血大鼠進行神經(jīng)行為學(xué)評分，剔除死亡及不合格者，然后將造模成功的大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分成中動脈閉塞模型組（middle cerebral artery occlusion，MCAO）和正中神經(jīng)電刺激干預(yù)組（median nerve electrical stimulation，MNES），每組各6 只。

1.2 主要試劑耗材

異氟烷：瑞沃德生命科技有限公司（中國深圳）；線栓：西濃科技有限公司（中國北京）；抗體：艾博抗（Abcam）貿(mào)易有限公司（中國上海），BDNF：ab108319，TrkB：187041，synI：ab254349，PSD95：ab238315。

1.3 主要儀器

外周神經(jīng)電刺激儀（SY-708A，中國江蘇）；氣體麻醉機：眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司（中國北京）；轉(zhuǎn)棒疲勞儀：移數(shù)信息科技有限公司（中國上海）；高速冷凍離心機：Hettich 公司（德國）；電泳儀：BIO-RAD；全自動研磨儀：賽維爾生物科技有限公司（中國武漢）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：勤翔科學(xué)儀器有限公司（中國上海）；冷凍切片機：賽默飛世爾儀器有限公司（中國上海）。

1.4 實驗方法

1.4.1 缺血性腦卒中大鼠模型的建立采用線栓法建立大鼠左側(cè)大腦中動脈腦梗塞模型，假手術(shù)組動物除不插入和拔出線栓，其余各步驟均相同。缺血60 min 后取出線栓，縫合好傷口，置于30℃電熱毯上維持體溫，待大鼠蘇醒后，放回鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)。

1.4.2 干預(yù)方法造模成功后第3 天對 MCAO 大鼠進行損傷側(cè)前肢 MNES 干預(yù)。異氟烷氣體麻醉大鼠，使用外周神經(jīng)電刺激儀（SY-708A，中國，江蘇）在前肢距腕關(guān)節(jié)上5 mm 處兩肌腱之間，以45°傾斜角度插入一根毫針，插入深度為 1 mm，接入電極見圖1。刺激參數(shù)為：刺激參數(shù)為：0.6 mA，5 min；1 mA，10 min；1.5 mA，5 min；總刺激時間為 20 min，隔天干預(yù)，連續(xù) 7 次。干預(yù)結(jié)束后消毒并放入飼養(yǎng)籠中。MCAO 組在相同位置插入刺激針，但不予與電流，其余操作同干預(yù)組。Sham 組不作任何處理。

圖1 大鼠腦卒中后正中神經(jīng)電刺激示意圖Fig.1 Median nerve electrical stimulation after stroke in rats

1.5 檢測指標

1.5.1 HE 染色干預(yù)結(jié)束后取干預(yù)側(cè)和假手術(shù)組右側(cè)正中神經(jīng)，固定于4%多聚甲醛，OCT 包埋，冰凍切片（10 μm），用蘇木精-伊紅染色法進行染色，置于顯微鏡下觀察病理變化。

1.5.2 神經(jīng)功能缺損評分（neurological severity score，NSS）采用7 分制評分法測試動物整體神經(jīng)功能缺失狀況，用于評估神經(jīng)功能恢復(fù)情況，見表1。

表1 神經(jīng)功能缺損評分Tab.1 Neurological severity score

1.5.3 踏錯實驗（Foot-fault test）采用踏錯實驗評估大鼠的運動協(xié)調(diào)能力，用錄像機記錄大鼠損傷側(cè)前肢抓住橫梯的狀態(tài)，然后進行評分，見表2。

表2 踏錯實驗評分Tab.2 Foot-fault test scores

1.5.4 轉(zhuǎn)棒測試（Rota-rod test）轉(zhuǎn)棒實驗評估缺血性腦卒中大鼠患側(cè)運動功能以及運動耐力的恢復(fù)情況，將大鼠放置在運轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)棒上，共測試3 輪，每2 輪之間間隔5 min，將轉(zhuǎn)棒設(shè)置為10 s后勻速增加至10 r/min，持續(xù)5 min；記錄跑動時間，取3 輪的平均成績作為最終成績。

