鐘靜 楊立峰 楊文潤 鄧穎敏 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 （廣東 廣州 510663）

內(nèi)容提要： 目的：通過參加國家市場監(jiān)督管理局組織的一次性口罩能力驗(yàn)證，評估實(shí)驗(yàn)室綜合檢測能力，進(jìn)而提升一次性口罩的產(chǎn)品質(zhì)量安全。方法：依據(jù)《一次性使用衛(wèi)生用品中致病菌的檢測參試指導(dǎo)書》及GB15979-2002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》附錄B的相關(guān)條款進(jìn)行檢測，在菌株分離上采用輔助檢測方法：增加金黃色葡萄球菌、假單胞菌屬顯色培養(yǎng)基的劃線，目的增加對目標(biāo)菌的分離和準(zhǔn)確鑒定。采用標(biāo)準(zhǔn)要求用傳統(tǒng)生化鑒定方法對血平板、十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基分離出來的可疑菌落進(jìn)行生化鑒定，同時(shí)也對輔助檢測方法顯色平板分離出來的可疑菌落進(jìn)行傳統(tǒng)鑒定，對難判定的假單胞菌屬顯色培養(yǎng)基生長的可疑菌落再增加全自動生化鑒定儀進(jìn)行生化鑒定。結(jié)果：傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果與全自動生化鑒定儀鑒定的結(jié)果一致，國家市場監(jiān)督管理局于2020年及2022年共組織了2次一次性口罩能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證結(jié)果評價(jià)均為滿意，實(shí)驗(yàn)室的檢測能力獲得認(rèn)可。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)室一次性口罩能力驗(yàn)證的檢測方法及質(zhì)量控制策略是可行的，值得推薦。

一次性使用衛(wèi)生用品是指使用一次后即丟棄的、與人體直接或間接接觸的并為達(dá)到人體生理衛(wèi)生或衛(wèi)生保?。咕蛞志┠康亩褂玫母鞣N日常生活用品，依據(jù)GB15979-2002標(biāo)準(zhǔn)口罩是一次性衛(wèi)生用品[1]。對于呼吸道傳染病最有效最重要的防疫手段就是隔離，而醫(yī)用口罩的特殊性在于共有三層過濾層，可以有效隔離細(xì)菌、病毒等飛沫傳播，它能阻止經(jīng)空氣傳播的直徑小于5μm的感染因子，或1m內(nèi)接觸經(jīng)飛沫傳播的疾病，所以最有用的防疫物資就是口罩，GB15979-2002標(biāo)準(zhǔn)中4.3微生物學(xué)指標(biāo)規(guī)定，普通級或消毒級口罩均不得檢出致病性化膿菌，而金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌（原稱綠膿桿菌）就是“致病性化膿菌”中最常見的兩種條件致病菌，也是人類化膿感染中最常見的病原菌，在自然環(huán)境中存在較多，檢出率較高，受其污染的用品可引起局部化膿感染[2-4]?？谡质嵌愥t(yī)療器械，直接接觸到人體的皮膚及黏膜，一旦檢出上述致病菌，將直接影響使用者的身體健康，因此，對其致病菌等衛(wèi)生質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行檢測具有非常重要的意義[5,6]。參加室外能力驗(yàn)證能滿足CNAS評審要求及提高本實(shí)驗(yàn)檢測能力[7]。本實(shí)驗(yàn)室于2020年及2022年均參加了由國家市場監(jiān)督管理局組織的一次性使用衛(wèi)生用品致病菌檢測能力驗(yàn)證，2020年樣品中添加的干擾菌較少，目標(biāo)菌添加的量濃度較高，容易判斷結(jié)果，2022年的樣品中添加的干擾菌較多，目標(biāo)菌添加的量較少，要經(jīng)過多次分離才能獲得目標(biāo)菌，檢測時(shí)間緊，要求實(shí)驗(yàn)室檢測人員不僅要有豐富的檢測經(jīng)驗(yàn)而且對質(zhì)量控制要嚴(yán)謹(jǐn)把關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)室兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為滿意，本文通過對實(shí)驗(yàn)過程中遇到的各種情況進(jìn)行分析，探討影響檢測結(jié)果的質(zhì)量控制因素進(jìn)行總結(jié)，希望能助力企業(yè)高質(zhì)量發(fā)展提供一些幫助。

