陶 瑾, 張莉方, 徐寧莉, 朱雪洋, 張國強

(安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,蕪湖 241000)

青稞(HordeumvulgareL. var. nudum Hook. f.),屬禾本科大麥屬谷物,種植歷史悠久,是藏區(qū)居民主要食糧和重要農(nóng)產(chǎn)品加工原料[1]。青稞主要分布于青藏高原裸大麥區(qū),一年一熟制,具有耐寒性強、生育期短、適應(yīng)性廣、產(chǎn)量穩(wěn)定等優(yōu)點[2,3]。青稞含有較高的蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸,而且賴氨酸和色氨酸含量較其他谷物相比更高,“三高兩低” 即高蛋白、高膳食、高維生素和低糖、低脂的膳食結(jié)構(gòu)被當(dāng)代健康生活飲食所提倡[4]。研究表明,飲食中長期添加大麥粉可以對高脂血癥、糖尿病和動脈硬化起到一定的預(yù)防作用[5,6]。目前對于青稞中的β-葡聚糖[7]、酚類、黃酮類[8]和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸[9]研究較多。青稞的價值隨著科技的發(fā)展在不斷被挖掘,其應(yīng)用范圍也將擴大。然而,關(guān)于從青稞中提取具有降血糖活性肽的報道不多。

近年來,因為肽具有結(jié)構(gòu)簡單、活性高、生物友好性等優(yōu)點[10],食源性生物活性肽研究數(shù)量的顯著增加[11]?？梢酝ㄟ^酶、化學(xué)和微生物水解的方法來制備生物活性肽,其中酶水解是最為有效和經(jīng)濟的方法[12]。特定的蛋白酶有獨特的酶切位點,使蛋白質(zhì)水解具有可預(yù)測性。由于肽結(jié)構(gòu)的激素樣特性或作為拮抗受體抑制劑的作用,可以發(fā)揮它們的生物活性,并且其生物活性主要是受到特定氨基酸序列的影響[13,14]。天然活性肽較合成降血糖和抗氧化劑相比,具有安全、無毒害的優(yōu)勢。多項研究已成功在動植物中分離和鑒定出具有降血糖活性的肽[15]。Shibu等[16]通過堿性蛋白酶水解馬鈴薯蛋白制備具有降血糖活性的馬鈴薯蛋白多肽(肽序列:DIKTNKPVIF),通過動物實驗驗證十肽可調(diào)節(jié)小鼠血糖、控制了血漿總甘油、總膽固醇、胰島素和糖化血紅蛋白水平,有益于改善胰島和肝、心、腎組織損害。Gu等[17]通過木瓜蛋白酶水解小米蛋白分離出具有降血糖活性的小米蛋白多肽(肽序列:AATHTGPLS、TTPHGGPPILT),分子對接表明,2種多肽均可通過氫鍵和π-π占據(jù)DPP-IV的活性中心。胡宇航等[18]等通過堿性蛋白酶水解玉米蛋白獲得具有α-糖苷酶抑制活性的玉米蛋白多肽(肽序列:APALLPF),通過細胞實驗驗證玉米蛋白多肽能抑制HepG2細胞(人體肝癌細胞)生物活性,促進細胞凋亡。

因此,植物蛋白擁有降血糖的潛力,綜合青稞具有的降血糖功效,研究以青稞蛋白(藏青2000)為原料,探究青稞蛋白水解物的降血糖和抗氧化活性。通過評估α-葡萄糖苷酶抑制力和水解度篩選蛋白酶,確定酶解最佳工藝條件。然后以α-葡萄糖苷酶抑制活性為指標(biāo)通過超濾和Sephadex G-15對粗肽分級純化,測定其抗氧化、降血糖活性。純化后活性最高的組分通過多肽測序進行進一步分析。研究旨在深入了解青稞肽的降血糖和抗氧化能力,并為未來具有降血糖功能的食品或藥品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞蛋白:堿溶酸沉法制備;木瓜蛋白酶(2.0×105U/g)、菠蘿蛋白酶(3.0×105U/g)、胰蛋白酶(1.3×105U/g)、中性蛋白酶(1.0×105U/g)、酸性蛋白酶(7.0×105U/g)、堿性蛋白酶(2.0×105U/g)、ABTS、DPPH、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基-α-D-呋喃葡萄糖苷(pNPG)、α-淀粉酶(枯草桿菌)、葡聚糖凝膠G-15、3,5-二硝基水楊酸、碳酸鈉、38%甲醛水溶液、酒石酸鉀鈉,試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHSJ-5雷磁pH計,LGJ-10真空冷凍干燥機,超濾離心管(3、10、30 ku),SPECTRAMAX M5酶標(biāo)儀,HL-1S恒流泵,BSZ-100型自動收集器,UV- 5200紫外可見分光光度計,Thermo EASY nLC液相色譜儀、Thermo Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶的篩選

