關(guān)鍵詞：重金屬；Cd；生物吸附；微生物修復(fù)；轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號：X172 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）12-2889-12 doi：10.11654/jaes.2024-0017

隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，土壤中重金屬污染日趨嚴重，在所有重金屬污染中，鎘（Cd）污染尤為突出[1]。土壤Cd暴露不僅會影響作物產(chǎn)量、質(zhì)量和食品安全，還會引發(fā)人體骨骼軟化、肝腎損害、神經(jīng)衰弱等多種健康問題，如何修復(fù)Cd污染土壤一直是科學(xué)界重點關(guān)注的課題[2-3]。微生物修復(fù)因具有成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注[4]，其主要是利用微生物菌劑來吸附、沉淀或轉(zhuǎn)化土壤中的重金屬，進而改善土壤質(zhì)量，降低動植物攝入風(fēng)險，促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。大量研究表明，微生物修復(fù)在去除土壤重金屬方面具有巨大潛力[5-7]。

不同微生物因自身結(jié)構(gòu)和功能的差異，對重金屬的吸附能力和機制也不同。例如：Pseudomonas sp.DC-B3對Cd的吸附過程符合Langmuir模型和準二級動力學(xué)模型，且吸附效果受時間、Cd²⁺初始濃度、pH、溫度和菌體劑量的影響[8]；Escherichia coli，Bacillus subtilis和Saccharomyces cerevisiae 對Cd²⁺的主要吸附機制為離子交換[9]；Burkholderia sp. DF3-1則主要通過胞內(nèi)積累和胞外吸附作用達到對Cd²⁺的去除[10]。菌體狀態(tài)也會影響其吸附能力，如Rhizobium sp. W33的活菌吸附劑和菌體烘干吸附劑對Cd²⁺的最大吸附量分別為36.98mg·g^-1和25.65 mg·g^-1 [11]。微生物往往通過阻止重金屬離子進入其細胞、促進重金屬離子外排、胞內(nèi)螯合與隔離或通過調(diào)控相關(guān)基因的表達等來抵抗重金屬的脅迫。例如：微生物通過分泌胞外聚合物（Extracellu?lar polymeric substances，EPS）來結(jié)合Cd²⁺，從而阻礙其進入細胞，以此應(yīng)對Cd²⁺的脅迫[12]；Chen等[13]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，Staphylococcus equorum 受Cd²⁺脅迫后11個與Cd抗性或Cd轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因表達上調(diào)，說明其通過調(diào)控相關(guān)基因的表達來抵抗Cd²⁺脅迫；Wang 等[14]研究發(fā)現(xiàn)Enterobacter ludwigii LY6 的氧化還原活性和轉(zhuǎn)運等功能與其Cd耐受性和吸附能力緊密相關(guān)，微生物可通過激活胞內(nèi)解毒機制減輕Cd²⁺對細胞的毒害。本課題組前期從重金屬污染土壤中分離得到幾株Cd抗性菌株，經(jīng)鑒定分屬于3個菌屬，即寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.）、無色桿菌屬（Achromobacter sp.）和葡萄球菌屬（Staphylococcussp.），初步研究表明它們對Cd²⁺具有良好的去除能力，并對Cd污染土壤表現(xiàn)出良好的修復(fù)潛能，生物吸附和沉淀作用可能是它們?nèi)コ鼵d²⁺的主要機制[15]，但其吸附特性和抗Cd機理仍需進一步探究。

本實驗選擇前期篩選獲得的3 株Cd 抗性菌株Stenotrophomonas sp. Cd-2、Achromobacter sp. Cd-3 和Staphylococcus sp. Cd-7為研究對象，將其制備成失活的菌體吸附劑，分析了其對Cd²⁺的吸附特性，并基于EPS含量分析，選擇菌株Cd-3通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了其受Cd²⁺脅迫后基因表達譜差異特征，并對其抗Cd機制進行了探討。本研究結(jié)果以期為土壤Cd污染的微生物修復(fù)提供功能菌株和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以前期鑒定的Cd 抗性菌株Stenotrophomonas sp.Cd -2、Achromobacter sp. Cd-3 和Staphylococcus sp.Cd-7為研究對象[15]。

Cd²⁺母液配制：CdCl₂·5H₂O（gt;99%，北京浩克科技有限公司），用無菌水配成500 mg·L-1的Cd²⁺貯備液，備用。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：將牛肉浸粉3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g 加蒸餾水至1 L，pH 調(diào)節(jié)為7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基需另加1.5%的瓊脂后滅菌。

