王龍祥,羅 凡, 杜孟浩, 方學(xué)智, 鐘海雁

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所1,杭州 311400)

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品學(xué)院2,長(zhǎng)沙 410004)

油茶(CamelliaoleiferaAbel),為山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)常綠小喬木或灌木,是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益俱佳的木本油料物種,是聯(lián)合國(guó)重點(diǎn)推廣食用油。2022年中央一號(hào)文件和《林草產(chǎn)業(yè)規(guī)劃(2021—2025年)》中明確指出支持?jǐn)U大油茶種植面積,茶油年產(chǎn)量將在“十四五”時(shí)期從72萬t增長(zhǎng)到200萬t。

茶油中除含有較高不飽和脂肪酸外,還具有豐富的活性抗氧成分,如多酚、生育酚、甾醇等[1]。研究表明,油脂氧化穩(wěn)定性是這些活性抗氧成分共同作用的結(jié)果,而抗氧成分間存在著相加、協(xié)同及拮抗等互作關(guān)系[2]。表1列出了一些常見的抗氧活性物質(zhì)相互作用研究。

課題組在研究抗氧活性物質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)適度的熱處理會(huì)使得油茶籽油的抗氧化性增高[9],且油料熱處理后抗氧活性物質(zhì)均有不同變化。研究證明多種抗氧化功效因子聯(lián)合作用比單一組分具有更好的抗氧化效果[10],因此熱處理后抗氧活性物質(zhì)變化及其之間相互作用值得深入研究。研究以油茶籽為原料,研究熱處理后油茶籽毛油中多酚、美拉德產(chǎn)物含量動(dòng)態(tài)變化、脂質(zhì)抗氧化性及相互作用,以期對(duì)茶油氧化穩(wěn)定機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

油茶籽中未成熟、破損和霉變粒在原料清理時(shí)被去除。參考標(biāo)準(zhǔn)方法[11,12]測(cè)定油茶籽含水率為(8.81±0.04)%,油茶籽含油率為(37.14±1.09)%。油茶籽處理方式及條件:在90、100、110、120、130、140 ℃分別處理30、60、90、120 min。處理完成后通過液壓榨取油茶籽油毛油,冷藏備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

SPE柱(500 mg/3 mL);丙酮醛(MGO)、3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG)、乙二醛(GO)、5-羥甲基糠醛(5-HMF)、Trolox(97%)、4-羥基苯乙酸、2,5-二羥基苯甲酸、3,4-二羥基苯乙酸、阿魏酸、沒食子酸、鄰香豆酸、原兒茶酸、鄰香草醛、芥子酸、對(duì)香豆素、綠原酸、反式肉桂酸、焦性沒食子酸;氫氧化鈉、鄰苯二胺、氫氧化鉀、過硫酸銨、無水碳酸鈉、沒食子酸、乙酸乙酯、無水乙酸鈉、冰乙酸、濃鹽酸、氯化鐵、氯化鈉、無水乙醇;色譜純正己烷、甲醇、石油醚。

1.3 儀器與設(shè)備

S-114分析天平,MG38-CB-FAA烤箱,6YY-190自動(dòng)液壓榨油機(jī),UV-2550紫外可見光分光光度計(jì),THZ-C-1臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器,Avanti J-E冷凍離心機(jī),743 Rancimat油脂氧化穩(wěn)定性測(cè)定儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

油茶籽毛油非極性脂質(zhì)制備:參考文獻(xiàn)方法[13],取油茶籽毛油100 g溶于1 000 mL正己烷中,通過填充70 g中性氧化鋁(180 ℃活化4 h,水分活度階段Ⅱ)的洗脫柱,之后收集物經(jīng)氮吹吹干并于-20 ℃保存,且使用期限不超過10 d。

多酚物質(zhì)及含量測(cè)定:參考文獻(xiàn)[14],使用HPLC進(jìn)行分析測(cè)定,測(cè)定結(jié)果以μg/g表示。

美拉德產(chǎn)物(5-HMF、MGO、3-DG、GO)測(cè)定:參考文獻(xiàn)[5,6]采用HPLC測(cè)定5-HMF、MGO、3-DG、GO含量,測(cè)定結(jié)果以μg/g表示。

氧化誘導(dǎo)時(shí)間測(cè)定:參考文獻(xiàn)[17]和GB/T 21121—2007,取4.0 g油茶籽毛油非極性脂質(zhì),置于反應(yīng)管底部,加入1 mL樣液,混勻后氮吹吹干溶劑。測(cè)量池中加入50 mL 去離子水,測(cè)量溫度110 ℃,空氣流量為10 L/h,以誘導(dǎo)時(shí)間突變點(diǎn)為反應(yīng)終點(diǎn),進(jìn)行測(cè)定。

