◎ 羅 靜，唐仁勇，易樹敏

（1.四川商務(wù)職業(yè)學(xué)院，四川 成都 611131；2.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106）

近年來，人們對(duì)植物源蛋白質(zhì)的關(guān)注度越來越高，長(zhǎng)期食用富含植物蛋白的食物可降低心血管疾病的發(fā)病率，提高新陳代謝率，增強(qiáng)人體骨骼的強(qiáng)度[1]。大豆具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其蛋白質(zhì)含量為36.49 g/100 g，碳水化合物含量為30.16 g/100 g，多不飽和脂肪酸含量為11.255 g/100 g，鈣含量為277 mg/100 g，此外還含有豐富的鉀、鎂、大豆異黃酮及B 族維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，適用于開發(fā)各類大豆產(chǎn)品，包括肉制品和奶制品的替代物[2]。

腐乳是一種深受消費(fèi)者喜愛，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分的傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，其主要以大豆為原材料，以水、白酒、食鹽和香辛料為輔料，經(jīng)過毛霉、根霉、細(xì)菌等微生物發(fā)酵而成，是我國(guó)四大傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品之一，也是餐桌上一道常見的佐餐食品[3]。目前，我國(guó)腐乳已經(jīng)出口至東南亞、日本、美國(guó)等多個(gè)地區(qū)，受到世界人民的推崇和喜愛。100 g 腐乳中必需氨基酸含量可供成年人一日需要量[4]。腐乳中還含有黃酮、多肽、γ-氨基丁酸等活性成分和多種礦物元素，具有抗氧化、降低人體膽固醇含量、增強(qiáng)人體免疫力及預(yù)防細(xì)胞癌變與老年癡呆癥的作用[5]。

本文對(duì)腐乳的歷史、分類、制作工藝、功能菌種篩選、微生物菌群與風(fēng)味品質(zhì)的關(guān)系以及食用安全性等進(jìn)行了綜述，并結(jié)合腐乳安全隱患因素的控制方法對(duì)未來可控化調(diào)控技術(shù)進(jìn)行展望，目的是促使腐乳生產(chǎn)工藝流程可控化和標(biāo)準(zhǔn)化，為進(jìn)一步提升腐乳品質(zhì)、提升腐乳產(chǎn)業(yè)的安全化生產(chǎn)和推動(dòng)腐乳產(chǎn)業(yè)綠色健康發(fā)展提供基礎(chǔ)支撐。

1 腐乳的歷史、分類和制作工藝

腐乳歷史悠久，風(fēng)味獨(dú)特，滋味鮮美，有“東方奶酪”之稱[6]。腐乳起源于我國(guó)，一千多年前就有關(guān)于腐乳的記載，“干豆腐加鹽成熟后為乳腐”，從魏朝開始，腐乳就成為餐桌上的開胃菜，明清時(shí)期腐乳迅速發(fā)展，生產(chǎn)規(guī)模和技術(shù)不斷提升，李日華的《蓬櫳夜話》和王士楨的《食憲鴻秘》中均有腐乳制作方法的記錄。近代腐乳研究始于1920 年，1928 年開始對(duì)毛霉菌進(jìn)行研究，其后，不斷有學(xué)者對(duì)腐乳品質(zhì)、發(fā)酵菌種、制作方法進(jìn)行探索[7]，并針對(duì)腐乳生產(chǎn)過程中各階段的變化情況進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，逐漸形成成熟的理論體系。

傳統(tǒng)腐乳制作工藝一般包括4 個(gè)步驟[8]。①制作豆腐。將煮沸的豆?jié){通過鹽沉淀制作成豆腐。②毛霉生長(zhǎng)。將豆腐切小塊放置在毛霉適宜生長(zhǎng)的環(huán)境中自然接種，使豆腐塊表面長(zhǎng)滿毛霉。③加輔料腌制。加鹽抑制毛霉生長(zhǎng)，加香辛料提升腐乳的風(fēng)味口感。④密封成熟。將腌制好的豆腐塊放進(jìn)玻璃瓶中，密封保存2～3 個(gè)月，即可食用。