1.材料與方法

1.1 一般材料

試劑及菌種：①金黃色葡萄球菌檢測需用的試劑：SCDLP液體培養(yǎng)基、血平板、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、甘露醇生化鑒定管、凍干血漿、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基一次性使用平板、胰酪大豆胨瓊脂一次性使用平板、革蘭氏染色液、0.9%無菌氯化鈉注射液；革蘭氏陽性菌鑒定卡片。②綠膿桿菌檢測需用的試劑：十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂一次性使用平板、革蘭氏染色液、綠膿桿菌生化鑒定盒、氯仿、1N鹽酸；GN革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡片、銅綠胞菌屬顯色培養(yǎng)基。③金黃色葡萄球菌檢測需用的標(biāo)準(zhǔn)菌株：陽性菌株：金黃色葡萄球菌；陰性菌株：表皮葡萄球菌。④綠膿桿菌檢測需用的標(biāo)準(zhǔn)菌株：陽性菌株：銅綠假單胞菌；陰性菌株：大腸埃希氏菌。

儀器設(shè)備：生化培養(yǎng)箱、電子天平、立式滅菌器、生物安全柜、雙目光學(xué)顯微鏡、全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、比濁儀、冰箱。

1.2 方法

1.2.1 供試液的制備

樣品從冰箱中取出后，待樣品恢復(fù)到室溫后開啟使用，在生物安全柜內(nèi)無菌開啟樣品包裝，用無菌鑷子取出樣品放置于已滅菌的1L量杯中剪碎，用無菌鑷子將剪碎的樣品移至到100mL無菌氯化鈉注射液中振搖，時(shí)間不低于2min，全過程在15min內(nèi)完成。將此溶液依據(jù)GB15979-2002標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌的后續(xù)檢測。

1.2.2 增菌

將上述供試液，無菌取樣5～50mL SCDLP培養(yǎng)液中，充分混勻，置35°C±2°C培養(yǎng)18～24h后并觀察記錄結(jié)果。同時(shí)設(shè)立陽性菌對照、陰性菌對照和陰性對照。

1.2.3 分離

金黃色葡萄球菌：自上述增菌培養(yǎng)液輕輕搖勻，取1～2接種環(huán)，將培養(yǎng)物按四區(qū)劃線分離法劃線接種在血瓊脂平板及金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基上，置35°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h觀察菌落特征，金黃色葡萄球菌在顯色培養(yǎng)基上生長的菌落特征為：金黃色葡萄球菌菌落為粉紅-紫紅色菌落；其他菌：藍(lán)綠色或無色或受抑制不生長菌落）。

綠膿桿菌：用滅菌接種環(huán)在薄膜處挑取1～2環(huán)培養(yǎng)物，按四區(qū)劃線分離法劃線接種十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基及假單胞菌屬顯色培養(yǎng)基上，置35°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)，在假單胞菌屬顯色培養(yǎng)基上特征如下：假單胞菌屬：藍(lán)綠色；大多數(shù)腸桿菌：淡紫色且抑制生長；革蘭氏陽性菌：抑制）。

1.2.4 菌落純化

對照上述陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落形態(tài)，挑取上述平板中典型可疑的單個(gè)菌落，分別純化在胰酪大豆胨瓊脂一次性使用平板上，放置于35°C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)24h。

1.2.5 染色鏡檢

挑取分純菌落，涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

1.2.6 生化鑒定

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)采用傳統(tǒng)鑒定方法對金黃色葡萄球菌可疑菌落進(jìn)行生化鑒定：若為革蘭氏陽性菌，進(jìn)行甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：每支西林瓶加入35°C培養(yǎng)24h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物0.08mL，將已接種的西林瓶再套上膠塞，然后充分混勻，置35°C培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果；血漿凝固酶試驗(yàn)：每支西林瓶加入0.5mL滅菌生理鹽水至完全溶解，然后加入葡萄球24h肉湯培養(yǎng)物0.3mL，充分混勻，蓋好西林瓶膠塞，置于35°C培養(yǎng)，在6h內(nèi)觀察結(jié)果。甘露醇發(fā)酵生化試驗(yàn)結(jié)果判斷如下：甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)陽性：黃色（產(chǎn)酸）；陰性：紫色（不產(chǎn)酸），依上述操作同時(shí)設(shè)立陰性對照試驗(yàn)。血漿凝固酶試驗(yàn)陽性：傾斜或倒置試管時(shí)，呈現(xiàn)凝固塊，或凝固塊體積大于原體積的一半時(shí)，為血漿凝固酶陽性；陰性：傾斜或倒置試管時(shí)無凝塊。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)傳采用傳統(tǒng)方法取上述純化后的菌落進(jìn)行革蘭氏鏡檢，并依據(jù)《071840綠膿桿菌生化鑒定管使用說明書》檢測方法進(jìn)行生化鑒定。