吸附劑的制備：活化菌株，挑取單菌落接種于滅菌后的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r·min^-1振蕩培養(yǎng)36 h。4 ℃、9 000 r·min^-1離心15 min，收集菌體，滅菌水洗滌3次。120 ℃滅菌后置于70 ℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量，研磨制備成吸附劑備用[16]。

1.2 菌體吸附能力初步分析

取0.02g吸附劑，置于10 mL含100 mg·L-1Cd²⁺的錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH 至7.0，30 ℃、140 r·min^-1 振蕩24h，4 ℃、9000 r·min^-1離心15 min，收集上清液。以不加菌體吸附劑為對照。每個處理設(shè)3次重復(fù)。采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES，Aglient5110）測定上清液中的Cd²⁺濃度，分別通過公式1 和公式2計算菌體吸附劑對Cd²⁺的吸附率（R）和吸附量（q）[17]：

1.6.2測序數(shù)據(jù)處理

首先對下機數(shù)據(jù)（raw date）進行質(zhì)控，過濾掉帶有測序接頭*（adapter）和低質(zhì)量的reads，得到cleanreads。分別利用Bowtie2軟件和DESeq2軟件完成比對分析和差異基因篩選[22]，以FDR（False Discovery"Rate）lt;0.05和|log2（fold change）|≥1作為篩選的關(guān)鍵指標。對挑選的差異基因進行基因本體論（Gene ontolo?gy，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝注釋，并進行分析。

1.7 統(tǒng)計分析

采用SPSS 26.0進行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan檢驗。使用Origin 2021進行圖形繪制。所有結(jié)果均為3次測量的平均值±標準差。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌體吸附能力初步分析

圖1 為Cd²⁺初始濃度為100mg·L^-1 時，3株菌對Cd²⁺的吸附效果。分析表明，處理24 h 后，3 株菌對Cd²⁺的吸附率均達到90%以上。與對照相比，經(jīng)菌體吸附劑處理后，溶液中Cd²⁺濃度顯著降低。目前，耐受Cd的微生物較多，與部分耐Cd菌株相比，本實驗中3株菌對Cd²⁺具有良好的吸附能力（表1），可以推測其在Cd污染土壤修復(fù)中有較大潛力。

2.2 不同處理條件對菌體吸附Cd²⁺能力的影響

2.2.1 pH

不同pH 對各菌株吸附Cd²⁺的影響如圖2（a）所示。分析顯示，當(dāng)pH為5.0時，菌體對Cd²⁺的吸附量最小（37.01%～44.81%）。隨著pH升高，菌株對Cd²⁺的吸附率顯著升高。當(dāng)pH 較低時，溶液中的H+會和Cd²⁺發(fā)生競爭吸附，菌體吸附劑質(zhì)子化程度變高，對Cd²⁺斥力增大，抑制了Cd²⁺的靠近[24]。隨著pH 升高，H⁺濃度逐漸降低，菌體表面暴露出更多負電荷官能團，從而有利于Cd²⁺被吸附到細胞表面[25]。當(dāng)pH 為7.0～9.0時，3株菌對Cd²⁺的吸附率均達88% 以上，這表明3株菌有良好的pH耐受性?？紤]到高pH下溶液中生成氫氧化物沉淀的影響，建議最佳pH取7.0。

2.2.2 溫度

不同溫度對菌株吸附Cd²⁺的影響如圖2（b）所示。分析表明，10 ℃時3株菌對Cd²⁺的吸附率最低（87%～88%）。隨著溫度逐漸升高，吸附率也顯著升高，當(dāng)溫度升至30 ℃時，菌體對Cd²⁺的吸附率均達90%以上。當(dāng)溫度升高，Cd²⁺與細胞位點間動能增加，促進了金屬離子和細胞的結(jié)合[26]。當(dāng)溫度升至40 ℃時，菌株Cd^-2和Cd-7對Cd²⁺的吸附率均有降低，推測可能的原因是溫度過高改變了菌體表面結(jié)構(gòu)，影響了Cd²⁺配合物的穩(wěn)定性，使Cd²⁺容易從菌體表面逃逸到溶液中，導(dǎo)致吸附率降低[27-28]。

