關(guān)鍵詞：喹諾酮類抗生素；留蘭香；響應(yīng)；耐受性；隸屬函數(shù)

中圖分類號(hào)：S682.19；X592；X173 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-2043（2024）12-2876-13 doi：10.11654/jaes.2024-0537

抗生素可用于臨床上治療相關(guān)疾病，也可作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加至飼料中。喹諾酮類（Quinolones，QNs）抗生素是臨床上使用的第二大類抗菌藥物，同時(shí)也是常用獸用抗生素之一，其中環(huán)丙沙星（Cipro?floxacin，CIP）、諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）和氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）是最常用的3種。生物體攝入的QNs抗生素中有高達(dá)70%不能被代謝而排出體外[1]，并隨醫(yī)療及城市生活污水、制藥企業(yè)和農(nóng)牧業(yè)廢水等排放至自然水體中。在世界各國(guó)的污水廠中，QNs抗生素也是檢出頻率前五的污染物之一。CIP、OFL、NOR 在各國(guó)污水廠中的檢出頻率較高，同時(shí)也是淡水及海洋環(huán)境最常檢出的QNs抗生素[2]。非洲地區(qū)廢水中QNs 抗生素的檢測(cè)濃度達(dá)50 μg·L^-1，我國(guó)渤海萊州半島、貴州和大連等地檢測(cè)到其濃度達(dá)μg·L^-1數(shù)量級(jí)，大多數(shù)土壤和沉積物環(huán)境介質(zhì)中的含量為μg·kg^-1數(shù)量級(jí)，其中，OFL、CIP 和NOR 在水體和沉積物中最常被檢測(cè)到[3-4]。QNs抗生素對(duì)生態(tài)環(huán)境的潛在危害[5]已成為環(huán)境領(lǐng)域廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。

QNs抗生素對(duì)植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有顯著的毒性效應(yīng)。采用恒溫保濕培養(yǎng)法研究抗生素對(duì)油菜（Brassica campestris）萌發(fā)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，濃度為12.5、25、50、100、200 mg·L^-1的NOR處理均抑制了油菜種子萌發(fā)，200 mg·L^-1處理時(shí)種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)相較于對(duì)照組均下降了13%，根長(zhǎng)抑制率達(dá)60%[6]。實(shí)驗(yàn)證明CIP 濃度超過(guò)1 mg·L^-1 時(shí)，黑麥草（Loliumperenne）種子的發(fā)芽率低于對(duì)照組，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)相對(duì)于對(duì)照組分別下降50%和30%[7]。類似地，在0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 mg·L^-1 OFL脅迫紫花苜蓿（Medicago sativa）種子萌發(fā)的毒性試驗(yàn)中，處理組的發(fā)芽率均低于對(duì)照組[8]。QNs 抗生素進(jìn)入農(nóng)田系統(tǒng)后，也會(huì)影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)和繁殖。研究表明，0～2mg·L^-1 CIP脅迫下，玉米（Zea mays）的H2O2水平和抗氧化酶活性顯著提高，形態(tài)生理改變，種子產(chǎn)量降低[9]。2 mg·L^-1的OFL處理能夠抑制洋蔥（Allium fistu?losum）的光合作用，破壞葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，使葉片黃化[10]。韭菜（Allium tuberosum）在NOR 含量為10mg·kg^-1和100 mg·kg^-1的土壤中培養(yǎng)時(shí)，其葉片中細(xì)胞形狀相對(duì)于對(duì)照組都發(fā)生了明顯變化，類囊體在低密度區(qū)域膨脹，淀粉粒數(shù)量明顯增加，葉片和根中富集的抗生素含量可達(dá)0.88 mg·kg^-1和0.22 mg·kg^-1[11]。QNs抗生素單一及復(fù)合脅迫的毒性也不同，CIP、恩諾沙星、左氧氟沙星及其復(fù)合物對(duì)小麥（Triticum aesti?vum）的短期（20 d）毒性研究發(fā)現(xiàn)，高濃度抗生素復(fù)合物（100 mg·L^-1和300 mg·L^-1）相較于單一脅迫，會(huì)顯著提高脂質(zhì)過(guò)氧化物含量及抗氧化酶活性，抑制小麥幼苗的生長(zhǎng)[12]。可見(jiàn)，QNs抗生素能抑制植物種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，且單一及復(fù)合抗生素對(duì)植物的毒性效應(yīng)存在差異。QNs抗生素在農(nóng)村生活污水處理廠進(jìn)水中的檢出濃度普遍較高（可達(dá)65 μg·L^-1）[13]。對(duì)我國(guó)各地區(qū)的水、土壤和沉積物中抗生素進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，QNs抗生素的檢測(cè)濃度可達(dá)數(shù)十微克每升或每千克[14]，且環(huán)境中QNs抗生素的存在形式并非某一特定種類，而往往是多種抗生素復(fù)合存在，隨著QNs抗生素的大量使用，有必要開(kāi)展mg·L^-1數(shù)量級(jí)水平的QNs抗生素單一及復(fù)合污染的生態(tài)毒性研究。

