趙志燊,趙 杰,余 磊

(貴陽(yáng)學(xué)院 貴州生態(tài)環(huán)境中優(yōu)勢(shì)農(nóng)產(chǎn)品殘留農(nóng)藥降解關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550005)

儀器分析一直以來(lái)是高?；瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)課程中最為重要的課程之一。它幾乎涵蓋了環(huán)境檢測(cè)、食品品質(zhì)與安全、材料合成與應(yīng)用等基礎(chǔ)理論化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)中相關(guān)分析儀器使用的基礎(chǔ)理論。[1-4]其所含涵蓋的色譜學(xué)、光譜學(xué)與電化學(xué)的技術(shù)在近年來(lái)突飛猛進(jìn)。隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)與社會(huì)的不斷發(fā)展,相關(guān)行業(yè)分析標(biāo)準(zhǔn)對(duì)設(shè)備的要求也越來(lái)越高,包括逐漸提高準(zhǔn)入門檻的資質(zhì)要求等,這無(wú)一不體現(xiàn)出該門課程需要與時(shí)俱進(jìn)的重要性。[5]這不僅需要課程在注重“教”的同時(shí)更加注重實(shí)踐教學(xué)。操作實(shí)驗(yàn)中,結(jié)合學(xué)生提出疑問(wèn)、反饋難點(diǎn),對(duì)應(yīng)重點(diǎn)相結(jié)合,歸納出存在難點(diǎn)的實(shí)例操作與講解,科學(xué)地開(kāi)展“教練結(jié)合”,打破傳統(tǒng)PPT理論或?qū)嶒?yàn)視頻教學(xué)。模式則主要概括為通過(guò)講解—實(shí)驗(yàn)—?dú)w納,使學(xué)生明顯感受儀器操作與理論并重的重要性,并在操作實(shí)例中解決理論難點(diǎn)的理解問(wèn)題。

對(duì)此,以色譜理論為例,結(jié)合氣相色譜與液相色譜不同檢測(cè)器的分析特點(diǎn),并應(yīng)用實(shí)際操作實(shí)例上樣分析。學(xué)生在實(shí)際讀取譜圖中與理論相結(jié)合,加深對(duì)基礎(chǔ)理論記憶的同時(shí),并對(duì)理論難點(diǎn)進(jìn)行梳理與運(yùn)用,解決僅僅通過(guò)解題鞏固知識(shí)的傳統(tǒng)教學(xué)帶來(lái)的弊端。在具體到色譜檢測(cè)器對(duì)應(yīng)的難點(diǎn)上存在同樣的問(wèn)題,且在相關(guān)研究中均有不同程度體現(xiàn)。譚芳在氣相色譜實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)里,論證了實(shí)驗(yàn)課程中改變氣相色譜儀檢測(cè)器、色譜柱的升溫程序等條件來(lái)讓學(xué)生操作,并記錄在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上,更好地優(yōu)化色譜條件,充分地理解理論知識(shí)。[6]吳澤穎等在色譜教學(xué)研究中,發(fā)現(xiàn)學(xué)生學(xué)習(xí)色譜知識(shí)的主動(dòng)性、實(shí)踐能力不高,需要與實(shí)際應(yīng)用如與企業(yè)合作教學(xué)等方法結(jié)合,打破傳統(tǒng)老師僅僅教、學(xué)生學(xué)的模式,提升教學(xué)質(zhì)量。[7]孫艷濤等則在傳統(tǒng)氣相色譜儀器操作實(shí)驗(yàn)中,僅對(duì)填充色譜柱與檢測(cè)器的靈敏度與其他性能進(jìn)行測(cè)定的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn);引入作為汽油重要組分二甲苯的3種同分異構(gòu)體作為實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)化合物,3種化合物的物化性質(zhì)相近,一般的物理與化學(xué)方法難以分離鑒定,從而利于學(xué)生更好地理解氣相色譜儀分析優(yōu)勢(shì)與提升儀器分析條件變化的能力。[8]賈瓊等就在其儀器分析實(shí)驗(yàn)課程設(shè)計(jì)的相關(guān)研究中,指出傳統(tǒng)儀器分析實(shí)驗(yàn)針對(duì)儀器操作的學(xué)習(xí)較為單一,綜合性不強(qiáng)。[9]劉莎莎等則充分利用自己測(cè)定野菊花中的龍腦和樟腦的科研成果轉(zhuǎn)化并應(yīng)用到氣相色譜的實(shí)驗(yàn)教學(xué),學(xué)生自行選擇實(shí)驗(yàn)條件并優(yōu)化,分組討論影響因素,在教研結(jié)合的情況下,充分激勵(lì)學(xué)生的學(xué)習(xí)與科研熱情,取得更好的教學(xué)效果。[10]通過(guò)匯總以上儀器分析中色譜單元應(yīng)用教學(xué)中的難點(diǎn),不難發(fā)現(xiàn)普遍存在理論與實(shí)踐應(yīng)用脫節(jié)這樣的“通病”。