選取胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶,底物質(zhì)量濃度取2 g/100 mL,加酶量取10 000 U/g,分別在各自最適酶解溫度、最適pH的條件下,酶解4 h[19],選定α-葡萄糖苷酶抑制活性為主要測定指標(biāo),選定水解度為輔助參考指標(biāo),考察各蛋白酶酶解物的降血糖活性,確定最適蛋白酶。水解度(degree of hydrolysis,DH)的測定采用甲醛滴定法[20]進行測定,DH計算中氮含量采用GB/T 5009.5—2016 《食品中蛋白質(zhì)的測定》測定。

1.3.2 酶解條件的確定及優(yōu)化

取青稞蛋白以超純水溶解,調(diào)節(jié)pH,加入選定最適蛋白酶,恒溫且不停攪拌一段時間,酶解過程中保持溶液pH恒定,酶解結(jié)束后,在100 ℃水浴15 min滅酶,4 000 r/min的條件下離心15 min,取上清液即為青稞粗肽。考察在底物質(zhì)量濃度(1、2、3、4、5 g/100 mL),加酶量(6 000、8 000、10 000、12 000、14 000 U/g),酶解時間(1、2、3、4、5、6 h)和酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)條件下,以α-葡萄糖苷酶抑制活性為指標(biāo)的降血糖活性。在此基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken響應(yīng)面實驗優(yōu)化,選定自變量為底物濃度(A)、加酶量(B)、酶解時間(C),α-葡萄糖苷酶抑制率為相應(yīng)值,響應(yīng)面設(shè)計方案見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素水平表

1.3.3 體外降血糖活性的測定

1.3.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

依次取20 μL樣品,50 μL PBS(0.2 mol/L,pH 6.8)和50 μL pNPG(1 mg/mL)溶液加入96孔酶標(biāo)板, 37 ℃反應(yīng)10 min,再加入50 μL α-葡萄糖苷酶,在37 ℃中反應(yīng)30 min,最后添加80 μL Na2CO3(0.2 mol/L)終止反應(yīng),并在405 nm波長下測定吸光值[21]。

(1)

式中:A0為對照組吸光度;A1為樣品組吸光度;A2為背景組吸光度。

1.3.3.2 α-淀粉酶抑制活性測定

取50 μL樣品和50 μL α-淀粉酶加入5 mL離心管,37 ℃反應(yīng)10 min,后加入150 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的淀粉溶液,37 ℃反應(yīng)10 min,最后加入200 μL DNS試劑,沸水浴5 min終止反應(yīng),冷卻后稀釋至3 mL在540 nm處測定吸光度值[22]。計算同式(1)。

1.3.4 體外抗氧化活性的測定

1.3.4.1 ABTS+自由基清除率測定

ABTS+工作液的配制參考文獻[23]。在96孔酶標(biāo)板中加入50 μL樣品和200 μL ABTS+溶液混勻靜置10 min,于734 nm處測定吸光值。計算同式(1)。

1.3.4.2 DPPH自由基清除率測定

取樣品1 mL和0.2 mmol/L DPPH 2 mL于比色管,混勻,室溫下避光反應(yīng)30 min,在517 nm波長處測定吸光值[24]。計算同式(1)。

1.3.5 青稞降血糖肽的分離純化

1.3.5.1 超濾分級

將青稞粗肽酶解液依次通過30、10、3 ku的超濾離心管,離心條件為3 000 g,30 min。收集各截留液和過濾液可得4個組分分別為:>30 ku(E-1)、10～30 ku(E-2)、3～10 ku(E-3)和<3 ku(E-4)。冷凍干燥后測定4個組分的抗氧化、降血糖活性。

1.3.5.2 凝膠分離純化

選定Sephadex G-15凝膠分離青稞小分子質(zhì)量粗肽。將經(jīng)過預(yù)處理的Sephadex G-15凝膠裝入層析柱(2 cm×6 cm)中,樣品溶液(20 mg/mL)經(jīng)0.22 μm 濾膜處理后,上樣量為1 mL,以超純水洗脫,流速為0.5 mL/min,檢測波長為214 nm,按出峰情況收集各個峰洗脫液并進行冷凍干燥[25],測定各個組分體外降血糖及抗氧化活性,將降血糖活性最強的組分進行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3.6 降血糖肽結(jié)構(gòu)鑒定