留蘭香（Mentha spicata L.）為隸屬于唇形科薄荷屬的多年生芳香草本植物，廣泛用于室內(nèi)觀賞和城市綠化，具有極高的藥用、食用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[15]。留蘭香原產(chǎn)非洲西北部群島和歐洲南部區(qū)域，在我國(guó)主要栽培于江蘇、安徽、四川、貴州等地區(qū)[16]。留蘭香喜濕潤(rùn)，其生長(zhǎng)初期和中期對(duì)水分的需求量較大[17]，因此，灌溉用水及土壤中的QNs抗生素會(huì)影響其正常生長(zhǎng)。污染物進(jìn)入環(huán)境后，不僅能影響植物正常生長(zhǎng)，還會(huì)嚴(yán)重影響芳香草本植物的產(chǎn)量和品質(zhì)[18-19]，因此，評(píng)估QNs抗生素的生態(tài)毒性，對(duì)留蘭香生態(tài)種植的順利開(kāi)展具有指導(dǎo)意義。目前，對(duì)留蘭香的生態(tài)毒性研究主要圍繞溫度、水分等自然因素，以及鹽脅迫對(duì)留蘭香植株生長(zhǎng)及品質(zhì)的影響[20-21]，也有研究表明土霉素能夠影響留蘭香莖的生長(zhǎng)、降低葉綠素的含量[22]，但QNs抗生素單一及復(fù)合脅迫對(duì)留蘭香種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響及植物耐受情況尚不明確。因此，有必要就抗生素對(duì)留蘭香的生態(tài)毒性效應(yīng)做進(jìn)一步研究。綜上，本文研究典型QNs抗生素CIP、NOR、OFL對(duì)留蘭香種子萌發(fā)指標(biāo)和生長(zhǎng)特性的影響，旨在為抗生素的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用發(fā)育正常的留蘭香（Mentha spicata L.）種子（千粒質(zhì)量約為0.08 g）由宿遷綠芃種業(yè)科技有限公司提供，于2023年10月采自甘肅酒泉，暫存于冰箱中4 ℃低溫保存。CIP、NOR和OFL來(lái)自上海麥克林生化科技股份有限公司，純度為99%。

1.2 種子萌發(fā)試驗(yàn)