協(xié)同作用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:參考文獻(xiàn)[18],協(xié)同百分比根據(jù)各油樣的誘導(dǎo)時(shí)間(IP)按公式計(jì)算:

(1)

Synergism=

(2)

式中:F為所測(cè)定的不同酚類物質(zhì)及其混合物的有效性,表示為穩(wěn)定因子;IPinh表示添加抑制劑下化合物的誘導(dǎo)期值/h;IP0表示空白樣品的誘導(dǎo)期值/h;Synergism為協(xié)同百分比,正值表示為協(xié)同作用,負(fù)值表示為拮抗作用,IPinH1、IPinH2、IPinH3表示添加不同抑制劑后其誘導(dǎo)期值/h。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次,采用Microsoft Excel 2007、SPSS 22、Origin 2021進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 油茶籽油多酚與美拉德產(chǎn)物含量動(dòng)態(tài)分析

2.1.1 多酚含量動(dòng)態(tài)分析

油茶籽毛油中多酚含有游離酚酸、黃烷醇、黃酮醇等多種物質(zhì)。結(jié)合參考文獻(xiàn)[19,20]研究?jī)?nèi)容,將總酚樣液與酚類標(biāo)樣經(jīng)HPLC進(jìn)行分析比對(duì),具體結(jié)果見表2?？偡訕右褐泻袥]食子酸(GA)、3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)和反式肉桂酸(tCA),且當(dāng)油樣加熱到120 ℃時(shí),其所提取的總酚樣液中檢測(cè)到焦性沒食子酸(PG)。隨著溫度升高,GA、DOPAC和tCA含量先降低后升高,處理至140 ℃時(shí),GA、DOPAC與tCA含量較空白對(duì)照分別升高了2.07倍、3.18倍和3.33倍。劉國(guó)艷等[21]研究酚類不同形態(tài)化合物時(shí)發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)酚類化合物主要物質(zhì)組成僅在含量上存在差異,推測(cè)含量先降低后升高是因?yàn)闇囟容^低時(shí)多酚物質(zhì)抑制油脂氧化消耗使得含量降低,比如溫度高促使順式肉桂酸變成不可逆的反式肉桂酸,隨著溫度升高酚類物質(zhì)受熱溶出和部分結(jié)合態(tài)酚類受熱分解產(chǎn)生游離酚類導(dǎo)致含量升高。PG可能是原先以結(jié)合態(tài)存在或者是其他物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化而成,如GA受熱脫羧后形成PG[22]。

表2 油茶籽毛油中酚類物質(zhì)含量動(dòng)態(tài)變化

2.1.2 美拉德產(chǎn)物含量動(dòng)態(tài)分析

5-HMF是由Amadori產(chǎn)物降解,后經(jīng)脫水和縮醛反應(yīng)形成的一種美拉德產(chǎn)物[23],其可以通過和胺反應(yīng)生成類黑素類物質(zhì),是反映褐變程度重要的指標(biāo)之一。除5-HMF外,丙酮醛(MGO)、乙二醛(GO)、3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG)也是具有較強(qiáng)抗氧化性的美拉德產(chǎn)物,其屬于α-二羰基化合物,是食品中風(fēng)味和色澤物質(zhì)的重要前體,具有活性高穩(wěn)定性低特點(diǎn)[24]。經(jīng)測(cè)定,油茶籽毛油中GO在90～140 ℃、加熱120 min以內(nèi)含量低于檢測(cè)限。5-HMF、3-DG、MGO含量變化如表3所示。

表3 油茶籽毛油中5-HMF、3-DG、MGO含量動(dòng)態(tài)變化

熱處理后溫度的變化都會(huì)影響美拉德反應(yīng)速率[25],進(jìn)而影響美拉德產(chǎn)物含量。5-HMF、3-DG、MGO隨著溫度的升高其含量先降低后升高。推測(cè)初始溫度較低,美拉德反應(yīng)不活躍,三者氧化消耗大于生成:如90 ℃時(shí),三者質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低,分別為初始對(duì)照樣品的76.21%、23.62%、44.37%。而當(dāng)溫度逐漸增加時(shí),美拉德反應(yīng)逐漸活躍,5-HMF、3-DG、MGO通過降解、烯醇化、脫水等一系列反應(yīng)使得生成大于氧化消耗,含量增加[26]:如140 ℃時(shí),三者含量最高,分別為初始對(duì)照樣品的1.69、7.19、4.27倍。