使用液質(zhì)聯(lián)用LC-MS鑒定肽結(jié)構(gòu)。首先將E-4用20 μL溶解液(體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸、5%乙腈)溶解,充分振蕩渦旋,14 000 r/min,4 ℃離心20 min,上清液轉(zhuǎn)移到上樣管中,吸取8 μL液質(zhì)聯(lián)用檢測。流動相A為0.1%甲酸(體積分?jǐn)?shù)),流動相B為0.1%甲酸、80%ACN(體積分?jǐn)?shù))。梯度洗脫條件:0～7 min,VA∶VB=97∶3;7～46 min,VA∶VB=92∶8;46～51 min,VA∶VB=68∶32;51～56 min,VA∶VB=56∶54;56～60 min,VA∶VB=1∶99。質(zhì)譜參數(shù):分析時長60 min,一級質(zhì)譜質(zhì)核比掃描范圍50 ～1 550m/z,分辨率為12×104,自動增益控制(AGC)4e5,最大進樣時間50 ms;二級質(zhì)譜分辨率 3×104,最大進樣時間100 ms,自動增益控制(AGC)1e5,分離窗口m/z,TopN: 20,NCE/stepped NCE: 32。采用PEAKS軟件進行數(shù)據(jù)庫檢索。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復(fù)3次,實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Design Expert 11.0中的Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化酶解條件,Origin 2021和 SPSS 24.0統(tǒng)計數(shù)據(jù)和作圖;采用Duncan和ANOVA法進行差異顯著性檢驗和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

由于不同蛋白酶的酶切位點及作用方式不同,對其生物活性大小也有影響[26]。由圖1可知,不同蛋白酶水解產(chǎn)物對水解度和α-葡萄糖苷酶抑制活性均有差異,其中胰蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度(達24.25%)和α-葡萄糖苷酶抑制活性(達61.63%)最高,顯著高于其他蛋白酶(P<0.05)。其次為堿性蛋白酶,中性蛋白酶水解效果最差且α-葡萄糖苷酶抑制活性最低。研究表明,降血糖活性水解效果好的酶主要集中在胰蛋白酶和胃蛋白酶、堿性蛋白酶中[27]。馮俊[28]通過堿性蛋白酶水解茶籽粕蛋白,水解度最高的組分其α-葡萄糖苷酶抑制活性也是最佳的。實驗表明水解度與α-葡萄糖苷酶抑制活性有一定相關(guān)性,根據(jù)實驗結(jié)果選定胰蛋白酶進行后續(xù)實驗。

圖1 不同蛋白酶水解產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度

2.2 單因素實驗結(jié)果

由圖2可知,底物濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響最大,底物質(zhì)量濃度在3 g/100 mL達到最大,呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,說明增加一定的底物濃度有利于獲得較高α-葡萄糖苷酶抑制活性的肽。其次的影響因素為酶解時間,3 h后,酶作用于酶切位點,肽鏈長度縮短,氨基酸組成改變,從而使得抑制率明顯降低[29],隨著酶解時間到4 h后,α-葡萄糖苷酶抑制活性趨于穩(wěn)定略有下降,可能的原因為蛋白被過度水解為短肽降低了α-葡萄糖苷酶抑制活性。底物濃度固定后,隨著加酶量的增加,酶解程度增加,α-葡萄糖苷酶抑制活性也相應(yīng)增加,在添加量達10 000 U/g后趨勢變緩。當(dāng)酶解達到飽和狀態(tài)時反應(yīng)速率由底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)決定,繼續(xù)增加酶量對水解度的影響不大[30]。酶解溫度在35 ℃時,α-葡萄糖苷酶抑制活性最高,整體隨酶解溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在酶的最適溫度范圍附近,酶解效率越高,高溫會破壞蛋白酶的結(jié)構(gòu)從而降低水解效率[31]。

圖2 單因素對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

表2 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表3可知,AB、BC兩兩因素具有交互作用(P<0.05),AC兩兩因素間差異不顯著(P>0.5)。軟件分析得出最佳酶解工藝參數(shù)為:底物質(zhì)量濃度為2.903 g/100 mL、加酶量為12 291 U/g、酶解時間為5.093 h,此條件下,α-葡萄糖苷酶抑制活性為70.88%,根據(jù)實際實驗情況,將制備工藝參數(shù)修正為底物質(zhì)量濃度為3 g/100 mL、加酶量為12 000 U/g、酶解時間為5 h,在此條件下做3次平行驗證實驗,α-葡萄糖苷酶抑制活性為70.96%,與模型預(yù)測值基本一致,實驗設(shè)計方案可行。