2.2.3 處理時間

不同處理時間對菌株吸附Cd²⁺的影響如圖2（c）所示。分析顯示，在前5 min，3株菌對Cd²⁺的吸附率就達到85% 以上，隨時間延長，吸附率持續(xù)上升，到120 min左右趨于平緩。吸附初始，重金屬與菌體細胞壁上的陰離子快速結(jié)合[29]。在之后的60 min內(nèi)，生物菌劑的表面位點依舊充足，可與Cd²⁺充分結(jié)合，因而菌株對Cd²⁺的吸附率呈增長趨勢。隨著吸附位點逐漸飽和，吸附速率逐漸變緩[30]。菌株的吸附率在360min時仍略有升高，但考慮到收益不大，最佳時間選為120 min。

2.2.4 Cd²⁺濃度

不同Cd²⁺濃度對各菌株吸附Cd²⁺的影響如圖3所示。分析表明，隨著初始Cd²⁺濃度升高，3株菌對Cd²⁺的吸附率呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)Cd²⁺濃度在20～100 mg·L^-1時，菌株的吸附效果更好。這是因為在一定濃度范圍內(nèi)，Cd²⁺濃度的增加使Cd²⁺與菌株有效碰撞的概率增高，Cd²⁺在溶液與吸附劑之間的傳質(zhì)推動力增加，故而吸附率升高[31]。當(dāng)Cd²⁺濃度升高至200 mg·L^-1時，3株菌對Cd²⁺的吸附率顯著下降。這是因為菌體表面未被占據(jù)的活性位點和溶液中金屬離子逐漸減少，菌株對Cd²⁺的吸附接近飽和[32]，吸附率開始下降。隨初始Cd²⁺濃度的增加，3株菌吸附量接近線性增長。吸附初始階段，菌體中所有的吸附位點均未被占用，且溶液中Cd²⁺濃度較高，因而產(chǎn)生很強的驅(qū)動力[33]，加上是胞外吸附，細胞壁表面的OH、N H、COO 和CO等官能團以及脂質(zhì)分子與Cd²⁺發(fā)生反應(yīng)[15]，使得吸附量快速升高。

2.2.5吸附劑濃度

不同菌體吸附劑濃度對3 株菌吸附Cd²⁺的影響如圖4所示。隨著菌體濃度增加，菌株Cd-2和Cd-3對Cd²⁺的吸附率顯著升高。隨著菌體濃度升高，細胞表面金屬離子可利用結(jié)合位點增多，故而吸附率升高[34]。相反，Cd-7對Cd²⁺的吸附率顯著下降，這或許是Cd-7的菌體濃度較低時，Cd²⁺能夠充分接觸到菌體表面的結(jié)合位點，位點利用率較高，但隨著菌體濃度的增大，細菌聚集在一起，減少了與Cd²⁺結(jié)合的表面位點，導(dǎo)致Cd-7對Cd²⁺吸附減弱[35]。隨著菌體濃度升高，3株菌的吸附能力顯著降低。首先，隨著菌劑增多，可利用吸附質(zhì)不足以完全覆蓋吸附劑表面的可利用位點[36]，此外，吸附位點對金屬離子的競爭吸附也是一個重要因素[37]，這些原因可能導(dǎo)致了微生物在高生物量濃度下的低吸附能力。

2.3吸附模型

2.3.1等溫吸附

Langmuir 模型常用于單分子層生物吸附，而Freundlich模型則更適用于異質(zhì)吸附[38]。3株菌的吸附模型相關(guān)參數(shù)和擬合曲線見圖5和表2。分析表明，3株菌Langmuir模型的R²均高于Freundlich模型，且除Cd-2外，其余菌株Langmuir模型R2均大于0.9，擬合效果良好。這表明Langmuir模型對3株菌吸附Cd²⁺的解釋相對更可靠，菌體吸附均屬于單分子層吸附。K_L是吸附平衡常數(shù)，用來評估吸附劑與吸附質(zhì)之間的親和力，K_L介于0和1之間表明菌株與Cd²⁺之間具有較強的吸附親和力；K_F 用來評估吸附進行的難易，結(jié)果中的KF較高，說明該吸附過程較易進行。有關(guān)研究證實，n 值在1～10范圍，表明吸附效果良好[39]。

2.3.2吸附動力學(xué)

準一級動力學(xué)基于假設(shè)吸附取決于吸附質(zhì)的擴散，準二級動力學(xué)基于假設(shè)吸附取決于吸附劑和吸附質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)。由圖6和表3可知，3株菌的準二級動力學(xué)模型的R²均高于準一級動力學(xué)，且均達0.999以上，擬合效果良好。通過準二級動力學(xué)擬合得到的最大吸附量更接近于實際測得的吸附量，說明3株菌對Cd²⁺的吸附更符合準二級動力學(xué)模型，可知化學(xué)吸附是3株菌吸附Cd²⁺的限速步驟，吸附機制主要涉及Cd²⁺和菌體表面的官能團絡(luò)合作用[40]。

