郭建來， 和 月， 魏紅芳 ， 劉 昆， 姬向波， 翟樂平

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450045；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450045；3.河南同發(fā)生物科技有限公司，河南鄭州 450000）

黑水虻是最近幾年昆蟲資源領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一， 隨著黑水虻幼蟲資源化處理餐廚垃圾和畜禽糞便的廣泛推廣， 黑水虻幼蟲飼料化的應(yīng)用技術(shù)也被重點(diǎn)關(guān)注和研究（郝建偉等，2022）。 目前，黑水虻幼蟲主要采取微波烘干的加工方式， 也有文獻(xiàn)報(bào)道了黑水虻蟲粉替代蛋白原料在畜牧業(yè)中的應(yīng)用（Park 等，2021；趙燕等，2021；Gariglio 等，2021；Rawski 等，2020； 張金金等，2020；Chia 等，2019；Pieterse 等，2019； 張放等，2018； 陳巍等，2017），但微波烘干方式成本過高，嚴(yán)重限制了黑水虻幼蟲在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用。 進(jìn)一步探討黑水虻幼蟲的加工工藝是未來黑水虻幼蟲飼料化的研究方向之一（王斌等，2021）。近年來微生物發(fā)酵飼料在畜牧業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用， 其不僅可以改善腸道健康，提高機(jī)體免疫力，還能減少抗生素的使用（楊連玉等，2018）。然而，迄今為止，微生物發(fā)酵飼料主要是以植物性農(nóng)副產(chǎn)品為主要原料， 利用黑水虻幼蟲生產(chǎn)功能性發(fā)酵飼料鮮有報(bào)道。 本試驗(yàn)選擇3 種乳酸菌對(duì)黑水虻幼蟲進(jìn)行固體發(fā)酵，著重對(duì)黑水虻幼蟲發(fā)酵前后各營養(yǎng)成分的變化進(jìn)行分析，篩選出適宜的乳酸菌發(fā)酵劑，為黑水虻幼蟲的固體發(fā)酵提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 黑水虻幼蟲和麩皮由鄭州普恩科技有限公司提供，植物乳桿菌、糞腸球菌、嗜酸乳桿菌為本實(shí)驗(yàn)室保藏，MRS 培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試劑 硫酸銅和硫酸鉀（分析純）：購自天津凱通化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；硫酸（分析純）：購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖：購自山東祥瑞藥業(yè)有限公司；硼酸（分析純）：購自天津市恒星化學(xué)試劑制造有限公司；石油醚（60 ～90 ℃）和氫氧化鈉（分析純）：購自四川西隴科學(xué)有限公司；乳酸對(duì)照品：購自北京索萊寶科技有限公司；乙腈和甲酸（色譜純）：購自Thermo Fisher 公司；氨基酸對(duì)照品及氨基酸檢測(cè)試劑： 購自德國曼默博爾公司青島技術(shù)服務(wù)中心。

1.3 主要儀器 精密pH 計(jì) （型號(hào)Seven compact）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；磁力攪拌器（型號(hào)HJ-1）： 常州越新儀器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床（型號(hào)THZ-100）、隔水式培養(yǎng)箱（型號(hào)GHP-9160）：上海—恒科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀（型號(hào)K2025）：山東悟空儀器有限公司；超凈工作臺(tái)（型號(hào)SW-CJ-1F）：蘇州凈化設(shè)備有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（型號(hào)UV Power）：北京萊伯泰儀器有限公司；凱氏定氮儀（型號(hào)K9840）、石墨消解爐（型號(hào)SH220F）、粗脂肪測(cè)定儀（型號(hào)SOX416）：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；電子分析天平（型號(hào)BAS224S）：上海精密儀器儀表有限公司；陶瓷纖維馬弗爐（DTM-4A-12）、人工氣候箱（型號(hào)DGC-300-Ⅱ）：上海燈晟儀器制造有限公司；纖維分析儀（型號(hào)A220i）：美國安康公司；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥器（型號(hào)GZXGT-400.101-3）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司； 氨基酸分析儀 （型號(hào)A300）：德國曼默博爾公司；超聲波清洗機(jī)（型號(hào)SB25-12DTD）： 寧波新芝生物科技股份有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)TGL-23）：四川署科儀器有限公司； 微機(jī)全自動(dòng)量熱儀 （型號(hào)TYHW-2000 型）：鶴壁市儀器儀表制造有限公司。