2.2 協(xié)同作用分析

2.2.1 多酚與美拉德產(chǎn)物抗氧化性分析

有研究指出相同抗氧物質(zhì)在不同環(huán)境下其抗氧化能力也存在一定差異[27]。而非極性脂質(zhì)在不添加引發(fā)劑的情況下,主要的抑制反應(yīng)發(fā)生在抗氧化劑和脂質(zhì)過氧自由基之間[28]。因此選定向非極性脂質(zhì)中添加多酚與美拉德產(chǎn)物,通過測(cè)定其氧化誘導(dǎo)時(shí)間來分析其抗氧能力存在的差異。經(jīng)氣相色譜測(cè)定[29],制備所得到的非極性脂質(zhì)底物的脂肪酸組成為棕櫚酸(8.48±0.01)%、硬脂酸(1.56±0.03)%、油酸(80.02±0.04)%、亞油酸(9.37±0.03)%、亞麻酸(0.22±0.05)%、花生一烯酸(0.35±0.03)%。圖1與表4為添加酚類與美拉德產(chǎn)物后非極性脂質(zhì)氧化誘導(dǎo)時(shí)間變化。

圖1 多酚對(duì)非極性脂質(zhì)氧化誘導(dǎo)時(shí)間影響

表4 美拉德產(chǎn)物對(duì)非極性脂質(zhì)氧化誘導(dǎo)時(shí)間影響

由圖1得,添加PG、GA、DOPAC的非極性脂質(zhì)的氧化誘導(dǎo)時(shí)間隨著其質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加具有顯著性變化(P<0.05),三者質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.0 μg/g時(shí)的氧化誘導(dǎo)時(shí)間分別是添加2.5 μg/g的2.89、1.79、4.15倍。而添加了tCA的非極性脂質(zhì)其氧化誘導(dǎo)時(shí)間隨著tCA濃度變化不顯著(P>0.05),推測(cè)酚羥基在抑制脂質(zhì)過氧化中具有重要影響[30],而tCA沒有酚羥基,因而在其添加的非極性脂質(zhì)的氧化誘導(dǎo)時(shí)間變化不顯著。其余3種酚類物質(zhì)因具有酚羥基顯示出較為顯著的脂質(zhì)自由基清除作用。

由表4得添加美拉德產(chǎn)物后使得非極性脂質(zhì)氧化穩(wěn)定時(shí)間增加。添加5-HMF、3-DG的非極性脂質(zhì)的氧化誘導(dǎo)時(shí)間隨著濃度增加具有顯著性變化(P<0.05),最大值分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0、7.5 μg/g處,是初始空白樣品的1.13和1.21倍。而添加了MGO的非極性脂質(zhì)的氧化誘導(dǎo)時(shí)間隨著濃度增大先增加后趨于平緩變化不顯著(P>0.05)。推測(cè)5-HMF、3-DG含有的羥基使得在脂質(zhì)過氧化中起到了顯著的抑制作用,因此其脂質(zhì)過氧化抑制作用隨著濃度具有顯著性變化。而MGO可能通過抑制油脂中某些特定物質(zhì)來達(dá)到脂質(zhì)抗氧化作用,如MGO氧化成丙酮酸后,其作為α-酮酸可與通過脫碳基反應(yīng)來抑制脂質(zhì)過氧化。

2.2.2 多酚間復(fù)配協(xié)同效應(yīng)分析

為了進(jìn)一步研究多酚物質(zhì)間抗氧互作關(guān)系,將多酚物質(zhì)進(jìn)行復(fù)配,測(cè)定其協(xié)同效應(yīng)。表5為復(fù)配后非極性脂質(zhì)氧化誘導(dǎo)時(shí)間和穩(wěn)定系數(shù)變化。結(jié)合氧化誘導(dǎo)時(shí)間和穩(wěn)定性得,單獨(dú)添加中,PG的氧化誘導(dǎo)時(shí)間最高,tCA的氧化誘導(dǎo)時(shí)間最低,PG為tCA的2.5倍。在兩兩復(fù)配中,氧化誘導(dǎo)時(shí)間最高的是PG+GA,最低是GA+tCA,二者相差2.09倍。在三三復(fù)配中,最高的是PG+GA+DOPAC,最低的是GA+DOPAC+tCA,而二者相差2.47倍。四者混合后比PG高22.53%,比PG+GA高32.57%,比PG+GA+DOPAC低3.80%。為進(jìn)一步了解多酚內(nèi)互作關(guān)系,將4種酚類物質(zhì)復(fù)配后測(cè)定所得氧化誘導(dǎo)時(shí)間按照1.4中協(xié)同作用公式計(jì)算協(xié)同百分比,結(jié)果如圖2所示。