1.5.5 尼式染色干預(yù)結(jié)束后將大鼠用 3%戊巴比妥鈉麻醉后，取出完整大腦，用4%多聚甲醛進行固定后，蔗糖脫水，OCT 包埋，進行冰凍切片（10 μm），根據(jù)硫堇染色法染色步驟進行染色，光鏡下觀察缺血半影區(qū)神經(jīng)元的損傷修復(fù)情況。

1.5.6 Western blot在干預(yù)結(jié)束后1 h，使用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取出大腦，分離損傷側(cè)大腦皮層，立即于干冰中速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存至檢測。樣品收集完成后進行總蛋白提取、定量，然后依次進行80 V 電壓下 SDS-PAGE 凝膠電泳40 min 后換電壓為120 V 至溴酚藍即將跑出分離膠、電流300 mA 轉(zhuǎn)膜85 min、5%脫脂奶粉封閉2 h、一抗孵育（BDNF 1∶3 000、TrkB 1∶1 000、synI 1∶3 000、PSD95 1∶3 000）4℃冰箱過夜、二抗孵育（goat anti-rabbit IgG 1∶5 000）1 h 后進行顯影和結(jié)果分析。

1.5.7 透射電鏡大鼠深度麻醉后處死，取右側(cè)半球額頂區(qū)皮質(zhì)（缺血周邊區(qū)），大小約1 mm×1 mm×2 mm，經(jīng)2.5%戊二醛、1%鋨酸固定，用酒精和丙酮脫水，用環(huán)氧樹脂包埋后，進行半薄切片定位，超薄切片（60 nm），以醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色后，置透射電鏡下觀察目標區(qū)域軸突結(jié)構(gòu)、突觸連接狀況及突觸數(shù)量變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 9 進行統(tǒng)計分析并作圖，所有實驗數(shù)據(jù)均采用“均數(shù)±標準誤”（Mean±SEM）表示，2 組間比較使用單因素方差分析（oneway ANOVA）后進行事后多重比較（Followup tests），P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正中神經(jīng)電刺激對腦卒中大鼠的正中神經(jīng)未造成損傷

干預(yù)結(jié)束后，取干預(yù)組右側(cè)和假手術(shù)組右側(cè)正中神經(jīng)進行HE 染色，見圖2。與假手術(shù)相比，正中神經(jīng)電刺激干預(yù)后，對正中神經(jīng)并未造成損傷，其神經(jīng)被膜結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎性細胞浸潤。

圖2 正中神經(jīng)電刺激對腦卒中大鼠的正中神經(jīng)未造成損傷Fig.2 Median nerve electrical stimulation did not cause damage to the median nerve in rats after stroke

2.2 正中神經(jīng)電刺激改善缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)功能和患側(cè)前肢的運動協(xié)調(diào)能力

干預(yù)結(jié)束后通過神經(jīng)功能缺損評分、Footfault test、Rota-rod test 對大鼠的神經(jīng)功能、運動協(xié)調(diào)能力及運動耐力進行評估，見圖3。與Sham組相比，MCAO 組表現(xiàn)出嚴重的神經(jīng)功能缺損（P＜0.001）；與MCAO 組相比，MNES 組的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)明顯改善（P＜ 0.05）。與Sham 組相比，MCAO 組大鼠的運動協(xié)調(diào)功能明顯下降（P＜ 0.05）；與MCAO 組相比，MNES 組大鼠的運動協(xié)調(diào)能力明顯改善（P＜ 0.05）。Rota-rod test 的結(jié)果表明：與Sham 組MCAO 組大鼠的運動時間明顯減短（P＜0.05）；與MCAO 組相比，MNES 組大鼠的運動時間明顯增加（P＜ 0.05）。

圖3 正中神經(jīng)電刺激改善缺血性腦卒中大鼠受損的神經(jīng)功能和運動協(xié)調(diào)能力Fig.3 Median nerve electrical stimulation improves nerve function and motor coordination in ischemic stroke rats