1.4 測(cè)定方法 水分：105 ℃烘箱干燥，GB/T 6435-2014；總能：采用全自動(dòng)量熱儀測(cè)定；粗纖維：ANKOM200 纖維分析儀測(cè)定，GB/T 6434-2006；粗蛋白質(zhì)：采用凱氏定氮法，GB/T 6432-2018；鈣：采用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法，GB/T 6436-2018；總磷：采用分光光度法，GBT6437-2002；氨基酸： 采用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)，GB/T 18246-2019； 乳酸： 采用高效液相色譜法， 依據(jù)T/NAIA002-2020《發(fā)酵飼料中乳酸含量的測(cè)定》。

多肽含量的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取發(fā)酵飼料4.00 g，加入三氯乙酸（15%）溶液50 mL，混合均勻，靜置5 min，中速定性濾紙過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，4000 r/min 離心10 min，準(zhǔn)確移取上清液10 mL 于消化管中， 按全量法粗蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定其多肽含量， 具體操作和計(jì)算參照GB/T 6432-2018。

pH 測(cè)定： 準(zhǔn)確稱取發(fā)酵后飼料樣品10 g，加入90 mL 的生理鹽水，將其充分?jǐn)嚢?，使用pH 計(jì)測(cè)定pH。

1.5 發(fā)酵用種子液的制備 在無菌環(huán)境下，用無菌接種環(huán)挑取平板菌落1 ～2 環(huán)至其相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，然后按1%的比例將其接種至液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)4 h， 獲得發(fā)酵用種子液。

1.6 黑水虻發(fā)酵飼料的制作 黑水虻幼蟲在使用前停止飼喂1 d，準(zhǔn)確稱取黑水虻幼蟲和麩皮，按1:1 混合，然后分別加入發(fā)酵用種子液，物料含水量最終控制在40.0% 左右。 試驗(yàn)分為4 組，分別為對(duì)照組（未發(fā)酵）、試驗(yàn)1 組（植物乳桿菌組）、試驗(yàn)2 組（糞腸球菌組）、試驗(yàn)3 組（嗜酸乳桿菌組），每組3 個(gè)平行，將混勻后的3 種樣品分別裝入發(fā)酵袋中，進(jìn)行密封，放于35 ℃人工氣候箱中發(fā)酵3 d。 發(fā)酵結(jié)束后將樣品于105 ℃烘1 h，65 ℃烘4 h，粉碎后過80 目篩，得黑水虻幼蟲發(fā)酵飼料樣品，保存在干燥器中備用。試驗(yàn)地點(diǎn)在河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 試驗(yàn)于2022 年3 ～4 月進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel2016 軟件進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 22.0 軟件ANOVA對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析， 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用Duncan's 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P ﹤0.05 表示差異顯著，P ﹤0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料重量的影響 由表1 可知，黑水虻發(fā)酵飼料經(jīng)三種乳酸菌發(fā)酵后，重量都有一定損失，其中以試驗(yàn)1 組的損失率最低，但三組之間差異不明顯（P ＞0.05）。

表1 不同乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料重量的影響

2.2 不同乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分的影響 由表2 可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)1 組、2 組和3 組干物質(zhì)中粗灰分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、鈣、磷等營養(yǎng)成分的含量略有增加，但差異不顯著（P ＞0.05）；總能與發(fā)酵前相比略有提高，但差異不顯著（P ＞0.05）；與發(fā)酵前相比，試驗(yàn)1 組、2 組和3 組粗纖維含量顯著降低， 分別降低了16.25%（P ﹤0.05）、16.41%（P ﹤0.05） 和10.54%（P ﹤0.05）。

表2 不同乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分的影響

2.3 不同乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料氨基酸含量的影響 由表3 可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)3 種乳酸菌發(fā)酵后各試驗(yàn)組氨基酸總和均升高。其中，纈氨酸含量分別增加了11.25%（P ﹤0.05）、10.00%（P ﹤0.05）和16.25%（P ﹤0.05），脯氨酸含量分別增加了15.73%（P ﹤0.01）、13.75%（P ﹤0.01）和8.99%（P ﹤0.01）。

表3 不同乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料氨基酸含量的影響 %

2.4 不同乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料pH和乳酸含量的影響 由表4 可知， 黑水虻飼料發(fā)酵后，各組之間乳酸含量差異極顯著（P ﹤0.01），其中試驗(yàn)1 組乳酸含量最高，達(dá)到了8.72%；發(fā)酵后，各組pH 顯著下降（P ﹤0.01），其中試驗(yàn)1 組pH 最低。

表4 不同乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料pH 和乳酸含量的影響

2.5 不同乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料多肽含量的影響 由表5 可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)1 組、2 組和3 組多肽含量分別提高了270.59%、266.06%和270.13%，差異極顯著（P ﹤0.01）。

