鄧?yán)罴t，吳曉英，汪 梅，林偉雄，羅 毓，鄧 韜，孫冬梅*，陳仕妍

（1.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244；2.廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

桑葉為桑科植物桑（MorusalbaL.）的干燥葉，是我國首批認(rèn)定的藥食同源中藥材品種[1]，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，藥用始載于《五十二病方》[2]，性味甘、苦、寒，歸肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱，清肺潤燥，清肝明目的功效，多用于風(fēng)熱感冒，肺熱燥咳，頭暈頭痛，目赤昏花等癥[3]。桑葉資源豐富，在我國東北、西南、西北各省區(qū)均有栽培，中亞各國、歐洲、印度等地亦有栽培[1,4]?，F(xiàn)代文獻(xiàn)研究表明，桑葉中主要含黃酮類、酚酸類、生物堿類、香豆素類、氨基酸類、多糖類等多種化學(xué)成分，其中黃酮類、生物堿類、多糖類化合物為桑葉的主要藥效成分[1,5-8]，具有降血糖、調(diào)血脂、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理作用[9-14]。《中國藥典》2020年版桑葉含量測定項下僅規(guī)定了單指標(biāo)成分蘆丁的含量限度要求[3]，但桑葉作為多個化學(xué)成分的復(fù)合體，其多種成分都有明確的藥理活性報道[1]。高效液相（HPLC）指紋或特征圖譜則能較全面系統(tǒng)地反映桑葉整體化學(xué)成分的特征信息，因此采用含量測定和特征圖譜相結(jié)合的綜合評價方法更能體現(xiàn)桑葉藥材的內(nèi)在質(zhì)量。故本研究在測定蘆丁含量的基礎(chǔ)上，建立桑葉藥材HPLC特征圖譜，通過化學(xué)計量學(xué)分析方法、AHP層次分析法、CRITIC客觀權(quán)重賦值法及AHP-CRITIC復(fù)合加權(quán)法對特征圖譜多指標(biāo)變量進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)合Person相關(guān)系數(shù)法分析蘆丁含量與桑葉藥材色度值的相關(guān)關(guān)系，綜合評價34批桑葉藥材質(zhì)量，以期為桑葉的質(zhì)量控制提供新的參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ARC型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204E型萬分之一天平，XP26百萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；MiliQ Direct 8型超純水機(jī)（德國Merck）；111B型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）。

1.2 材料

新綠原酸對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.58 %，批號：DSTDX001503），隱綠原酸對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.30 %，批號：DST220104-035），蘆丁對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.19 %，批號：DST210520-017），均購自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司；液相用甲醇，磷酸為色譜級，其他試劑為分析純，水為超純水。34批桑葉藥材（編號：S1～S34）經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅教授鑒定為?？浦参锷＃∕orus albaL.）的干燥葉，來源信息詳見表1。

表1 34批桑葉藥材來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇（A）-0.1 %磷酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～5 min，15 %A；5～20 min，15 %A～30 %A；20～40 min，30 %A～60 %A；40～42 min，60 %A～15 %A；42～47 min，15 %A）；柱溫30 ℃；檢測波長358 nm；體積流量1.0 ml/min；進(jìn)樣體積10 μl。

2.2 對照品溶液的制備

取新綠原酸、隱綠原酸和蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含新綠原酸39.04 μg/ml、隱綠原酸24.83 μg/ml和蘆丁22.42 μg/ml的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇10 ml，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）45 min，取出放冷，再稱定重量，用50 %甲醇補足減失重量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取桑葉供試品溶液，按2.1項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，以6號蘆丁峰為參照峰（S），計算得到各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.00 %～0.09 %，0.21 %～1.39 %，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取桑葉供試品粉末適量，按2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，以6號蘆丁峰為參照峰（S），計算得到各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.00 %～0.11 %，0.27 %～1.09 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取桑葉供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，以6號蘆丁峰為參照峰（S），計算得到各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.00 %～0.17 %，0.27 %～2.99 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 HPLC特征圖譜的建立及相似度評價