2.結(jié)果

2.1 2020年樣品傳統(tǒng)鑒定檢測結(jié)果

2020年共收到4個(gè)樣品，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)采用傳統(tǒng)鑒定檢測結(jié)果見表1。

表1.2020年4個(gè)樣品依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)傳統(tǒng)鑒定檢測結(jié)果

2.2 2022年樣品傳統(tǒng)鑒定檢測結(jié)果

2022年共收到4個(gè)樣品，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)采用傳統(tǒng)鑒定檢測結(jié)果見表2。

表2.2022年4個(gè)樣品依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)傳統(tǒng)鑒定檢測結(jié)果

2.3 全自動檢測儀鑒定

由于GTTC-22PT-F28-101樣品在假單胞菌屬顯色平板上有明顯的菌落特征，藍(lán)色菌落，所以增加了全自動檢測儀進(jìn)行鑒定，檢測結(jié)果為惡臭假單胞菌，與傳統(tǒng)生化鑒定結(jié)果一致，不是綠膿桿菌。

3.討論

3.1 對于致病菌檢測質(zhì)量控制主要有以下策略及建議

3.1.1 人員培訓(xùn)方面

每年做好科室人員培訓(xùn)計(jì)劃，對新進(jìn)人員完成培訓(xùn)上崗，按計(jì)劃推進(jìn)人員培訓(xùn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況制定內(nèi)部質(zhì)控計(jì)劃，定期開展科室內(nèi)部人員比對實(shí)驗(yàn)，人員比對是一種內(nèi)部質(zhì)量控制手段之一，通過安排具有代表性的不同層次的兩人或者多人開展比對試驗(yàn)，考核檢測人員能力水平，判斷檢測人員操作是否正確、熟練，用以評價(jià)人員對實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和可靠性的影響，通過室內(nèi)比對，提高檢測人檢測能力，為完成室外比對實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。

3.1.2 培養(yǎng)基、試劑、標(biāo)準(zhǔn)菌株要嚴(yán)格進(jìn)行技術(shù)性驗(yàn)收

不同公司生產(chǎn)的培養(yǎng)基及生化試劑質(zhì)量差異較大，因此在檢測開始前，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對采購后的培養(yǎng)基、試劑進(jìn)行有效的技術(shù)性驗(yàn)收并做好記錄，對標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行有效的確認(rèn)試驗(yàn)，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，以免造成結(jié)果假陽性或假陰性。

3.1.3 設(shè)施設(shè)備方面

為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)檢驗(yàn)設(shè)備的計(jì)量及期間核查，本次實(shí)驗(yàn)在生化鑒定方面，除了按標(biāo)準(zhǔn)要求的傳統(tǒng)生化鑒定試驗(yàn)外，還增加了細(xì)菌鑒定儀對可疑菌落進(jìn)行生化鑒定，并作為輔助試驗(yàn)，對于這臺全自動分析系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室每年申請?jiān)O(shè)備廠家進(jìn)行定期維修保養(yǎng)及較準(zhǔn)，具體的項(xiàng)目包括對儀器工作環(huán)境、儀器外部狀態(tài)檢測、系統(tǒng)軟件及儀器各部件狀態(tài)檢查、操作軟件的運(yùn)作和操作檢查等進(jìn)行維護(hù)，使設(shè)備能滿足檢測需要，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，并對該設(shè)備的比濁儀進(jìn)行送檢計(jì)量。

3.1.4 實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)

①樣品接收狀態(tài)確認(rèn)：實(shí)驗(yàn)室收到能力驗(yàn)證樣品，應(yīng)認(rèn)真查看樣品外包裝是否完整無破損，被檢物品狀態(tài)是否良好，如果有破損情況或標(biāo)識污損等情況請勿開啟樣品進(jìn)行檢測，應(yīng)與主辦方聯(lián)系，重新發(fā)樣以免影響檢測結(jié)果的判斷。②供試液制備：應(yīng)根據(jù)樣品的外包裝實(shí)際情況及形狀規(guī)格，設(shè)計(jì)合適的檢驗(yàn)方案，因?yàn)槟芰︱?yàn)證的樣品是唯一的，在實(shí)驗(yàn)中不能被人為污染，所以設(shè)計(jì)方案尤為重要，比如這次實(shí)驗(yàn)樣品是口罩，裝在小西林瓶中，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要剪碎置于100mL鹽水中振蕩，為了防止樣品取出來在剪碎過程中掉在實(shí)驗(yàn)桌面上，本實(shí)驗(yàn)室增加一道工序，先把樣品用無菌鑷子取出放置于已滅菌的燒杯中再剪碎，從而降低污染率。③實(shí)驗(yàn)過程中所用工具均要無菌，所以準(zhǔn)備試驗(yàn)的耗材及檢測用具要充足，確保實(shí)驗(yàn)過程能順利開展，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格避免交叉污染。