表5 不同乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料多肽含量的影響 %

3 討論

3.1 不同乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料主要營養(yǎng)成分含量的影響 益生菌可以將非蛋白氮和無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為具有較高營養(yǎng)價(jià)值的菌體蛋白，使蛋白質(zhì)含量升高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)酵后黑水虻飼料粗蛋白質(zhì)含量稍有升高。 侯楠楠等（2018）使用復(fù)合益生菌固體發(fā)酵豆粕， 發(fā)酵后豆粕的粗蛋白質(zhì)含量增加6.07%；樊振等（2014）利用植物乳桿菌對(duì)青貯玉米進(jìn)行了發(fā)酵， 發(fā)酵后其粗蛋白質(zhì)含量也有所升高；魏一星等（2014）采用植物乳桿菌對(duì)小麥胚芽進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)， 發(fā)現(xiàn)其粗蛋白質(zhì)、氨基酸含量均提高。 纈氨酸作為動(dòng)物體內(nèi)的一種必需氨基酸， 能改善仔豬生長性能和免疫功能，并提高泌乳母豬的泌乳能力（陳熠等，2014）；脯氨酸可參與細(xì)胞的增殖和分化，能夠促進(jìn)胎兒與仔豬的生長發(fā)育 （陳秋萍等，2017），黑水虻飼料發(fā)酵后其纈氨酸和脯氨酸的含量都顯著提高。

粗纖維具有促進(jìn)腸道蠕動(dòng)的作用， 但也是飼料中最難消化的一種營養(yǎng)物質(zhì)。 章世元等（2009）研究發(fā)現(xiàn)， 豆粕發(fā)酵后粗纖維含量下降了43.73%；稅朝毅等（2013）用益生菌發(fā)酵白酒丟糟，發(fā)酵產(chǎn)物的粗纖維含量大幅下降。本試驗(yàn)結(jié)果顯示， 黑水虻飼料經(jīng)3 種乳酸菌發(fā)酵后粗纖維含量明顯下降，與前人的試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 不同乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料pH和乳酸含量的影響 乳酸菌在發(fā)酵過程中， 可以通過產(chǎn)生一定的酶，將葡萄糖、乳糖等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸等有機(jī)酸，從而使飼料的pH 下降，同時(shí)還能保持動(dòng)物腸道菌群的平衡， 減少腹瀉。 王誠等（2022） 對(duì)地源性優(yōu)勢(shì)青貯發(fā)酵乳酸菌進(jìn)行了研究， 結(jié)果表明， 乳酸菌在青貯中能產(chǎn)生大量的乳酸，從而使其pH 下降，有利于青貯飼料的長期保存；王赫等（2017）利用植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵由玉米、菜籽粕、棉籽粕組成的混合飼料，發(fā)酵后乳酸菌和乳酸含量均顯著高于未經(jīng)發(fā)酵的飼料。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，黑水虻飼料經(jīng)3 種乳酸菌發(fā)酵后乳酸含量顯著增加，pH 顯著降低， 其中植物乳桿菌固態(tài)發(fā)酵黑水虻飼料效果較優(yōu)。

3.3 不同乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)黑水虻發(fā)酵飼料多肽含量的影響 多肽作為功能性飼料， 具有促生長、減少腹瀉、調(diào)節(jié)免疫力、刺激動(dòng)物食欲、增強(qiáng)抗菌和抗病毒能力的功能（陳偉，2011）。 吝常華等（2018）對(duì)豆粕固態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，豆粕經(jīng)混合菌發(fā)酵后， 小肽含量較未發(fā)酵組提高了8.68倍；林俊宏等（2017）通過試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵魚粉的工藝， 使得發(fā)酵豆粕中小肽含量提高25%以上；任曉靜等（2013）的試驗(yàn)表明，花生粕經(jīng)微生物發(fā)酵后多肽含量顯著提高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)3 種乳酸菌固態(tài)發(fā)酵后， 黑水虻發(fā)酵飼料中的多肽含量均顯著升高（P < 0.01），其中以植物乳桿菌組多肽含量最高。

4 結(jié)論

黑水虻飼料經(jīng)3 種乳酸菌發(fā)酵后， 各組粗纖維含量和pH 均顯著降低， 乳酸和多肽含量顯著提高， 其中植物乳桿菌組固體發(fā)酵黑水虻幼蟲效果較好， 應(yīng)優(yōu)先選擇植物乳桿菌作為黑水虻發(fā)酵飼料用發(fā)酵劑。