根據(jù)腐乳的風(fēng)味與色澤，可分為紅腐乳、青腐乳、白腐乳，紅腐乳又名紅方，是在發(fā)酵后期加入紅曲制作而成，成品表面呈紅色；白腐乳又名白方，發(fā)酵期間不加任何著色劑；青腐乳又名青方，是在發(fā)酵后期，以低濃度鹽水為湯料制作而成，成品表面呈青色，有特殊刺激性氣味。根據(jù)制作過程是否有微生物參與，可將腐乳分為腌制型和發(fā)酵型，腌制型腐乳是豆腐塊不經(jīng)過前期微生物發(fā)酵長(zhǎng)霉直接腌制而成；發(fā)酵型腐乳的豆腐塊先經(jīng)過前期發(fā)酵長(zhǎng)出毛霉，再進(jìn)入后期腌制階段。發(fā)酵型腐乳按接種類型可分為天然接種與純菌種接種，天然接種是利用環(huán)境微生物自然發(fā)酵，純菌種接種使用的菌種主要有細(xì)菌、根霉、毛霉。

2 腐乳發(fā)酵的功能菌種

微生物在腐乳發(fā)酵過程中扮演著十分重要的角色，與腐乳風(fēng)味、色澤、口感的形成密切相關(guān)，國(guó)內(nèi)學(xué)者通過研究腐乳發(fā)酵功能菌種，為發(fā)酵腐乳的風(fēng)味品質(zhì)和安全性提供理論支撐[9]。目前常用的腐乳發(fā)酵菌種有毛霉、根霉、細(xì)菌。

2.1 毛霉

毛霉是我國(guó)腐乳生產(chǎn)時(shí)使用最多的菌種，四川、北京等地大多都使用毛霉發(fā)酵腐乳，占腐乳生產(chǎn)用菌總量的90%～95%[9]，腐乳生產(chǎn)常用菌種具體見表1?，F(xiàn)代腐乳制作過程是在無菌環(huán)境下將毛霉菌種接種到豆腐塊表面，培養(yǎng)3～5 d 后，豆腐塊表面長(zhǎng)滿白色或淡黃色菌絲，形成皮膜，毛霉對(duì)腐乳特殊口感和香味的形成有重要貢獻(xiàn)[9]。毛霉能分泌多種酶類，其中蛋白酶是決定腐乳品質(zhì)的重要因素，可以分解豆腐中的蛋白質(zhì)，生成肽類、氨基酸、有機(jī)酸和酯類等，使發(fā)酵腐乳富含多種營(yíng)養(yǎng)成分[10]。LIU 等[11]研究發(fā)現(xiàn)腐乳內(nèi)外部均存在多種蛋白酶，且蛋白酶活性與琥珀酸酯、組胺、三甲胺等成分顯著相關(guān)，表明蛋白酶對(duì)腐乳的成熟有重要促進(jìn)作用。

表1 腐乳生產(chǎn)常用菌種表

2.2 根霉

根霉菌是發(fā)酵腐乳的另一種常用菌種，可分泌高活性的淀粉酶，從而使腐乳產(chǎn)生乳酸、延胡索酸等有機(jī)酸，也可產(chǎn)生酯類物質(zhì)，提高腐乳的芳香氣味[12]。腐乳生產(chǎn)常用根霉菌如表1 所示。

根霉型腐乳是利用根霉菌發(fā)酵制成，根霉菌耐高溫，常在夏季高溫生產(chǎn)腐乳時(shí)使用。由于根霉菌產(chǎn)蛋白酶能力較低，發(fā)酵而成的腐乳外觀形狀與口感均不如毛霉型腐乳。因此，將毛霉菌與根霉菌混合制成復(fù)合菌種用于發(fā)酵腐乳，可改善腐乳品質(zhì)，豐富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，縮短生產(chǎn)周期并改善風(fēng)味成分。