挑選大小均一且飽滿的留蘭香種子，經(jīng)75% 乙醇消毒15 min后，用無(wú)菌水清洗3～5次去除乙醇，取出并吸干其多余的水分，備用。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)中留蘭香種子對(duì)QNs抗生素的耐受濃度并結(jié)合文獻(xiàn)[23-25]，配制CIP、NOR、OFL單一及三者等質(zhì)量復(fù)合溶液，濃度為0.1、1、5、10、20 mg·L^-1，以無(wú)菌蒸餾水為對(duì)照（CK）。參考國(guó)際種子檢測(cè)協(xié)會(huì)（ISTA）的種子監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，采用保溫保濕培育法進(jìn)行試驗(yàn)。取墊有2層濾紙的直徑9 cm培養(yǎng)皿，用鑷子將50粒留蘭香種子均勻地排列在培養(yǎng)皿中，分別加入5 mL不同濃度的CIP、NOR、OFL及復(fù)合溶液，每個(gè)處理重復(fù)3次，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱，設(shè)置溫度為（25±1）℃、光周期為12 h光照/12 h黑暗，光照強(qiáng)度為2 000 lx。發(fā)芽期間每隔2 d更換一次濾紙、沖洗培養(yǎng)皿，隨機(jī)改變留蘭香種子在培養(yǎng)皿中的位置，并添加抗生素溶液保持濕潤(rùn)[26-28]，及時(shí)剔除霉變的種子，觀察并記錄其發(fā)芽情況（以胚根長(zhǎng)于種子1/2作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)）。CIP、NOR和OFL在培養(yǎng)過(guò)程中可能發(fā)生光降解，考慮實(shí)際抗生素濃度變化對(duì)種子萌發(fā)的影響，用250 mL錐形瓶盛裝試驗(yàn)濃度的抗生素溶液置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)中添加的溶液為同時(shí)放入培養(yǎng)箱內(nèi)錐形瓶中的抗生素溶液。

1.3 分析方法

1.3.1 種子萌發(fā)指標(biāo)的測(cè)定

在留蘭香萌發(fā)試驗(yàn)中，將種子放入人工培養(yǎng)箱后的24 h為試驗(yàn)第1天，以連續(xù)3 d種子發(fā)芽數(shù)不再增加視為發(fā)芽結(jié)束（本試驗(yàn)為發(fā)芽14 d結(jié)束），根據(jù)每天發(fā)芽的種子數(shù)，計(jì)算種子的發(fā)芽百分比。計(jì)算培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的日平均發(fā)芽率、平均發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等。日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到最高峰時(shí)作為發(fā)芽勢(shì)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)[29]，CIP和NOR處理時(shí)以種子萌發(fā)的第4天、OFL和復(fù)合處理時(shí)以第5天的種子發(fā)芽百分比為發(fā)芽勢(shì)（GP）。

式中：n 指全部正常發(fā)芽的種子數(shù)；N 指供試種子總數(shù)；Gt 指第t 天發(fā)芽的種子數(shù)；Dt 指相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；RL 指胚根長(zhǎng)；Gd 指總發(fā)芽天數(shù)。

脅迫指數(shù)為正值，表示處理組指標(biāo)值小于對(duì)照組，該指標(biāo)被抑制，反之表示對(duì)該指標(biāo)起促進(jìn)作用，其絕對(duì)值大小反映影響程度?？伤苄灾笖?shù)反映植物對(duì)生境的適應(yīng)能力，數(shù)值越大，表明適應(yīng)能力越強(qiáng)[30-31]。

1.3.2 幼苗形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定

培養(yǎng)完成后取出萌發(fā)后的幼苗，用濾紙吸干其表面水分，用直尺測(cè)定胚根長(zhǎng)和胚芽長(zhǎng)，稱量其鮮質(zhì)量，計(jì)算胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)和鮮質(zhì)量的抑制率。構(gòu)建CIP、NOR、OFL和復(fù)合物的濃度與種子胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)和鮮質(zhì)量的抑制率的回歸方程，當(dāng)指標(biāo)的抑制率為50%時(shí)，對(duì)應(yīng)的抗生素濃度即為該種抗生素對(duì)胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)和鮮質(zhì)量的半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）。