2.3 正中神經(jīng)電刺激減輕缺血性腦卒中大鼠腦梗死體積

干預(yù)結(jié)束后，取各組腦組織進行冰凍切片尼式染色以評估腦缺血損傷情況，染色結(jié)果和梗死體積統(tǒng)計結(jié)果，見圖4。與Sham 組相比，MCAO組大鼠腦梗死明顯（P＜ 0.001），且尼式小體核固縮現(xiàn)象增多，染色較深；與MCAO 組相比，MNES組大鼠的梗死體積明顯減小（P＜ 0.05），尼式小體核固縮現(xiàn)象減少，染色變淺。

圖4 正中神經(jīng)電刺激減輕缺血性腦卒中大鼠的腦梗死體積Fig.4 Median nerve electrical stimulation reduced volume of cerebral infarction in ischemic stroke rats

2.4 正中神經(jīng)電刺激上調(diào)缺血性腦卒中大鼠大腦皮層中與神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白的表達水平

Western blot 實驗檢測損傷側(cè)大腦皮層中與神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)營養(yǎng)因子（BDNF）、絡(luò)氨酸激酶受體（TrkB）、突觸素相關(guān)蛋白I（synI）、突觸后致密蛋白（PSD95）的表達水平。與MCAO 組相比，MNES 組大鼠大腦皮層中BDNF、TrkB、synI、PSD95 的表達水平均明顯上調(diào)（P＜0.05），見圖5。

圖5 正中神經(jīng)電刺激上調(diào)缺血性腦卒中大鼠大腦皮層中與神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白的表達水平Fig.5 Median nerve electrical stimulation up-regulated the expression level of neuroplasticity-related proteins in cerebral cortex of ischemic stroke rats

2.5 正中神經(jīng)電刺激對缺血性腦卒中大鼠突觸可塑性的影響

通過電鏡觀察損傷側(cè)大腦皮層突觸結(jié)構(gòu)的變化。與Sham 組相比，MCAO 組突觸數(shù)量變少（P＜0.05），密度變低，與MCAO 組相比，MNES 組突觸數(shù)量增多（P＜ 0.01），密度增高，見圖6。

圖6 正中神經(jīng)電刺激對缺血性腦卒中大鼠突觸可塑性的影響Fig.6 Effect of median nerve electrical stimulation on synaptic plasticity in ischemic stroke rats

3 討論

腦卒中是由于腦血管發(fā)生急性血流中斷或血管性病變引起的，盡管在腦卒中發(fā)作后的幾個小時內(nèi)通過靜脈溶栓或機械取栓可及時恢復(fù)血流，但許多患者因錯過治療時間窗而導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)功能障礙[6]。由于神經(jīng)系統(tǒng)具有可塑性，大腦有能力在殘留的神經(jīng)元之間重組新的連接，以補償或修復(fù)受損的神經(jīng)元[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在腦卒中后3 個月內(nèi)對患者及時進行康復(fù)訓(xùn)練可顯著增強神經(jīng)系統(tǒng)可塑性并促進神經(jīng)功能修復(fù)[8]。本研究在大鼠腦缺血再灌注損傷后第3 天開始進行正中神經(jīng)電刺激治療，治療后腦卒中大鼠受損的神經(jīng)功能及運動功能顯著改善，由此可見，在早期制定有效的康復(fù)方案以促進神經(jīng)系統(tǒng)可塑性對腦卒中患者的功能修復(fù)具有重要意義。同時，筆者發(fā)現(xiàn)在治療7 次后即大鼠腦缺血損傷后第17 天，MCAO 組損傷側(cè)皮層中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達量與Sham 組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），這也提示，在缺血損傷后，神經(jīng)系統(tǒng)具有自我修復(fù)能力。