圖2 復(fù)配后協(xié)同百分比變化

表5 復(fù)配后非極性脂質(zhì)氧化誘導(dǎo)時(shí)間和穩(wěn)定系數(shù)變化

在兩兩復(fù)配中,協(xié)同百分比最低的是GA+tCA,為-(54.08±1.44)%,最高為tCA+DOPAC,為(5.71±4.04)%。三三復(fù)配中最高GA+DOPAC+PG,為(14.21±6.96)%,最低為GA+tCA+DOPAC,為-(29.01±6.11)%。四者全混合為(7.05±1.92)%。由此可得,在兩兩復(fù)配中tCA+DOPAC為協(xié)同關(guān)系,其余均為拮抗關(guān)系;三三復(fù)配中,GA+DOPAC+PG為協(xié)同關(guān)系,其余為拮抗關(guān)系;全混合后呈協(xié)同關(guān)系。推測(cè)在復(fù)配中由于tCA中苯環(huán)上缺少酚羥基,導(dǎo)致其抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)較弱,且tCA、GA和DOPAC中含有的羧基可能會(huì)隨著脂質(zhì)過氧化進(jìn)程中和多酚中的酚羥基反應(yīng)形成酯類物質(zhì)[31],引起抗氧化能力發(fā)生變化,進(jìn)而影響協(xié)同百分比。

2.2.3 多酚與美拉德產(chǎn)物復(fù)配協(xié)同效應(yīng)分析

為了進(jìn)一步研究多酚物質(zhì)與美拉德產(chǎn)物間抗氧互作關(guān)系,將多酚與美拉德產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)配,測(cè)定其協(xié)同效應(yīng)。表6為復(fù)配后非極性脂質(zhì)氧化誘導(dǎo)時(shí)間和穩(wěn)定系數(shù)變化。結(jié)合氧化誘導(dǎo)時(shí)間和穩(wěn)定性得,在美拉德產(chǎn)物單獨(dú)添加中,MGO的氧化誘導(dǎo)時(shí)間最高,5-HMF的氧化誘導(dǎo)時(shí)間最低,MGO為5-HMF的1.07倍。在兩兩復(fù)配中,最高的是5-HMF+3-DG,最低的是5-HMF+MGO,二者相差2.48%。三者混合后比MGO高0.96%,比5-HMF+3-DG高1.93%。將復(fù)配后所得數(shù)據(jù)進(jìn)行協(xié)同百分比計(jì)算,所得結(jié)果如圖3所示。

圖3 復(fù)配后協(xié)同百分比變化

表6 復(fù)配后非極性脂質(zhì)氧化誘導(dǎo)時(shí)間和穩(wěn)定系數(shù)變化

美拉德產(chǎn)物在兩兩復(fù)配中均為拮抗關(guān)系,協(xié)同百分比最低的是MGO+3-DG,為-(47.14±6.06)%;三者全混為拮抗關(guān)系。多酚與美拉德產(chǎn)物全混合為協(xié)同作用,為(65.35±4.24)%,比多酚全混合高。推測(cè)美拉德產(chǎn)物自身和多酚間的復(fù)配會(huì)產(chǎn)生相互作用使得抗氧能力發(fā)生變化,如MGO與3-DG、丙酮等物質(zhì)相互作用導(dǎo)致褐變程度增加[32],羥基和醛基進(jìn)行縮合來增加羰基活性,多酚與MGO反應(yīng)生成甲基乙二酮-苯酚加和物等。

3 結(jié)論

以油茶籽油毛油為對(duì)象,研究熱處理激發(fā)后油茶籽油中多酚與美拉德產(chǎn)物含量、抗氧能力及相互作用。結(jié)果表明,油茶籽油多酚中含有沒食子酸(GA)、焦性沒食子酸(PG)、3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)和反式肉桂酸(tCA)4種酚類物質(zhì)且隨溫度升高含量具有顯著性變化;GA、PG、DOPAC抗氧能力隨濃度增加而增加,tCA抗氧能力隨濃度變化不顯著。對(duì)4種酚類物質(zhì)互作關(guān)系進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)兩兩復(fù)配中tCA+DOPAC為協(xié)同關(guān)系,其余為拮抗作用;三三復(fù)配中GA+DOPAC+PG為協(xié)同作用,其余為拮抗作用;全混時(shí)為協(xié)同作用。美拉德產(chǎn)物5-HMF、3-DG、MGO含量隨著溫度的升高其含量先降低后升高。5-HMF、3-DG抗氧能力隨著濃度的升高先增加后降低,MGO抗氧能力隨著濃度的變化先增加后趨于平緩。5-HMF、3-DG、MGO兩兩復(fù)配和全混時(shí)均為拮抗作用。多酚與美拉德產(chǎn)物全混時(shí)為協(xié)同作用,說明加熱后油茶籽毛油中多酚和美拉德產(chǎn)物的同時(shí)存在將增加油脂的抗氧化性。

油茶籽油氧化穩(wěn)定性是多種抗氧物質(zhì)共同作用的結(jié)果,除多酚、美拉德產(chǎn)物外,還有甾醇、角鯊烯、維生素E等多種活性抗氧成分。多酚、美拉德產(chǎn)物與其他不同組分之間相互作用,對(duì)整個(gè)油茶籽油的抗氧化性機(jī)制影響等,有待進(jìn)一步研究。