胚根長(zhǎng)（RL）、胚芽長(zhǎng)（GL）、鮮質(zhì)量（FW）抑制率=（對(duì)照組-處理組）/對(duì)照組×100% （9）

1.3.3 留蘭香對(duì)QNs抗生素耐受性的評(píng)價(jià)

根據(jù)模糊數(shù)學(xué)原理，利用隸屬函數(shù)法對(duì)留蘭香試驗(yàn)種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算并排序，綜合評(píng)價(jià)QNs抗生素脅迫下種子的耐受性情況[26]。利用公式（10）和公式（11）[32-33]分別計(jì)算留蘭香各指標(biāo)（發(fā)芽勢(shì)、日平均發(fā)芽率、平均發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)和鮮質(zhì)量）在CIP、NOR和OFL單一及復(fù)合脅迫下的具體隸屬函數(shù)值μ（Xij），根據(jù)測(cè)定指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，計(jì)算該濃度下所有指數(shù)的平均隸屬函數(shù)值（AMF）。AMF 值越大表示種子在萌發(fā)期對(duì)QNs抗生素的綜合耐受性越強(qiáng)，反之更弱。按灰色系統(tǒng)理論要求[34]，將留蘭香種子對(duì)抗生素的綜合耐受性和不同QNs抗生素脅迫下8個(gè)指標(biāo)視為一個(gè)整體，即灰色系統(tǒng)。將綜合耐受性指數(shù)作為參考數(shù)列（母序列），各指標(biāo)原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的值作為比較數(shù)列（子序列），建立灰色系統(tǒng)，計(jì)算各指標(biāo)與其綜合耐受性指數(shù)的關(guān)聯(lián)度并排序（關(guān)聯(lián)序），指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度值越大，即表示該指標(biāo)與綜合耐受性的關(guān)聯(lián)密切程度越高[35]。平均隸屬函數(shù)值和灰色關(guān)聯(lián)度計(jì)算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，SPSS 27 進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Pearson 相關(guān)性分析，利用LSD法進(jìn)行多重比較，用Origin 2021擬合回歸曲線、作圖。使用SmartPLS 4.1對(duì)QNs抗生素對(duì)留蘭香萌發(fā)期指標(biāo)的影響建立偏最小二乘結(jié)構(gòu)方程模型（PLS-SEM）。

2 結(jié)果與分析

CIP、NOR和OFL單一及復(fù)合脅迫下留蘭香培養(yǎng)14 d后的生長(zhǎng)狀況如圖1所示，各處理組中幼苗的生長(zhǎng)情況差異明顯：OFL及復(fù)合脅迫下生長(zhǎng)良好，幼根更粗；CIP和NOR處理組幼苗葉片面積小，葉發(fā)黃，幼根細(xì)，長(zhǎng)勢(shì)不良。

2.1 單一及復(fù)合QNs抗生素對(duì)留蘭香種子發(fā)芽的影響

CIP、NOR和OFL單一及復(fù)合脅迫對(duì)留蘭香種子萌發(fā)的影響如圖2所示。各處理組中，留蘭香均在第2天發(fā)芽，說(shuō)明單一及復(fù)合脅迫未改變種子初始萌發(fā)時(shí)間。QNs抗生素也不影響留蘭香萌發(fā)結(jié)束時(shí)間，第12天后留蘭香種子發(fā)芽數(shù)基本不再增加，但日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到最高峰的時(shí)間不同。CIP和NOR處理時(shí)第4天發(fā)芽種子數(shù)最多，OFL和復(fù)合處理時(shí)第5天的種子發(fā)芽數(shù)最多。

2.2 單一及復(fù)合QNs抗生素對(duì)留蘭香種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