取34批桑葉樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件對色譜圖進(jìn)行匹配，以S1圖譜作為參照圖譜，設(shè)置時間窗寬度為0.1 min，通過多點校正、全譜峰匹配生成34批桑葉的共有特征圖譜，同時采用中位數(shù)法生成對照特征圖譜，34批桑葉共有特征圖譜中共標(biāo)定了7個共有峰，桑葉共有特征圖譜及對照特征圖譜（R）詳見圖1。計算34批次桑葉HPLC特征圖譜與生成的共有對照特征圖譜的相似度，均大于0.90，見表2，表明不同批次桑葉樣品間質(zhì)量一致性較好。通過將對照特征圖譜與對照品圖譜比對，確定1號峰為新綠原酸，3號峰為隱綠原酸，6號峰為蘆丁，見圖2。

圖1 34批桑葉共有特征圖譜及對照特征圖譜

圖2 混合對照品色譜圖

2.6 聚類分析

聚類分析是一種無監(jiān)督模式識別方法，將34批桑葉特征圖譜中7個共有特征峰單位峰面積輸入SIMCA（14.0）軟件中進(jìn)行聚類分析，見圖3。結(jié)果顯示，聚類分析將34批桑葉樣品分成了3大類，其中S1～S3、S6～S10、S12、S16～S18、S22～S24號樣品聚為第1類，S4～S5、S14、S19～S21、S28、S31、S33號樣品聚為第2類，S11、S13、S15、S25～S27、S29～S30、S32、S34號樣品聚為第3類。該分類結(jié)果可初步確定34批桑葉樣品成分組成具有一定的差異，相同產(chǎn)地的藥材不一定能聚為一類。

圖3 34批桑葉樣品聚類分析樹狀圖

2.7 主成分分析（PCA）與正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）

在聚類分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用PCA對34批桑葉樣品進(jìn)行比較，以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn)，提取出2個主成分，可用于反映34批桑葉樣品HPLC特征圖譜77.54 %以上信息，其中PC1貢獻(xiàn)率為55.27 %，貢獻(xiàn)率最大，PC2貢獻(xiàn)率為22.27 %，詳見表3。由前2個主成分建立坐標(biāo)系，得到34批桑葉樣品的PCA得分圖（詳見圖4），由圖4可見，34批桑葉樣品可較分散地聚為3類，與聚類分析結(jié)果一致，同樣表明不同產(chǎn)地不同批次的桑葉樣品間化學(xué)成分均具有一定差異。根據(jù)桑葉共有峰成分矩陣，主成分1的信息來自峰2～7，其中3號峰為隱綠原酸、6號峰為蘆??；主成分2的信息來自峰1，其中1號峰為新綠原酸，詳見表4。

圖4 34批桑葉樣品的PCA得分圖

表3 特征值和累積方差貢獻(xiàn)率

表4 桑葉藥材成分矩陣

為進(jìn)一步明確上述3類桑葉樣品之間產(chǎn)生差異的主要標(biāo)志物，基于PCA結(jié)果，采用監(jiān)督模式識別法進(jìn)行桑葉樣品間OPLS-DA分析，繪制OPLS-DA模型得分圖，詳見圖5。OPLS-DA模型的擬合參數(shù)R2X=0.775，R2Y=0.694，預(yù)測參數(shù)（Q2）=0.624，均大于0.5，表明所建模型穩(wěn)定且預(yù)測能力較強。以模型變量投影（VIP）值>1為標(biāo)準(zhǔn)，得到色譜峰3（隱綠原酸）、峰5、峰1（新綠原酸）、峰7的VIP值分別為1.13，1.10，1.05，1.03，可作為區(qū)分桑葉質(zhì)量差異的標(biāo)志物，詳見圖6。

圖5 34批桑葉樣品的OPLS-DA得分圖

圖6 34批桑葉樣品7個共有峰的VIP值

2.8 AHP-CRITIC法分析

2.8.1 AHP法計算權(quán)重系數(shù) 桑葉主要成分為黃酮類、生物堿類及多糖類，藥理活性研究表明這些成分具有降血糖、調(diào)血脂、抗動脈粥樣硬化和抗病毒作用[1,7]，但不同成分的藥理作用強弱存在差異，將桑葉特征圖譜的7個共有峰的單位峰面積予以量化，分成3個層次，確定各指標(biāo)的優(yōu)先順序為藥典指標(biāo)成分[3]峰6（蘆?。﹥?yōu)于已知峰1，3（新綠原酸、隱綠原酸），優(yōu)于未知峰2，4，5，7，依次構(gòu)建成對比較的判斷優(yōu)先矩陣，并分別賦予各項指標(biāo)相對評分為1，2，3分，見表5。