2.3 細(xì)菌

除根霉和毛霉外，還可利用細(xì)菌發(fā)酵腐乳。目前國(guó)內(nèi)使用細(xì)菌發(fā)酵腐乳的廠家較少，可用于發(fā)酵腐乳的細(xì)菌主要有藤黃微球菌和枯草芽孢桿菌，黑龍江克東腐乳是利用藤黃微球菌發(fā)酵制成的腐乳，其氨基酸含量高，味道鮮美，具有明顯的地域特色[9]。

3 腐乳風(fēng)味成分研究

作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品的一種，腐乳在中國(guó)乃至亞洲地區(qū)受到大眾歡迎，風(fēng)味是評(píng)價(jià)腐乳產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。近年來有關(guān)腐乳風(fēng)味物質(zhì)組成的研究越來越多，鑒定腐乳中揮發(fā)性風(fēng)味成分的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）、氣相色譜-嗅覺-質(zhì)譜聯(lián)用等方法結(jié)合液液萃取、頂空吸附、蒸餾萃取和固相微萃取。

MOY 等[13]采用GC-MS 對(duì)豆腐和腐乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定，豆腐發(fā)酵成腐乳的過程中，正己醛含量從2 828 μg·kg-1降至319.6 μg·kg-1，表明通過發(fā)酵可去除豆腐中不愉快氣味，發(fā)酵過程也是形成腐乳中以果香味與甜味為主的特有風(fēng)味物質(zhì)醇類和酯類的主要途徑。自制腐乳發(fā)酵過程中，異戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯及壬醛等對(duì)風(fēng)味形成影響較大，賦予腐乳果香味和奶香味。而樊艷[14]研究發(fā)現(xiàn)，茴香腦是自制腐乳中最主要的風(fēng)味成分，乙醇是市購(gòu)腐乳的最主要風(fēng)味成分，風(fēng)味成分不同可能是由生產(chǎn)腐乳所用原材料、生產(chǎn)環(huán)境、加工工藝不同引起的。風(fēng)味組學(xué)研究對(duì)表征和鑒定腐乳中揮發(fā)性成分有重要作用，不同發(fā)酵階段腐乳香氣成分之間存在明顯差異，特征風(fēng)味物質(zhì)解析對(duì)改善腐乳品質(zhì)有實(shí)際意義，可為完善腐乳產(chǎn)品質(zhì)量體系提供科學(xué)指導(dǎo)，同時(shí)為進(jìn)一步研究特征風(fēng)味物質(zhì)的形成機(jī)理、生產(chǎn)具有優(yōu)良風(fēng)味的腐乳奠定基礎(chǔ)[15]。本文對(duì)腐乳中的主要風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了總結(jié)，結(jié)果見表2。

表2 腐乳中主要揮發(fā)性風(fēng)味成分表

盡管前人對(duì)腐乳中風(fēng)味物質(zhì)組成進(jìn)行了詳細(xì)報(bào)道，但對(duì)腐乳中風(fēng)味成分進(jìn)行精準(zhǔn)定量的研究較少，可以采用高分辨氣相色譜-嗅聞技術(shù)結(jié)合同位素稀釋分析與風(fēng)味重構(gòu)等方法對(duì)腐乳中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量，并作為腐乳產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)的依據(jù)，為完善腐乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)研究機(jī)理提供理論支撐。