由表1可知，高濃度的CIP和OFL能夠顯著抑制留蘭香種子的日平均發(fā)芽率（Plt;0.01），20 mg·L^-1處理時(shí)脅迫指數(shù)分別為0.21和0.31；但10～20 mg·L^-1 NOR和復(fù)合處理對(duì)日平均發(fā)芽率的抑制作用不顯著。所有萌發(fā)指標(biāo)中，平均發(fā)芽時(shí)間的可塑性指數(shù)變化最大（0.040～0.642），即留蘭香的平均發(fā)芽時(shí)間對(duì)不同QNs的響應(yīng)不同。0.1 mg·L^-1 QNs處理時(shí)均能縮短平均發(fā)芽時(shí)間，20 mg·L^-1 CIP和OFL能顯著縮短平均發(fā)芽時(shí)間，而20 mg·L^-1 NOR和復(fù)合處理則顯著延長(zhǎng)平均發(fā)芽時(shí)間（Plt;0.05）。高濃度QNs抗生素對(duì)留蘭香發(fā)芽勢(shì)的影響不同，0.1 mg·L^-1 CIP能顯著提高留蘭香發(fā)芽勢(shì)（脅迫指數(shù)為-0.55，Plt;0.01），20 mg·L^-1 NOR 和OFL處理極顯著降低發(fā)芽勢(shì)（脅迫指數(shù)均為0.59，Plt;0.01），但20 mg·L^-1 CIP和復(fù)合處理時(shí)的發(fā)芽勢(shì)高于CK組。

低濃度的CIP和NOR處理能顯著提高留蘭香的發(fā)芽指數(shù)，0.1 mg·L^-1處理時(shí)發(fā)芽指數(shù)最高（脅迫指數(shù)分別為-0.17和-0.20，Plt;0.01）；20 mg·L^-1脅迫下，除OFL顯著降低留蘭香發(fā)芽指數(shù)（脅迫指數(shù)為0.38）外，其他處理對(duì)留蘭香發(fā)芽指數(shù)均無(wú)顯著抑制作用。留蘭香的所有萌發(fā)指標(biāo)中，活力指數(shù)的可塑性指數(shù)變化最小（范圍為0.732～0.863），說(shuō)明留蘭香的活力指數(shù)對(duì)QNs 的耐受性差別不大?；盍χ笖?shù)隨著CIP 和NOR濃度的增加先升后降，0.1 mg·L^-1處理時(shí)發(fā)芽指數(shù)最高（脅迫指數(shù)分別為-0.32和-0.36，Plt;0.01）；OFL和復(fù)合處理時(shí)，活力指數(shù)隨濃度的增加而逐漸降低，20 mg·L^-1處理時(shí)活力指數(shù)的抑制程度最高（脅迫指數(shù)分別為0.86和0.73）。通過(guò)計(jì)算留蘭香萌發(fā)指標(biāo)的可塑性指數(shù)比較各萌發(fā)指標(biāo)的可塑性程度，萌發(fā)可塑性指數(shù)大小為OFLgt;CIPgt;復(fù)合gt;NOR。

2.3 單一及復(fù)合QNs抗生素對(duì)留蘭香幼苗生長(zhǎng)的影響

CIP和NOR對(duì)留蘭香胚根長(zhǎng)和胚芽長(zhǎng)的影響如圖3A 和圖3B 所示，0.1 mg·L^-1處理均能促進(jìn)留蘭香種子胚根的生長(zhǎng)；較于CK 組，1～20 mg·L^-1處理均能顯著抑制留蘭香種子胚根的生長(zhǎng)（Plt;0.05），且濃度越高抑制作用越強(qiáng)。試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)OFL和復(fù)合處理均能抑制留蘭香胚根的生長(zhǎng)，且濃度越高抑制作用越大，20 mg·L^-1 OFL和復(fù)合脅迫下胚根長(zhǎng)較CK組分別下降了78%和73%（圖3C和圖3D）。不同濃度的QNs抗生素對(duì)留蘭香胚芽的作用不同。5 mg·L^-1 CIP極顯著促進(jìn)胚芽的生長(zhǎng)（Plt;0.01），而其他濃度的CIP對(duì)留蘭香種子胚芽的生長(zhǎng)均無(wú)顯著作用（Pgt;0.05）；NOR對(duì)留蘭香種子胚芽呈低促高抑的效應(yīng)，0.1 mg·L^-1 NOR促進(jìn)留蘭香種子胚芽的生長(zhǎng)，隨濃度升高對(duì)胚芽的抑制作用增強(qiáng)；0.1～10 mg·L^-1 復(fù)合處理時(shí)能促進(jìn)留蘭香種子胚芽的生長(zhǎng)，而20 mg·L^-1 處理抑制了留蘭香種子胚芽的生長(zhǎng)。0.1～5 mg·L^-1 OFL能抑制留蘭香種子胚芽的生長(zhǎng)，而10～20 mg·L^-1 處理能促進(jìn)留蘭香種子胚芽的生長(zhǎng)。