表5 指標(biāo)成對比較判斷優(yōu)先矩陣

采用和法求解[15]峰6（蘆丁）、峰1（新綠原酸）、峰3（隱綠原酸）、峰2、4、5、7的權(quán)重系數(shù)分別為0.2935，0.1730，0.1730，0.0901，0.0901，0.0901，0.0901。計算權(quán)重，結(jié)果見表6。

2.8.2 CRITIC法計算權(quán)重系數(shù) CRITIC法[16]是一種以評價指標(biāo)間的對比強度及沖突性作為基礎(chǔ)綜合衡量的客觀權(quán)重計算方法。計算權(quán)重，結(jié)果見表6。

2.8.3 AHP-CRITIC復(fù)合加權(quán)法計算權(quán)重系數(shù) AHP法主觀評價了指標(biāo)兩兩比較判斷的優(yōu)先信息，而CRITIC法利用樣本數(shù)據(jù)的客觀性評價了相應(yīng)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，再對兩組權(quán)重數(shù)據(jù)進(jìn)行組合，計算混合權(quán)重水平，結(jié)果見表6。

分別用AHP法、CRITIC法及AHP-CRITIC混合加權(quán)法計算得到的權(quán)重系數(shù)，對試驗結(jié)果進(jìn)行綜合評分比較。相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示，AHP法和CRITIC法的相關(guān)系數(shù)為0.984，AHP法和復(fù)合加權(quán)法的相關(guān)系數(shù)為0.999，CRITIC法和復(fù)合加權(quán)法的相關(guān)系數(shù)為0.988，三者相關(guān)性有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明3種方法的評分結(jié)果具有一致性。結(jié)合聚類分析和PCA結(jié)果知，分為第1類的桑葉樣品，三者的評分結(jié)果均低于42分，分為第2、3類的桑葉樣品，三者的評分結(jié)果數(shù)值有部分交叉，但均高于42分，且從聚類分析結(jié)果看第2、3類的桑葉樣品仍可聚為一大類，推測第2、3類的桑葉樣品品質(zhì)優(yōu)于第1類的桑葉樣品，可為桑葉藥材的質(zhì)量評分提供參考。

3 含量方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）柱，以甲醇為流動相A，0.5 %磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～5 min，30 %A；5～10 min，30 %A～35 %A；10～15 min，35 %A～40 %A；15～18 min，40 %A～50 %A；18～19 min，50 %A～30 %A；19～30 min，30 %A）；檢測波長為358 nm。

3.2 對照品溶液的制備

取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含0.1 mg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70 %甲醇50 ml，稱定重量，加熱回流1.0 h，取出放冷，再稱定重量，用70 %甲醇補足減失重量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 線性關(guān)系考察

精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇制成每1 ml含199.54 μg的對照品儲備液，分別取0.2，0.4，1，2，5，10 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，得系列對照品溶液，按3.1項下色譜條件進(jìn)樣分析。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度X（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=23 125.78X+23 301.15，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9992，表明在3.99～199.54 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.5 精密度試驗

精密稱取桑葉樣品，按3.3項下方法制備供試品溶液，按3.1項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁峰面積的RSD為0.99 %（n=6），表明儀器精密度良好。

3.6 重復(fù)性試驗

精密稱取桑葉樣品6份，按3.3項下方法制備供試品溶液，按3.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁含量的RSD為0.64 %（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗

精密稱取桑葉樣品，按3.3項下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0，2，4，8，12，24 h，按3.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁峰面積的RSD為0.20 %（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 加樣回收試驗

精密稱取含量已知的桑葉樣品0.25 g，置具塞錐形瓶中，按樣品中蘆丁含量的50 %，100 %和150 %分別加入相應(yīng)對照品，設(shè)計3組實驗，每組平行3份。按3.3項下方法制備供試溶液，按3.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表7。