突觸是神經(jīng)細胞間進行電信號和化學(xué)信號傳遞的關(guān)鍵部位，是學(xué)習(xí)、記憶等高級神經(jīng)功能的生物學(xué)基礎(chǔ)。當神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后，突觸會在結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生變化，從而維持神經(jīng)功能的相對穩(wěn)定，這些變化也被稱為突觸可塑性[9]。研究發(fā)現(xiàn)，百會穴和神庭穴電針可通過調(diào)節(jié)海馬CA1區(qū)突觸-樹突可塑性，來改善缺血性腦卒中大鼠的認知障礙，并控制樹突棘的數(shù)量、大小和形狀[10]。突觸可塑性相關(guān)蛋白的表達異常與腦卒中后神經(jīng)功能的修復(fù)密切相關(guān)，在分子水平研究突觸可塑性的改變，對深入了解腦卒中的發(fā)病機制以及探尋有效治療腦卒中的關(guān)鍵靶點具有重要意義。在興奮性突觸的成熟和突觸接觸的穩(wěn)定過程中，突觸素相關(guān)蛋白I（SynI）和突觸后致密蛋白（PSD95）發(fā)揮了關(guān)鍵作用，它們被認為是突觸可塑性的重要指標[11]。在本研究中，SynI 和PSD95的表達在給予腦卒中大鼠正中神經(jīng)電刺激治療后顯著上調(diào)，同時半影區(qū)的突觸數(shù)量增多，提示缺血性腦卒中后正中神經(jīng)電刺激促進了部分神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重新連接。

正中神經(jīng)電刺激是一種在周圍神經(jīng)系統(tǒng)施加電流的物理因子治療技術(shù)，具安全性高、簡便易操作、經(jīng)濟易推廣等的優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于臨床上顱腦外傷昏迷促醒、腦卒中認知功能改善、帕金森病治療等[12]。眾所周知，手部特別是大拇指在大腦皮層運動代表區(qū)的面積遠大于軀體其他部位，而支配大拇指的神經(jīng)就是正中神經(jīng)，正中神經(jīng)也被認為是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系的外周門戶[13]，因此對正中神經(jīng)進行電刺激，可以在大腦皮層引發(fā)廣泛的神經(jīng)反應(yīng)，進一步產(chǎn)生明顯的治療效果。正中神經(jīng)電刺激在治療腦卒中上展現(xiàn)出巨大潛力，臨床研究發(fā)現(xiàn)，對腦卒中后認知功能障礙患者進行正中神經(jīng)電刺激治療后，患者的神經(jīng)功能和認知功能顯著改善，患者的生活質(zhì)量顯著提高[14]。另有學(xué)者將正中神經(jīng)電刺激與中醫(yī)理論結(jié)合起來，從解剖位置上看，內(nèi)關(guān)穴在正中神經(jīng)的走形上，Lee 等[15]將內(nèi)關(guān)穴作為插入針灸針進行正中神經(jīng)電刺激標準位置，建立了內(nèi)關(guān)穴正中神經(jīng)電刺激的動物模型，并發(fā)現(xiàn)其治療神經(jīng)性疼痛方面的效果強于單獨內(nèi)關(guān)穴刺激組和通過內(nèi)關(guān)穴并未刺激正中神經(jīng)組。本課題組前期臨床研究也發(fā)現(xiàn)，在B 超引導(dǎo)下直接對正中神經(jīng)進行電刺激是安全有效的，可促進腦卒中患者上肢運動功能的恢復(fù)，同時檢測到患者血清中的 BDNF 表達上調(diào)[16]，但其作用機制仍不清楚，且在治療劑量、頻率、療程的選擇上仍有待探索。

綜上所述，本研究通過大腦中動脈閉塞動物模型證明了正中神經(jīng)電刺激是改善腦卒中后受損神經(jīng)功能安全有效的治療措施，其作用機制與促進突觸可塑性有關(guān)。但本實驗主要從動物行為學(xué)檢測及腦組織形態(tài)學(xué)檢測進行驗證，后續(xù)仍需深入探究正中神經(jīng)電刺激促進缺血性腦卒中大鼠突觸可塑性的相關(guān)分子機制，以期為臨床上正中神經(jīng)電刺激改善腦卒中患者功能障礙及正中神經(jīng)電刺激的應(yīng)用推廣提供理論依據(jù)。