1 學(xué)生反映教學(xué)難點(diǎn)歸納

結(jié)合儀器分析課程班級(jí)49名學(xué)生,其中男生24名,女生25名,對(duì)色譜理論教學(xué)色譜理論與檢測(cè)器構(gòu)造中存在的難點(diǎn)進(jìn)行匯總,見(jiàn)表1。表1顯示,塔板理論是較多知識(shí)點(diǎn)中,反饋人數(shù)最多的一點(diǎn)。學(xué)生對(duì)該知識(shí)點(diǎn)的理解較難在于以下兩個(gè)方面：一是色譜柱在實(shí)際的應(yīng)用中,并不存在塔板,它只是為了表達(dá)柱效中的分離效果而引入的概念;二是因?yàn)樗謇碚撛谶壿嬤^(guò)程中,對(duì)數(shù)學(xué)的運(yùn)算能力有一定要求,需要學(xué)生具有良好的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)。在缺乏實(shí)例的情況下,不利于對(duì)該理論的理解。在速率理論與分離度知識(shí)點(diǎn)上,學(xué)生則更為突出反映的是在理解該知識(shí)點(diǎn)后,缺乏實(shí)例的補(bǔ)充,若僅從書(shū)上的附圖與相應(yīng)公式解釋,則理解較為空洞。

表1 教學(xué)難點(diǎn)匯總

2 教研結(jié)合的應(yīng)用實(shí)例

鑒于上述統(tǒng)計(jì),并結(jié)合儀器分析實(shí)驗(yàn)課程現(xiàn)有的弊端與改革取得的效果。在對(duì)應(yīng)氣相色譜理論與運(yùn)用教學(xué)中,筆者采用教研結(jié)合的方式,對(duì)環(huán)境分析中普遍存在的典型持久性有機(jī)污染物,包括美國(guó)環(huán)保署優(yōu)先控制的16種多環(huán)芳烴以及21種典型有機(jī)氯農(nóng)藥,作為教學(xué)目標(biāo)化合物,通過(guò)不同的升溫程序、檢測(cè)器、不同基質(zhì),作為結(jié)果比較與討論的優(yōu)化項(xiàng)目。打破傳統(tǒng)單一固定的較少化合物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?總結(jié)并綜合全面的教研結(jié)合課程模式。16種多環(huán)芳烴與21種有機(jī)氯農(nóng)藥見(jiàn)表2所示。

表2 應(yīng)用于教學(xué)的16種多環(huán)芳烴與21種有機(jī)氯農(nóng)藥

對(duì)于烴類物質(zhì),在氣相色譜教學(xué)設(shè)計(jì)中,主要應(yīng)用氫火焰離子化檢測(cè)器(Flame Ionization Detector,FID)來(lái)進(jìn)行檢測(cè),但對(duì)于某些同分異構(gòu)體,其物化性質(zhì)非常接近,則難以分離。在此基礎(chǔ)上,引入液相色譜儀(Liquid chromatograph,LC)、質(zhì)譜檢測(cè)器(Mass Spectrometry,MS)檢測(cè)。介紹LC相對(duì)于GC的不同,MS相對(duì)于FID的優(yōu)勢(shì)。對(duì)典型有機(jī)氯農(nóng)藥采用電子捕獲檢測(cè)器(Electron Capture Detector,ECD)檢測(cè),對(duì)其在綠茶基質(zhì)提取液中出現(xiàn)峰漂移現(xiàn)象,介紹出現(xiàn)故障的可能原因與維修方法。