如圖4所示，相較于CK組，0.1 mg·L^-1 CIP和復(fù)合處理對(duì)留蘭香鮮質(zhì)量無(wú)顯著抑制作用，而高濃度處理時(shí)能抑制留蘭香鮮質(zhì)量，20 mg·L^-1處理時(shí)鮮質(zhì)量較CK極顯著降低（Plt;0.01）。NOR和OFL處理時(shí)鮮質(zhì)量整體呈增加趨勢(shì)，且處理濃度分別為0.1 mg·L^-1和10mg·L^-1時(shí)鮮質(zhì)量最大。

留蘭香各形態(tài)指標(biāo)對(duì)QNs抗生素的敏感度不同，通過(guò)QNs抗生素脅迫留蘭香種子胚根、胚芽和鮮質(zhì)量的生長(zhǎng)抑制率擬合回歸方程計(jì)算IC50（表2）。QNs抗生素濃度對(duì)胚根長(zhǎng)抑制率回歸方程的相關(guān)系數(shù)（R²）均大于0.9，相關(guān)性好，IC₅₀值大小排序?yàn)镺FLNORgt;復(fù)合gt;CIP。胚芽長(zhǎng)和鮮質(zhì)量的IC₅₀值較大，無(wú)法通過(guò)回歸方程計(jì)算，胚根長(zhǎng)可作為QNs抗生素對(duì)留蘭香生態(tài)毒性的敏感指標(biāo)。留蘭香萌發(fā)期各形態(tài)指標(biāo)的可塑性指數(shù)大小為復(fù)合（1.449）gt;OFL（1.374）gt;NOR（1.124）gt;CIP（0.849）。萌發(fā)期各指標(biāo)的累計(jì)可塑性指數(shù)大小為OFL（4.448）gt;復(fù)合（3.468）gt;CIP（3.071）gt;NOR（3.038）。

2.4 留蘭香不同指標(biāo)與濃度間及各指標(biāo)間的相關(guān)性和PLS-SEM分析

如圖5所示，留蘭香種子的活力指數(shù)、胚根長(zhǎng)與QNs抗生素濃度極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01），線性關(guān)系良好（| r |gt;0.6）。除CIP處理外，其他處理的胚芽長(zhǎng)與濃度顯著相關(guān)（Plt;0.05）。OFL處理下與濃度相關(guān)的指標(biāo)最多，該處理下發(fā)芽指數(shù)、胚根長(zhǎng)與濃度極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01），胚芽長(zhǎng)與濃度顯著正相關(guān)（Plt;0.05）。各處理組中日平均發(fā)芽率與平均發(fā)芽時(shí)間均呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01）。

PLS-SEM探究QNs抗生素對(duì)留蘭香種子的潛在變量（萌發(fā)指標(biāo)和幼苗形態(tài)指標(biāo)）影響發(fā)現(xiàn)，QNs抗生素濃度對(duì)留蘭香種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有顯著負(fù)效應(yīng)，且對(duì)萌發(fā)的抑制程度大于幼苗生長(zhǎng)，萌發(fā)指標(biāo)與形態(tài)指標(biāo)呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01）（圖6）。該模型共線性指數(shù)（VIF）均小于10，不存在共線性問(wèn)題，區(qū)別效度（Discriminant validity）中HTMT 指數(shù)均小于0.90，模型擬合程度較好，結(jié)果可信。