表7 蘆丁的加樣回收試驗結(jié)果（n=9）

3.9 樣品測定

取34批桑葉樣品，按3.3項下方法制備供試品溶液，再按3.1項色譜條件進(jìn)樣測定，計算各成分含量，結(jié)果見表8。

表8 34批桑葉蘆丁含量和色度值結(jié)果

3.10 桑葉蘆丁含量與色度值相關(guān)性分析

取34批桑葉粉末適量，壓制于分光測色儀載玻片上，壓制厚度約為1 mm。采用光源D65，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)觀察角10°，照明口徑50 mm，掃描速度600 nm/min，狹縫寬度1 nm，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)白板校正后，平行測定3次取平均值，記錄色度值L（表示明度）、a（紅-綠軸）、b（黃-藍(lán)軸），計算樣品總色值E=（L2+a2+b2）/2，見表8。

采用SPSS 20.0軟件對34批桑葉的色度值L、a、b、E與蘆丁含量進(jìn)行Person相關(guān)性分析，結(jié)果顯示蘆丁含量與L、a、b、E的相關(guān)性分別為0.360（P<0.05），-0.234，0.396（P<0.05），-0.297，即蘆丁含量與桑葉色度值L、b值有顯著正相關(guān)關(guān)系，其中L值越大，表示越亮，反之越暗，b值越大，黃色越明顯，反之藍(lán)色越明顯，表明偏亮黃色的桑葉蘆丁含量較高。

4 討論

本研究考察了提取溶劑（甲醇、70 %甲醇、50 %甲醇、30 %甲醇、50 %乙醇、70 %乙醇），提取方式（超聲，回流），提取溶劑用量（25，50，100 ml），提取時間（0.5，1.0，2.0 h）等供試品制備條件對指標(biāo)成分蘆丁含量測定的影響，最終選擇了加入70 %甲醇50 ml，回流提取1.0 h作為蘆丁含量測定的供試品溶液制備方法，可確保蘆丁成分最大程度地被提取測定，且檢測出的蘆丁峰形較好，分離度較高。另考察了提取溶劑，提取方式，提取溶劑用量，提取時間等供試品制備條件對特征圖譜各指標(biāo)測定的影響，優(yōu)選了加入50 %甲醇10 ml，超聲提取45 min的特征圖譜供試品制備條件，得到的特征圖譜各色譜峰能滿足分析要求。

本研究將34批桑葉樣品特征圖譜的7個共有特征峰進(jìn)行無監(jiān)督模式聚類分析和PCA分析，其分析結(jié)果均將34批桑葉樣品大致區(qū)分為三大類，且相同產(chǎn)地的桑葉藥材不一定能聚為一類，進(jìn)一步通過監(jiān)督模式識別法進(jìn)行OPLS-DA分析，篩選得到4個引起桑葉樣品間成分差異的主要標(biāo)志性成分，表明不同產(chǎn)地或相同產(chǎn)地的桑葉藥材質(zhì)量差異是多種成分共同作用的結(jié)果。分別用AHP法、CRITIC法及AHP-CRITIC混合加權(quán)法計算得到34批桑葉的7個共有特征峰的權(quán)重系數(shù)，對試驗結(jié)果進(jìn)行綜合評分比較得知，聚類分析歸為第1類的樣品綜合評分全低于42分，而綜合評分高于42分的樣品則全為聚類分析納為第2、3類的樣品，其蘆丁含量也均高于0.25 %，且從聚類分析結(jié)果看第2、3類的桑葉樣品仍可聚為一大類，推測第2、3類的桑葉樣品品質(zhì)優(yōu)于第1類的桑葉樣品，可為桑葉藥材的質(zhì)量評分提供參考。由桑葉蘆丁含量與色度值的相關(guān)性結(jié)果知，蘆丁含量與色度值L、b值有顯著正相關(guān)關(guān)系，表明偏亮黃色的桑葉蘆丁含量較高，可能桑葉不同生育周期下對次生代謝產(chǎn)物蘆丁的積累產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致桑葉藥材蘆丁含量的差異，也可能與桑葉地理環(huán)境、氣候條件、采收時間和干燥方式等有關(guān)[17]。

本研究通過測定桑葉特征圖譜、蘆丁含量和色度值，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析方法、AHP層次分析法、CRITIC客觀權(quán)重賦值法及AHP-CRITIC復(fù)合加權(quán)法對桑葉藥材進(jìn)行定量和一致性評價研究，直觀評價桑葉藥材品質(zhì)的一致性和化學(xué)成分的差異性，可為桑葉藥材的質(zhì)量控制和相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)參考。