謝 喆，孫云鵬*，金文芳，劉勁松，王國(guó)凱,2*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.中藥研究與開(kāi)發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012）

向天果（FructusSwieteniamacrophylla）為大葉桃花心木（Swieteniamacrophylla）的果實(shí)[1]，主要分布在熱帶及亞熱帶地區(qū)。果實(shí)味苦、澀，具有收斂、解熱等功效，種子主要可用于治療高血糖、高血壓等疾病[2-3]。前期研究表明，向天果中富含檸檬苦素類成分[4-5]。此類化合物不僅結(jié)構(gòu)多樣[6]，還具有抗氧化[7]、抗腫瘤[8]和抗病毒[9]等生物活性。

目前向天果作為保健品在市場(chǎng)上流通，并無(wú)統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，不同來(lái)源的向天果之間是否存在成分或品質(zhì)差異是亟待解決的問(wèn)題。中藥指紋圖譜能體現(xiàn)中藥質(zhì)量控制的系統(tǒng)性和整體性，被認(rèn)為是中藥質(zhì)量控制的有效手段[10-11]。本研究通過(guò)建立不同來(lái)源的向天果指紋圖譜，并進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)合聚類分析[12]，了解各批次向天果之間品質(zhì)的差異，為向天果的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；KQ3200DB型數(shù)控超聲清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；BP211D型電子天平（德國(guó)Sartorius）。

1.2 材料

甲醇，乙腈（色譜純，Sigma公司）；磷酸為分析純；蒸餾水（雙蒸水）；對(duì)照品3,6-O,O-diacetylswietenolide，swietenolide，swietenine，swietemahonin F，3-O-tigloyl-6-O-acetylswietenolide均由安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室從大葉桃花心木中分離得到，經(jīng)薄層色譜（TLC）和高效液相色譜（HPLC）確認(rèn)其性質(zhì)與純度，純度均在95 %以上。

向天果樣品（批號(hào)：S1～S30）通過(guò)電商平臺(tái)購(gòu)得，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院方成武教授鑒定為楝科植物大葉桃花心木（Swieteniamacrophylla）的果實(shí)，商家標(biāo)示的藥材產(chǎn)地見(jiàn)表1。

表1 30批向天果樣品批號(hào)及產(chǎn)地

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：KR100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A相為乙腈，B相為水，梯度洗脫（0～15 min，45 %～48 %A；15～35 min，48 %～51 %A；35～36 min,51 %～55 %A；36～47 min，55 %～100 %A；47～54 min，100 %A；54～55 min，100 %～45 %A）；流速1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量20 μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取5種檸檬苦素類化合物適量，加入適量甲醇溶解，定容，搖勻，配制成一定濃度的對(duì)照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定各批次向天果粗粉0.5 g，置25 ml量瓶中，加甲醇20 ml超聲提取30 min，冷卻后定容，靜置，取上清，過(guò)微孔濾膜（0.22 μm），備用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取樣品S1，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，所得色譜圖輸入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”中進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示相似度均在0.98以上，且13個(gè)共有峰的保留時(shí)間RSD值均小于0.16 %，符合指紋圖譜要求。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品S1，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別放置0，4，8，12，16，24 h后進(jìn)樣，所得色譜圖進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示色譜圖相似度均在0.94以上，且13個(gè)共有峰的保留時(shí)間RSD值均小于0.16 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品S3，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，依次進(jìn)樣，所得色譜圖進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示相似度均在0.93以上，且13個(gè)共有峰的保留時(shí)間RSD值均小于0.18 %，說(shuō)明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.5 向天果指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 特征指紋圖譜測(cè)定 取30批供試品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下條件對(duì)供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，以S1為參照?qǐng)D譜，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，以中位數(shù)法得到對(duì)照?qǐng)D譜R，在匹配數(shù)據(jù)的輸出結(jié)果中選擇分離度較好的13個(gè)色譜峰作為共有峰，建立30批向天果HPLC指紋圖譜共有模式，并通過(guò)自制對(duì)照品對(duì)其中的5個(gè)共有峰進(jìn)行指認(rèn)，其中1號(hào)峰為swietenolide，6號(hào)峰為swietenine，8號(hào)峰為3,6-O,O-diacetylswietenolide，10號(hào)峰為3-O-tigloyl-6-O-acetylswietenolide，11號(hào)峰為swietemahonin F，結(jié)果見(jiàn)圖1～2。