2.4 抗Cd菌株分泌EPS的不同組分含量變化

EPS是微生物產(chǎn)生的以多糖和蛋白質(zhì)為主的高分子聚合物，當(dāng)微生物處于不良環(huán)境時，其表面EPS增加，結(jié)合重金屬離子以抵抗脅迫[41]。由圖7分析可知，隨時間延長，對照和處理中3株菌的蛋白質(zhì)和多糖總含量顯著降低，這說明菌株在生長初期就分泌較多的EPS適應(yīng)外界環(huán)境，到菌株生長衰亡期，菌株分泌的EPS含量顯著降低。在對照組中，Cd-2、Cd-3和Cd-7 的EPS 含量分別為537.67～1436.96 mg·L^-1、1008.32～3429.14 mg·L^-1和512.68～1315.75 mg·L^-1。處理組中，Cd-2、Cd-3 和Cd-7 的EPS 含量分別為962.05～2575.46 mg·L^-1、1 958.06～4 544.81 mg·L^-1 和843.96～1629.53 mg·L^-1。處理組中EPS含量顯著高于對照，說明3株菌經(jīng)100 mg·L^-1 Cd²⁺處理后會分泌更多的EPS，由此可以推測，過量合成胞外EPS是菌株抵御Cd²⁺脅迫時重要的應(yīng)急手段。處理組中，菌株Cd-2的不可溶性蛋白含量占比最高，說明Cd-2主要通過不可溶性蛋白絡(luò)合Cd²⁺，菌株Cd-3主要通過不可溶性多糖和不可溶性蛋白絡(luò)合Cd²⁺，菌株Cd-7主要通過可溶性蛋白和不可溶性蛋白絡(luò)合Cd²⁺，表明蛋白組分在抵御Cd脅迫中發(fā)揮了更重要的作用，這與孫夢格等[42]的研究結(jié)果相似。

2.5 菌株Cd-3轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析

2.5.1差異基因篩選

轉(zhuǎn)錄組測序（NCBI：PRJNA1052373）共測得46 135 807 raw read pairs，經(jīng)過質(zhì)控，得到46019 557clean read pairs。Q20、Q30 值均大于90%，測序結(jié)果可用于后續(xù)分析。測序共篩選出200個差異表達基因，其中上調(diào)的為102個，下調(diào)的為98個（圖8）。

2.5.2 差異基因KEGG分析

對CK-3 vs Cd-3 的差異基因進行KEGG 注釋。圖9是差異基因的KEGG代謝通路富集分類結(jié)果，在以q 值排序的前20個富集條目里，參與細胞過程的有1條，即鞭毛組裝（Flagellar" assembly）；參與代謝的有16條，其中顯著富集的有1條，即檸檬酸循環(huán)（Citratecycle）；參與遺傳信息處理的有3條，其中2條顯著富集，分別為RNA降解（RNA degradation）和核糖體（Ri?bosome）。此外，還有多個上調(diào)基因注釋在ABC轉(zhuǎn)運（ABC transporters）、群體感應(yīng)（Quorum sensing）和細菌分泌系統(tǒng)（Bacterial secretion system）。

微生物抵抗重金屬的胞內(nèi)作用機制主要是通過轉(zhuǎn)運蛋白的作用將重金屬運出胞外、將重金屬區(qū)隔化或在胞內(nèi)通過氧化還原等化學(xué)反應(yīng)降低重金屬毒性，而這些過程主要依賴氧化還原酶、轉(zhuǎn)運蛋白和谷胱甘肽、金屬硫蛋白等金屬螯合肽的配合。細菌分泌EPS的途徑與ABC 轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)密切相關(guān)，如細菌可以利用細胞內(nèi)儲存的能量ATP進行物質(zhì)的跨膜運輸，其中胞內(nèi)多糖運輸?shù)桨獾囊粭l途徑就是ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運蛋白依賴途徑[43]。本研究中與ABC轉(zhuǎn)運通路相關(guān)基因，如含ATP結(jié)合盒結(jié)構(gòu)域蛋白的編碼基因HV753_RS11670、ABC轉(zhuǎn)運蛋白ATP結(jié)合蛋白的編碼基因HV753_RS17865 和ABC轉(zhuǎn)運蛋白底物結(jié)合蛋白編碼基因HV753_RS16015 受Cd 誘導(dǎo)后均上調(diào)表達。群體感應(yīng)通路相關(guān)基因HV753_RS28695、HV753_RS13535、HV753_RS06150 等也上調(diào)表達。王秋鈺[44]研究發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)與ABC 轉(zhuǎn)運會調(diào)控Vibrioparahaemolyticus 的EPS，促進生物被膜形成。同時，細菌分泌系統(tǒng)中編碼Ⅱ型分泌系統(tǒng)分泌蛋白的基因gspD上調(diào)表達，證明Cd-3可能通過ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)實現(xiàn)Cd脅迫下細胞物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運，提高EPS分泌量，阻礙外界Cd2+進入細胞。