4 腐乳菌群與風(fēng)味關(guān)系研究

微生物在腐乳發(fā)酵過程中分泌酶，促使蛋白質(zhì)和脂類水解形成小分子物質(zhì)，對(duì)腐乳風(fēng)味有重大貢獻(xiàn)，腐乳中微生物群落結(jié)構(gòu)與風(fēng)味物質(zhì)組成有較強(qiáng)的相關(guān)性。乳酸桿菌屬是市售腐乳中的優(yōu)勢(shì)菌群，可促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的形成，是酯類和酸類風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者，同時(shí)對(duì)抑制致病菌生長(zhǎng)及延長(zhǎng)貨架期有一定作用。而芽孢桿菌與魏斯氏菌可抑制風(fēng)味化合物的產(chǎn)生，在腐乳制作過程中加入香辛料，腌制成熟后芽孢桿菌數(shù)量減少，說明香辛料能抑制其生長(zhǎng)，促進(jìn)腐乳風(fēng)味形成與產(chǎn)品熟化[25]。然而，XIE 等[26]的研究表明，乳酸桿菌在腐乳中大量存在，但并未發(fā)現(xiàn)其與風(fēng)味成分之間的相關(guān)性。發(fā)酵菌種與風(fēng)味成分相關(guān)性的差異可能與腐乳生產(chǎn)方式有關(guān)，不同地理位置與氣候條件會(huì)使環(huán)境微生物發(fā)生改變，導(dǎo)致腐乳菌群與風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生變化。

除乳酸菌外，腸桿菌科與不動(dòng)桿菌屬對(duì)腐乳的最終品質(zhì)有重要影響[27]。腸桿菌屬與腐乳中糖類、含氮化合物、大多數(shù)氨基酸的含量有關(guān)，氨基酸是改善腐乳風(fēng)味的重要成分，而假單胞菌與腐乳中生物胺的合成相關(guān)，尤其是組胺與尸胺的合成，同時(shí)對(duì)酯類香氣成分的生成有一定的抑制作用[27]。青腐乳發(fā)酵前期，乳桿菌屬與四鏈球菌屬是優(yōu)勢(shì)菌，與具有水果香、花香、酒香味的酯類、酮類、醇類物質(zhì)緊密相關(guān)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，明串珠菌屬與鹽厭氧菌屬的相對(duì)含量逐漸升高，與具有特殊臭味的含硫化合物及吲哚的含量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，是青腐乳獨(dú)特風(fēng)味的主要來源[17]。鏈球菌則與腐乳中的糖類和氨基酸的含量顯著相關(guān)[27]。研究發(fā)酵腐乳菌群組成與風(fēng)味成分之間的相關(guān)性，對(duì)深入了解腐乳的發(fā)酵機(jī)理、選擇功能發(fā)酵菌株、生產(chǎn)工藝標(biāo)準(zhǔn)化和流程可控化具有推動(dòng)作用。

目前，腐乳中微生物菌群的鑒定方法主要為擴(kuò)增子測(cè)序，只能鑒定到屬水平。為深入研究微生物與風(fēng)味之間的動(dòng)態(tài)變化關(guān)系，可采用宏基因組測(cè)序?qū)⒏橹形⑸锞鸿b定到菌株水平，可結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)鑒定研究腐乳中微生物菌群與揮發(fā)性風(fēng)味成分的相關(guān)性[28]。

5 腐乳制作過程中潛在安全性問題

我國(guó)腐乳大多通過傳統(tǒng)發(fā)酵方式制作而成，生產(chǎn)環(huán)境開放，人工操作環(huán)節(jié)較多，導(dǎo)致生產(chǎn)批次間不穩(wěn)定，存在安全隱患。腐乳發(fā)酵過程中，由于微生物氨基酸脫羧酶作用或醛類與酮類的胺化作用，可生成生物胺，食品中常見生物胺有腐胺、尸胺、組胺及酪胺等，過量攝入生物胺會(huì)使人體產(chǎn)生惡心嘔吐等不適癥狀[29]。GUAN 等[29]對(duì)38 份市售腐乳的生物胺含量進(jìn)行了研究，檢出種類最多是腐胺和尸胺，檢出量最高是腐胺和酪胺，5 份白腐乳樣品中組胺含量超過50 mg·kg-1，生物胺總量從高到低為青腐乳＞白腐乳＞紅腐乳，與QIU 等[30]的研究結(jié)果一致。在腐乳加輔料腌制時(shí)加入10%～20%乙醇，可以顯著降低成品中生物胺的總量，且加入乙醇后多肽和氨基氮的含量有所增加。利用不同毛霉發(fā)酵腐乳，發(fā)現(xiàn)利用總狀毛霉發(fā)酵的腐乳中尸胺、亞精胺、精胺、組胺和酪胺的含量明顯低于雅致放射毛霉與五通橋毛霉。