圖1為16種多環(huán)芳烴以正己烷為溶劑的標(biāo)準(zhǔn)品,苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽截取色譜圖。使用FID檢測(cè)出峰時(shí)間段的升溫速率分別為2.5 ℃/min、1 ℃/min和0.5 ℃/min,以代表常規(guī)、較慢與慢速3種不同升溫速率所得色譜圖。運(yùn)用在教學(xué)中,講解升溫速率對(duì)分離效果影響的理論。但鑒于在大量教學(xué)理論與案例中已有講解,此處以升溫速率改變對(duì)同分異構(gòu)化合物分離效果影響較小的特例介紹,同時(shí)比較其他檢測(cè)器與不同色譜檢測(cè)模式優(yōu)劣性,做到教學(xué)難點(diǎn)重點(diǎn)結(jié)合與模式創(chuàng)新。

氣相色譜儀升溫過(guò)程中采用島津GC-2014C色譜儀,配備FID,載氣為氮?dú)?色譜柱采用美國(guó)安捷倫型號(hào)DB-5,規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm。常規(guī)升溫速率程序?yàn)椋骸皻饣覝囟?50 ℃,檢測(cè)器溫度300 ℃;色譜柱初始溫度為80 ℃,以15 ℃/min的升溫速率,達(dá)245 ℃;以10 ℃/min的速率升溫到255 ℃并保留1min;再以1 ℃/min的速率升溫到265 ℃并保留1min,最后以2.5 ℃/min升高到295 ℃并保留2min”。圖1A顯示同分異構(gòu)體苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽難以有效分離。此時(shí)的苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽出峰時(shí)間處于色譜柱以2.5 ℃/min升高到295 ℃的時(shí)間段內(nèi),色譜柱升溫到270 ℃以上后,開(kāi)始出峰。為達(dá)到符合要求的分離效果,將對(duì)應(yīng)出峰時(shí)間段的升溫速率降低,在之前方法基礎(chǔ)上,270 ℃～280 ℃升溫段內(nèi),采用1 ℃/min的較慢升溫速率,出峰結(jié)果見(jiàn)圖1B。圖1B顯示,在改變升溫速率后,苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽依舊難以有效分離,不能定性與定量分析。最后,采用0.5 ℃/min的慢速升溫速率,出峰結(jié)果見(jiàn)圖1C。圖1C分離效果甚至低于圖1B,有出現(xiàn)3個(gè)色譜峰重疊的可能,仍不能滿足定性與定量的要求。

圖1A 常規(guī)升溫速率苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽氣相色譜圖

圖1B 較慢升溫速率苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽氣相色譜圖

圖1C 慢速升溫速率苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽氣相色譜圖

氣相色譜儀升溫速率對(duì)分離度影響的理論中,升溫速率在恒壓控制下,與載氣在柱中流速的比值與分離度成反比。[12]上述案例驗(yàn)證,載氣流速相同條件下,降低升溫速率,比值變小,則分離度應(yīng)該增大。但對(duì)于某些特殊的同分異構(gòu)體,如苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽依舊難以顯著改善分離度,以達(dá)到定性與定量的要求。該實(shí)例所得的色譜圖與張茂升等的研究中存在同等化合物不能有效分離的現(xiàn)象,結(jié)論一致。[11]對(duì)此,引入采用液相色譜儀配備紫外檢測(cè)器對(duì)應(yīng)16種PAHs的檢測(cè),從而比較兩者之間的不同之處。LC與GC的不同之處在于具有高沸點(diǎn)、大分子,熱穩(wěn)定性差的化合物,LC比GC更合適。苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽對(duì)應(yīng)沸點(diǎn)分別為481 ℃與480 ℃,均高于300 ℃。采用液相色譜儀檢測(cè)多環(huán)芳烴,二極管陣列串聯(lián)熒光檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器均可檢測(cè),此處介紹2種檢測(cè)器的原理與不同之處。在實(shí)例中,以島津LC-16配備紫外檢測(cè)器,色譜柱采用C18反相分析柱,型號(hào)：Athena PAHs HPLC Column,規(guī)格：25 cm×4.6 mm×5 μm,以乙腈與超純水作為流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)應(yīng)16種PAHs中苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽截取色譜圖譜見(jiàn)圖2。圖2顯示2種化合物的分離效果明顯優(yōu)于氣相色譜分析法,雖然仍有連峰現(xiàn)象,但總體分離效果較好,分離度達(dá)到基本定性與定量要求。