2.5.3差異基因GO分析

為了解差異基因參與的生物學(xué)功能，根據(jù)CK-3vs Cd-3的差異基因結(jié)果進行GO功能注釋，以qlt;0.05視為顯著富集。如圖10所示，生物過程中有9條途徑顯著富集，分別為有機氮化合物代謝過程（Organoni?trogen compound metabolic process）、有機氮化合物生物合成過程（Organonitrogen compound biosyntheticprocess）、酰胺生物合成過程（Amide" biosynthetic pro?cess）、細胞酰胺代謝過程（Cellular amide metabolicprocess）、細胞蛋白質(zhì)代謝過程（Cellular protein meta?bolic process）、肽生物合成過程（Peptide biosyntheticprocess）、肽代謝過程（Peptide metabolic process）、翻譯（Translation）和細胞氨基酸代謝過程（Cellular ami?no acid metabolic process）。分子功能中有3條顯著富集，分別為催化活性-作用于RNA（Catalytic activity，acting on RNA）、核糖體的結(jié)構(gòu)組成（Structural constit?uent of ribosome）和催化活性-作用于tRNA（Catalyticactivity，acting on a tRNA）。而在一些不顯著富集的GO條目里，也注釋著多數(shù)基因，如生物過程的穿膜運輸（Transmembrane transpor）。

MFS（Major facilitator superfamily）運輸?shù)鞍资且活惪缒さ鞍踪|(zhì)家族，MFS運輸?shù)鞍卓赡軈⑴c胞外多糖的運輸[45]。本研究中MFS 運輸?shù)木幋a基因HV753_RS23640上調(diào)表達10倍以上，可能對Cd-3胞外多糖的過量分泌起著重要作用。同時，微生物遇到不良環(huán)境時，會通過調(diào)控參與相關(guān)生物過程的蛋白的表達，使自身適應(yīng)環(huán)境[46]。GO注釋中，參與翻譯過程的轉(zhuǎn)移-信使RNA（tm-RNA）編碼基因ssrA 顯著上調(diào)表達，調(diào)控蛋白質(zhì)合成，以適應(yīng)外界脅迫。Muto等[47]研究發(fā)現(xiàn)在高溫、Cd等脅迫下，枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）生長需要tm-RNA基因（ssrA）的表達，ssrA 轉(zhuǎn)錄增加，表明它參與了細菌的應(yīng)激耐受。這說明Cd-3也會通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)蛋白的表達來應(yīng)對Cd²⁺毒害。

在Cd²⁺脅迫下，GO 注釋涉及的部分與氧化還原相關(guān)的基因上調(diào)表達，如編碼谷胱甘肽過氧化物酶的基因HV753_RS0165。已有研究表明，谷胱甘肽是Cd脅迫下Cd穩(wěn)態(tài)和排毒系統(tǒng)的核心成分[48]。此外，谷胱甘肽作為Cd螯合劑具有實用潛力[49]。當(dāng)Cd²⁺進入菌株細胞后，可能在相關(guān)氧化還原酶的作用下進行螯合或被還原成單質(zhì)，進而降低毒性。

3 結(jié)論

（1）菌株Stenotrophomonas sp. Cd-2、Achromobactersp. Cd-3 和Staphylococcus sp. Cd-7 所制成的烘干菌體吸附劑對Cd²⁺具有良好的吸附能力，吸附過程屬于單分子層吸附，吸附速率受化學(xué)吸附限制。

（2）3株菌可通過提高胞外聚合物分泌量來絡(luò)合Cd²⁺，阻礙Cd²⁺進入細胞，其中蛋白組分發(fā)揮著主要作用。

（3）轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，菌株Cd-3通過調(diào)節(jié)與生長代謝、氧化還原和跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因來抵抗Cd脅迫。