2.4 超濾分級

采用胰蛋白酶進行青稞蛋白水解,水解液依次通過裝有截留分子質(zhì)量為 3、10、30 ku 的超濾離心管后,分離可得分子質(zhì)量分別為>30、10～30、3～10、<3 ku的4種不同分子質(zhì)量段的超濾組分并對其命名。超濾后的各組分均具有抗氧化和降血糖活性,4個組分降血糖及抗氧化能力見表4。分級后的水解產(chǎn)物有顯著差異(P<0.05)。降血糖活性中,E-4的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著高于其他組分(P<0.05),為(1.790±0.066)、(15.21±0.096)mg/mL;抗氧化活性中,E-4對ABTS和DPPH自由基的能力也顯著高于其他組(P<0.05),達(5.120±0.082)、(8.070±0.057)mg/mL。此結(jié)果與趙婉宏等[32]得到超濾后最小的組分具有最好的降血糖活性和抗氧化活性,對α-葡萄糖苷酶抑制率最高,對DPPH、羥自由基清除能力和還原力也遠高于其他超濾組分的結(jié)果一致。張一帆等[33]對楊梅蛋白水解液超濾得到具有良好的抗氧化和α-葡糖糖苷酶抑制活性的最佳分子質(zhì)量段為<5 ku。蘆鑫等[34]研究表明,芝麻蛋白水解物顯示出較強的抗氧化活性的組分也為低分子質(zhì)量組。這些肽具有較強生物活性可能歸因于其低分子質(zhì)量,因此選定分子質(zhì)量<3 ku的E-4組分為下一步分離對象。

2.5 凝膠分離

圖3 Sephadex G-15分離圖譜

圖4 青稞蛋白多肽的二級質(zhì)譜圖

表5 凝膠分離組分的降血糖及抗氧化活性

2.6 質(zhì)譜鑒定

通過LC-MS/MS測定和對比數(shù)據(jù)庫檢索,可得2條八肽,氨基酸序列為GFSGSGGK,即甘氨酸(Gly)-苯丙氨酸(Phe)-絲氨酸(Ser)-甘氨酸(Gly)-絲氨酸(Ser)-甘氨酸(Gly)-甘氨酸(Gly)-賴氨酸(Lys),分子質(zhì)量分別為695.32 u,荷質(zhì)比m/z為348.67;氨基酸序列為GVGAGAAR即甘氨酸(Gly)-纈氨酸(Val)-甘氨酸(Gly)-丙氨酸(Ala)-甘氨酸(Gly)-丙氨酸(Ala)-丙氨酸(Ala)-精氨酸(Arg),分子質(zhì)量分別為657.36 u,荷質(zhì)比m/z為329.68。2條肽鏈均由親水、疏水和堿性氨基酸組成,其N端為親水氨基酸且C端為堿性氨基酸。Famuwagun等[36]研究發(fā)現(xiàn)對堿性蛋白酶水解茄子葉蛋白中α-淀粉酶抑制活性最好的肽段氨基酸序列含有堿性、疏水堿性氨基酸結(jié)構(gòu)。Li等[37]以胃蛋白酶和胰蛋白酶水解小球藻中分離出具有DPP-IV抑制活性的多肽結(jié)構(gòu)末端氨基酸為堿性氨基酸。Fernando等[38]以枯草桿菌蛋白酶-胰蛋白酶-風(fēng)味酶三酶復(fù)合水解沙丁魚毛囊蛋白分離出2條六肽氨基酸,其序列N端為親水氨基酸,C端為堿性氨基酸。因此,推測青稞蛋白多肽的降血糖活性可能與氨基酸序列的組成有關(guān)。

3 結(jié)論

研究篩選出胰蛋白酶為最適蛋白酶水解青稞蛋白,確定青稞蛋白水解最佳工藝條件為底物質(zhì)量濃度為3 g/100 mL、加酶量為12 000 U/g、酶解時間為5 h。將酶解后的粗肽通過超濾和Sephadex G-15柱分離純化得到具有較高生物活性的目標(biāo)蛋白肽。最佳組分E-43的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性抑制能力、ABTS和DPPH自由基清除能力的IC50分別為0.26、6.74、2.62、4.23 mg/mL。質(zhì)譜測得活性肽氨基酸序列為:Gly-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Lys、Gly-Val-Gly-Ala-Gly-Ala-Ala-Arg,荷質(zhì)比m/z為348.67、329.68,分子質(zhì)量為695.32、657.36 u。2條八肽的氨基酸序列N端均為親水氨基酸,C端均為堿性氨基酸。通過將氨基酸序列與現(xiàn)有研究中具有降血糖活性的氨基酸序列比較推斷其較強的降血糖能力可能與氨基酸組成有關(guān)。證明了青稞蛋白肽具有潛在藥理價值。