圖1 30批向天果的特征指紋圖譜

圖2 向天果HPLC指紋圖譜共有模式和對(duì)照品圖譜

2.5.2 特征指紋圖譜的結(jié)果分析 經(jīng)分析計(jì)算，30批樣品的共有模式中，所有共有峰保留時(shí)間RSD值均小于1 %（見(jiàn)表2）；13個(gè)共有峰的峰面積RSD值在11.7 %～37.0 %之間（見(jiàn)表3），表明不同批次向天果中化學(xué)成分相差不大，但含量差異較大，不同來(lái)源的向天果樣品品質(zhì)有差異。

表3 向天果共有峰的峰面積

表4 30批向天果相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.5.3 聚類分析 將上述分析數(shù)據(jù)輸入到SPSS 23系統(tǒng)中，進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明30批向天果在閾值為10的情況下被聚為6類，其中有22批樣品被聚為一類，說(shuō)明國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上大部分的向天果來(lái)自于相似產(chǎn)地；但根據(jù)商家標(biāo)明的產(chǎn)地，來(lái)源相同的樣品并未完全被聚為一類，說(shuō)明商家標(biāo)明的信息并不可靠；在閾值為5的情況下，樣品被聚為11類，其中6批樣品被單獨(dú)歸為一類，表明不同產(chǎn)地來(lái)源的向天果含有的化學(xué)成分的含量有顯著差異。

圖3 聚類分析結(jié)果

2.5.4 主成分分析 將30批向天果共有峰峰面積作為變量導(dǎo)入SPSS 23軟件，進(jìn)行主成分分析，計(jì)算特征值、累計(jì)貢獻(xiàn)率、成分矩陣及綜合得分，具體結(jié)果見(jiàn)表5～7。

表5 30批向天果的特征值和貢獻(xiàn)率

表6 30批向天果的成分矩陣

表7 主成分得分和綜合得分排序

以特征值≥1為提取標(biāo)準(zhǔn)，提取出4個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)77.705 %，可代表向天果中大部分化學(xué)成分的含量信息。其中主成分1的信息量最大，貢獻(xiàn)率為33.852 %，各色譜峰荷載量代表對(duì)應(yīng)色譜峰的貢獻(xiàn)值，貢獻(xiàn)值前三的色譜峰分別為：1號(hào)峰、6號(hào)峰、2號(hào)峰。通過(guò)主成分綜合得分，排名前3位的批號(hào)為S4、S17、S7，與聚類分析的結(jié)果大體相同，可相互印證。

2.6 指標(biāo)性成分含量測(cè)定

由于目前向天果并無(wú)明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和含量測(cè)定方法，因此根據(jù)聚類分析和主成分分析的結(jié)果指認(rèn)共有峰（1號(hào)峰：swietenolide和6號(hào)峰：swietenine）作為向天果的特征性成分，通過(guò)自制對(duì)照品對(duì)30批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，建立向天果特征性成分的含量測(cè)定方法。

2.6.1 線性關(guān)系考察 吸取對(duì)照品溶液，分別吸取1，3，5，10，15，20 μl，定容，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，swietenolide的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1104.1X-6.1436（r=1，n=6），線性范圍為0.488～9.79 μg；swietwnine的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1456.5X-21.864（r=0.9999，n=6），線性范圍為0.334～6.68 μg。

2.6.2 精密度試驗(yàn) 取樣品S1，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示swietenolide峰面積的RSD為0.87 %（n=6）；swietwnine峰面積的RSD為1.23 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品S1，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，放置0，4，8，12，16，24 h后依次進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示swietenolide峰面積的RSD為1.97 %（n=6）；swietwnine峰面積的RSD為1.19 %（n=6），表明供試品溶液中成分室溫下24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取S3批次樣品0.5 g，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示swietenolide峰面積的RSD為1.37 %（n=6）；swietwnine峰面積的RSD為0.93 %（n=6），表明本法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收試驗(yàn) 取樣品S1，分別精密稱定6份，每份0.25 g，分別加入1.00 mg/ml swietenolide對(duì)照品溶液8.55 ml，1.00 mg/ml swietwnine對(duì)照品溶液4 ml，按2.3項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表8。兩對(duì)照品的平均回收率分別為99.8 %和101.0 %，RSD分別為1.68 %和3.63 %，符合試驗(yàn)要求。