3.1.5 熟悉標(biāo)準(zhǔn)、嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測

實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)熟悉標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測，比如綠膿桿菌在42°C能生長，4°C不生長；這是綠膿桿菌的特性，而且標(biāo)準(zhǔn)明確要做這項(xiàng)檢測，不能為了省事減少實(shí)驗(yàn)步驟，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。

3.1.6 實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)掌握檢測過程的關(guān)鍵控制點(diǎn)或關(guān)鍵控制環(huán)節(jié)

①做致病性菌檢測時(shí)，一定要設(shè)陽性菌株及陰性菌株，目的是可以與目標(biāo)菌的結(jié)果進(jìn)行比較，同時(shí)也可以檢測耗材的有效性。②菌株分離劃線時(shí)一定要?jiǎng)澇鰡蝹€(gè)菌落，如果第一次分離找不到單個(gè)菌落的目標(biāo)菌，應(yīng)進(jìn)行再次分離，直至分離出單個(gè)目標(biāo)菌，再往下操作，否則影響生化鑒定結(jié)果。③由于綠膿桿菌是需氧菌，所以在培養(yǎng)基液面會形成有一層薄菌膜，在劃線時(shí)應(yīng)挑取菌膜處的培養(yǎng)物劃線接種十六烷三甲基溴化銨瓊脂上，這點(diǎn)很重要。④氧化酶試驗(yàn)時(shí)，一定要用玻棒或一次性滅菌的塑料接種環(huán)挑菌輕輕涂抹在試紙上，不能用含鐵的用具，防止氧化反應(yīng)影響檢測結(jié)果。⑤綠膿菌素試驗(yàn)需要用到氯仿及1N鹽酸溶液，生化鑒定盒通常沒配有這兩種化學(xué)試劑，要提前準(zhǔn)備好，總之平時(shí)要積累經(jīng)驗(yàn)，努力學(xué)習(xí)專業(yè)知識，提高專業(yè)檢測水平。

3.2 小結(jié)

與以往食品及化妝品微生物能力驗(yàn)證經(jīng)常采用的凍干粉樣品不同的是，2020年及2022年一次性樣品致病菌能力驗(yàn)證均采用實(shí)物樣品的形式，以口罩作為載體，人為添加目標(biāo)和非目標(biāo)微生物制成模擬天然樣品，與實(shí)際檢測樣品的基質(zhì)一致，能夠完全復(fù)現(xiàn)天然樣品的全流程檢測，對參試實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行考核，不僅能考察實(shí)驗(yàn)室的檢測水平，還能評價(jià)其環(huán)境設(shè)施是否滿足標(biāo)準(zhǔn)要求，進(jìn)而可以全面評價(jià)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)水平和檢測能力，本實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，增加顯色培養(yǎng)基的劃線及菌株分離、并用全自動細(xì)菌儀對可疑菌落進(jìn)行生化鑒定輔助檢測，傳統(tǒng)生化鑒定結(jié)果與全自動細(xì)菌儀的檢測結(jié)果一致，并收到組委會滿意的檢測結(jié)果評價(jià)，所以證明以上的檢測方法及質(zhì)量控制策略是可行的。目前為止，國家局每年都會對口罩進(jìn)行抽樣檢測，仍然發(fā)現(xiàn)很多不合格品[9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有6.4%檢測機(jī)購在參加此次能力驗(yàn)證過程中結(jié)果評價(jià)不滿意[10]。希望本文能為企業(yè)及同行提供一些檢測經(jīng)驗(yàn)，提高企業(yè)對一次性產(chǎn)品的檢測能力，助力醫(yī)療器械科學(xué)監(jiān)管，提升醫(yī)療器械從業(yè)人員質(zhì)量安全意識，保障公眾用械安全有效。