圖2 苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽液相色譜圖

苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽的特殊性在比較兩種不同色譜分析模式的優(yōu)劣后,更深一步地引入質(zhì)譜分析原理及聯(lián)用優(yōu)勢(shì)。在此基礎(chǔ)上,引入總離子流色譜圖、離子峰、電子電離源等概念。電子電離源在固定70 V電壓的條件下,對(duì)化合物建立的標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù),更有利于化合物的分析與檢索。該實(shí)例中,以美國(guó)安捷倫型號(hào)為8890-7000D,氣相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀,采用單四級(jí)桿模式,色譜柱為美國(guó)安捷倫型號(hào)：DB-5MS,規(guī)格：30 m×0.25 mm×0.25 μm。圖3A為苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽的總離子流色譜圖,其分離度較GC-FID有所提高,但并不優(yōu)于LC的分離度。但此處因?yàn)橛辛俗V庫(kù)可作為參比依據(jù),以不同化合物的質(zhì)譜圖作為定性依據(jù),則相對(duì)于單色譜而言,更加復(fù)雜基質(zhì)的提取液分析也提供了更為精準(zhǔn)的保證。圖3B與3C分別為苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽的質(zhì)譜圖。在兩張質(zhì)譜圖的差異中,更好地定性苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽。

圖3A 苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽總離子流色譜圖

圖3B 苯并(b)熒蒽質(zhì)譜圖

圖3C 苯并(k)熒蒽質(zhì)譜圖

在教研結(jié)合的教學(xué)中,還有一個(gè)重要環(huán)節(jié),針對(duì)儀器操作中出現(xiàn)的故障,進(jìn)行實(shí)例講解。此處引入色譜實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)例中色譜峰漂移的原因,包括載氣受到波動(dòng),引起流速變化;長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)樣引起色譜柱污染與載氣被污染等因素并有效結(jié)合理論進(jìn)行闡述。設(shè)備采用島津GC-2014C配備ECD,色譜柱采用美國(guó)安捷倫型號(hào)DB-1701,規(guī)格為30 m×0.25mm×0.25 μm。對(duì)應(yīng)21種有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)樣品,在綠茶基質(zhì)提取液中的色譜圖與純標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比色譜圖見(jiàn)圖4。圖4A為21種有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖,圖4B為進(jìn)樣兩周后,色譜柱接進(jìn)樣口端受到污染,發(fā)生基質(zhì)提取液出峰滯后漂移現(xiàn)象,不利于準(zhǔn)確定性。通過(guò)陶瓷切割片,切割受污染部分色譜柱,截取長(zhǎng)度為20 cm;并以300 ℃老化色譜柱4 h。圖4C中為截取受污染色譜柱,并老化后的色譜對(duì)比圖。此時(shí),21種有機(jī)氯農(nóng)藥綠茶基質(zhì)提取液與純有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)出峰時(shí)間重疊圖,未發(fā)生峰漂移現(xiàn)象,可用于定性定量。

圖4A 21種有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液氣相色譜圖

圖4B 受污染色譜柱21種有機(jī)氯農(nóng)藥對(duì)比色譜圖 (注：黑線為標(biāo)準(zhǔn)色譜峰,藍(lán)線為綠茶基質(zhì)提取液。)

圖4C 干凈色譜柱21種有機(jī)氯農(nóng)藥對(duì)比色譜圖 (注：黑線為標(biāo)準(zhǔn)色譜峰,紅線為綠茶基質(zhì)提取液。)

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)16種多環(huán)芳烴的不同檢測(cè),對(duì)色譜理論、方式與檢測(cè)器類型的實(shí)例講解,并對(duì)21種有機(jī)氯農(nóng)藥在綠茶基質(zhì)檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)峰漂移現(xiàn)象所產(chǎn)生的故障原因進(jìn)行分析與溯源。存在相關(guān)知識(shí)點(diǎn)疑惑的學(xué)生人數(shù)由講解與操作之前的8-12人降至3-5人,對(duì)教學(xué)成果的優(yōu)化率顯著提高。