2.5 QNs 抗生素脅迫下留蘭香的耐受性及各指標(biāo)與耐受性的關(guān)聯(lián)度分析

指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值可綜合評(píng)價(jià)留蘭香萌發(fā)期對(duì)QNs 抗生素耐受性大?。ū?），0.1 mg·L^-1 CIP、0.1 mg·L^-1 NOR、CK組OFL和5 mg·L^-1復(fù)合處理時(shí)指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值最大，耐受性最高；綜合各平均隸屬函數(shù)值，比較不同QNs抗生素的綜合處理耐受性大小為OFLgt;復(fù)合gt;CIPgt;NOR。隸屬函數(shù)方法評(píng)價(jià)結(jié)果與可塑性指數(shù)法評(píng)價(jià)結(jié)果一致，進(jìn)一步解釋了圖1各處理組生長(zhǎng)情況的差異，QNs抗生素對(duì)留蘭香的毒性為OFLlt;復(fù)合

利用灰色關(guān)聯(lián)度分析法研究各指標(biāo)與對(duì)QNs抗生素綜合耐受度的關(guān)聯(lián)程度，各QNs抗生素處理組的指標(biāo)與綜合耐受關(guān)聯(lián)度大小順序不同，關(guān)聯(lián)度最高的5個(gè)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度值均大于0.68（圖7A）。綜合各指標(biāo)QNs抗生素耐受性關(guān)聯(lián)度的主成分分析可知，留蘭香對(duì)QNs抗生素綜合耐受性的影響主要與日平均發(fā)芽率、活力指數(shù)、胚根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和胚芽長(zhǎng)密切相關(guān)（圖7B）。鑒于前人對(duì)種子萌發(fā)過(guò)程中耐受性的評(píng)價(jià)方法，可將發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和胚芽長(zhǎng)作為抗生素耐受性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)。

3 討論

3.1 QNs 抗生素濃度對(duì)留蘭香種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

抗生素對(duì)種子萌發(fā)的影響存在“低濃度下促進(jìn)和高濃度下抑制”的雙重效應(yīng)[36-37]。植物種子在萌發(fā)過(guò)程中受到污染物的影響時(shí)，其可通過(guò)自身代謝，防止、降低或修復(fù)由逆境造成的傷害[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度CIP和NOR處理促進(jìn)發(fā)芽，此時(shí)留蘭香種子的萌發(fā)及形態(tài)指標(biāo)的響應(yīng)變化，有助于其對(duì)QNs抗生素耐受性的提高，這與其他類抗生素脅迫植物種子萌發(fā)的結(jié)果一致[39-40]。造成低濃度促進(jìn)現(xiàn)象的原因可能是低濃度的污染脅迫可提高胚的生理活性，促進(jìn)萌發(fā)[41]；也可能是因?yàn)橹参锎藭r(shí)產(chǎn)生的γ-氨基丁酸（GABA）可增強(qiáng)α-淀粉酶活性，加速可溶性糖和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)生，為種子萌發(fā)提供能量，增強(qiáng)種子活力，為后續(xù)幼苗的生長(zhǎng)奠定基礎(chǔ)[42]。

當(dāng)抗生素濃度在植物種子體內(nèi)的積累超出其生理耐受性時(shí)，高濃度的抗生素會(huì)抑制淀粉酶、蛋白酶的活性[43]，同時(shí)抑制種子內(nèi)儲(chǔ)藏的淀粉和蛋白質(zhì)的分解，使活性氧清除系統(tǒng)被破壞，保護(hù)酶系統(tǒng)失衡，抑制胚芽和胚根的生長(zhǎng)，使幼苗生長(zhǎng)受到抑制[33]。