腐乳蛋白質(zhì)含量高，是蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)的良好載體，蠟樣芽孢桿菌可引起食物中毒，無法保證腐乳安全性。周婷婷等[31]對(duì)市售腐乳進(jìn)行抽檢，蠟樣芽孢桿菌檢出率為84.2%，蠟樣芽孢桿菌含量為102～105CFU·g-1，21%的樣品中蠟樣芽孢桿菌含量達(dá)到106CFU·g-1，《蠟樣芽胞桿菌食物診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》（W/S 82—1996）中食物中毒標(biāo)準(zhǔn)為105CFU·g-1。我國(guó)腐乳產(chǎn)業(yè)規(guī)模龐大，腐乳安全問題直接影響腐乳出口，為抑制蠟樣芽孢桿菌滋生，JIN 等[32]通過添加大蒜精油使蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞變性死亡，有效控制其數(shù)量。腐乳行業(yè)應(yīng)嚴(yán)格控制生產(chǎn)衛(wèi)生條件，加強(qiáng)現(xiàn)場(chǎng)衛(wèi)生管理，重視生產(chǎn)過程中有害菌的污染，同時(shí)使用合適發(fā)酵菌種和添加劑精準(zhǔn)調(diào)控腐乳的食用安全性，保證腐乳生產(chǎn)的規(guī)?；c標(biāo)準(zhǔn)化。

6 可控化調(diào)控技術(shù)展望

國(guó)內(nèi)外研究表明，功能菌株對(duì)于發(fā)酵食品風(fēng)味品質(zhì)起著關(guān)鍵作用。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)與檢測(cè)手段的進(jìn)一步發(fā)展，研究人員對(duì)腐乳發(fā)酵及成熟過程中菌群結(jié)構(gòu)與風(fēng)味品質(zhì)的變化進(jìn)行了深入解析，使人們對(duì)腐乳有了更深入的了解。為使腐乳生產(chǎn)菌株標(biāo)準(zhǔn)化和生產(chǎn)過程可控化，可采用宏基因組測(cè)序?qū)⒏橹形⑸锞鸿b定到菌株水平，并通過菌種強(qiáng)化技術(shù)改善腐乳菌群結(jié)構(gòu)、提升腐乳風(fēng)味[33]。可利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段研究腐乳中微生物的代謝路徑，從而了解其互作機(jī)制，為腐乳產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化與可控化提供理論基礎(chǔ)，促進(jìn)腐乳行業(yè)健康發(fā)展。

我國(guó)主要采取傳統(tǒng)方式制作腐乳，模式化和可控化程度較低。可在傳統(tǒng)生產(chǎn)的基礎(chǔ)上引入高新技術(shù)提升腐乳生產(chǎn)水平，對(duì)提高腐乳質(zhì)量具有重要意義。通過傳感器獲取腐乳發(fā)酵過程信息，并將信息轉(zhuǎn)換成電信號(hào)或其他形式輸出，是實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)和智能控制的首要步驟。同時(shí)利用智能監(jiān)測(cè)設(shè)備實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中溫度等指標(biāo)的變化，可掌握發(fā)酵期間規(guī)律，根據(jù)發(fā)酵參數(shù)的變化，及時(shí)改進(jìn)工藝參數(shù)，實(shí)現(xiàn)最優(yōu)發(fā)酵[34]。高新技術(shù)的應(yīng)用使腐乳發(fā)酵過程可控化成為可能，同時(shí)使腐乳生產(chǎn)向科學(xué)化和信息化邁進(jìn)，對(duì)腐乳的品質(zhì)提高具有指導(dǎo)意義。