表8 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.6.6 樣品含量測(cè)定 取30批次供試品（批號(hào)：S1～S30），按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表9。30批向天果樣品中swietenolide和swietwnine的含量平均值分別為14.28，10.74 mg/g。

表9 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

檸檬苦素類化合物的紫外吸收大部分為末端吸收，對(duì)向天果甲醇提取液在190～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，最大吸收集中在210 nm左右?？疾炝思状?水，甲醇-0.1 %磷酸水溶液，乙腈-水，乙腈-0.1 %磷酸水溶液等多種流動(dòng)相體系，并對(duì)柱溫、流速及進(jìn)樣量進(jìn)行考察，分析比較出峰數(shù)目、分離度、峰面積和基線情況。結(jié)果顯示以乙腈-水、流速1.0 ml/min、柱溫30 ℃、進(jìn)樣量20 μl的色譜條件測(cè)定時(shí)，基線較穩(wěn)定，出峰較多、分離最好、峰形最佳、保留時(shí)間適宜，具有較強(qiáng)的耐用性。

3.2 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

由本文研究可見(jiàn)，在采用指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)向天果藥材時(shí)，不同產(chǎn)地藥材評(píng)價(jià)的結(jié)果會(huì)有一定差異，有時(shí)不能完全體現(xiàn)批間差異。因此在涉及不同產(chǎn)地藥材時(shí)應(yīng)尤其關(guān)注類似問(wèn)題，建議在采用相似度評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，還應(yīng)增加主要成分色譜峰單位質(zhì)量峰面積（A/W）的波動(dòng)范圍，非共有峰個(gè)數(shù)、共有峰個(gè)數(shù)及指紋圖譜峰形特征、峰面積等指標(biāo)，并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹鞒煞址治龊途垲惙治?，進(jìn)而對(duì)不同產(chǎn)地的藥材進(jìn)行更全面的評(píng)價(jià)。

3.3 聚類分析和主成分分析

本研究通過(guò)主成分分析將30批向天果的13個(gè)共有峰峰面積轉(zhuǎn)換成4個(gè)相互獨(dú)立的主成分，避免了原始信息的重疊及干擾，也使數(shù)據(jù)具有客觀性和可比性；以共有峰峰面積直接區(qū)別歸類的聚類分析，將相關(guān)性大的批次優(yōu)先聚合在一起。兩種分析方法的結(jié)果有相似之處，相互佐證，均能較好地反映出不同產(chǎn)地向天果品質(zhì)的差異性。

4 結(jié)論

本文建立了30批向天果樣品的特征指紋圖譜，并確立了13個(gè)共有峰，指認(rèn)出其中5個(gè)共有峰為檸檬苦素類化合物，表明檸檬苦素類成分為向天果的主要化學(xué)成分。比較共有峰保留時(shí)間和峰面積的RSD值，結(jié)果顯示不同來(lái)源的向天果樣品的化學(xué)成分具有一致性，但含量存在一定的差異。后通過(guò)聚類分析和主成分分析，深入分析了30批向天果之間品質(zhì)的差異，并計(jì)算出各共有峰的貢獻(xiàn)率，以此為基礎(chǔ)對(duì)貢獻(xiàn)率最大的兩個(gè)共有峰進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)目前我國(guó)市場(chǎng)上流通的向天果存在產(chǎn)地信息不明，不同產(chǎn)地的向天果成分含量差異較大等問(wèn)題，相似度越高的批次之間含量差異越小，反之則越大，在聚類分析中相似度高的批次也基本被分為一類。可見(jiàn)各部分試驗(yàn)結(jié)果具有一致性，可相互佐證，所建立的指紋圖譜和含量測(cè)定方法具有客觀性和科學(xué)性，可合理地評(píng)價(jià)該藥材質(zhì)量，為制定向天果的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。