3.2 QNs 抗生素種類對(duì)留蘭香種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

不同種類QNs抗生素對(duì)留蘭香種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響也不同。種皮在種子萌發(fā)過(guò)程中對(duì)QNs抗生素的阻礙程度的差異，與QNs抗生素理化性質(zhì)有關(guān)。有研究表明，脂水分配系數(shù)（lg Kow）可能是影響抗生素植物毒性的最重要因素，其次是相對(duì)分子質(zhì)量（Molecular mass，MW）[44-45]。本研究表明，3種QNs抗生素對(duì)留蘭香的毒性大小為NORgt;CIPgt;OFL，這與閆嘉寧等[46]關(guān)于NOR、CIP和OFL對(duì)蛋白核小球藻的毒性研究結(jié)果一致。QNs抗生素的毒性與各自的lg Kow正相關(guān)，而與MW 負(fù)相關(guān)。NOR 結(jié)構(gòu)中含有脂肪鏈烴（疏水性官能團(tuán)乙基），比CIP和OFL具有更高的疏水性和吸附系數(shù)[2]，從而增加了與植物根細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)，因此在培養(yǎng)過(guò)程中可能更易吸附在根上，抑制根的生長(zhǎng)。研究表明，親水性有機(jī)外源物（lg K_ow 1～4）很容易被根部吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)[47]，而QNs 抗生素的lg K_ow通常小于1，很難在植物組織中轉(zhuǎn)運(yùn)[48]。種皮在種子的萌發(fā)過(guò)程中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用，可避免抗生素脅迫對(duì)種子發(fā)芽產(chǎn)生的不利影響，留蘭香種子的種皮對(duì)QNs抗生素阻礙作用的差異導(dǎo)致QNs抗生素毒性的不同。QNs抗生素脅迫下萌發(fā)及形態(tài)指標(biāo)的可塑性指數(shù)增加，可能是植物通過(guò)各指標(biāo)水平提高達(dá)到補(bǔ)償?shù)淖饔?，以維持自身正常生長(zhǎng)，提高對(duì)QNs抗生素的耐受程度。本研究初步探索了QNs抗生素單一及復(fù)合形式對(duì)留蘭香種子萌發(fā)的毒性效應(yīng)，結(jié)果顯示復(fù)合處理的生態(tài)毒性介于單一脅迫之間。3種抗生素的毒性相互作用類型與變化趨勢(shì)和抗生素混合體系組分濃度比、濃度范圍和種類有關(guān)[46]。

4 結(jié)論

（1）環(huán)丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NOR）脅迫對(duì)留蘭香的日平均發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚根長(zhǎng)等指標(biāo)存在低促高抑的雙重效應(yīng)，喹諾酮類抗生素對(duì)萌發(fā)指標(biāo)影響程度大于幼苗形態(tài)指標(biāo)；胚根長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度小于胚芽長(zhǎng)和鮮質(zhì)量，可作為對(duì)留蘭香生態(tài)毒性的敏感指標(biāo)。

（2）各指標(biāo)與喹諾酮類抗生素濃度的相關(guān)程度不同，活力指數(shù)和胚根長(zhǎng)與濃度極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01），氧氟沙星（OFL）脅迫下與濃度相關(guān)的指標(biāo)最多。

（3）留蘭香對(duì)喹諾酮類抗生素的耐受性大小為OFLgt;復(fù)合gt;CIPgt;NOR。留蘭香5 項(xiàng)指標(biāo)與耐受性密切相關(guān)，關(guān)聯(lián)度大小為日平均發(fā)芽率gt;活力指數(shù)gt;胚根長(zhǎng)gt;鮮質(zhì)量gt;胚芽長(zhǎng)，發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和胚芽長(zhǎng)可作為留蘭香對(duì)抗生素耐受性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)。