沈宇杰, 楊紅, 徐盈, 李佳, 李遠鳳, 陳志浩, 陳紫均, 劉帥

1.西安醫(yī)學院,陜西西安 710021;2.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西西安 710032

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是由多種類型的基質(zhì)細胞、免疫細胞和細胞外成分構(gòu)成的復雜環(huán)境。研究證明,TME會影響腫瘤進展及藥物免疫治療反應[1-2]。近幾十年來,腫瘤研究主要依靠體外2D細胞培養(yǎng)及體內(nèi)異種移植,二者均具有一定的局限性[3-4]。因此,建立新的研究模型至關(guān)重要。

免疫類器官是在腫瘤類器官的基礎(chǔ)上,通過將腫瘤上皮細胞同各種基質(zhì)和免疫成分共同培養(yǎng),在保留患者腫瘤異質(zhì)性的同時保留腫瘤的TME特征[5-7]。免疫類器官作為模擬體內(nèi)免疫事件的可靠模型,可以為新的治療方法提供研究平臺,并對患者樣本進行臨床前篩查。本文對免疫類器官的培養(yǎng)方法,以及目前免疫類器官在腫瘤免疫治療中的應用做一綜述。

1 免疫類器官的不同培養(yǎng)方法

1.1 腫瘤類器官培養(yǎng)

目前腫瘤類器官培養(yǎng)的常用方法是浸沒基質(zhì)膠培養(yǎng)。首先無菌取樣獲得術(shù)中患者的腫瘤組織或腹水,經(jīng)過機械切割和消化分離出腫瘤細胞,再將腫瘤細胞置于基質(zhì)膠中培養(yǎng)?；|(zhì)膠取材于小鼠肉瘤中的基底膜基質(zhì),其主要成分包括4種細胞外基質(zhì)蛋白:層粘連蛋白、IV型膠原、巢蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖,基質(zhì)膠在22～37 ℃凝膠化,形成水凝膠,從而為上皮和內(nèi)皮層細胞提供結(jié)構(gòu)支持[8]。培養(yǎng)基根據(jù)腫瘤的類型及培養(yǎng)條件有所不同,常用的添加劑包括Wnt3a、R-spondin 1、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白抑制劑等[9],這種浸沒基質(zhì)膠培養(yǎng)的腫瘤類器官只富集上皮腫瘤細胞,不保留基質(zhì)成分。

1.2 腫瘤類器官與免疫成分聯(lián)合共培養(yǎng)

免疫類器官的培養(yǎng)需要在浸沒基質(zhì)膠培養(yǎng)的基礎(chǔ)上添加外源性免疫細胞來達到TME建模。①首先建立腫瘤類器官,培養(yǎng)一段時間后,將腫瘤類器官解離為單個細胞,同時向解離的腫瘤類器官中添加由外周血提取的淋巴細胞,重懸于基質(zhì)膠中再次接種。通過腫瘤類器官與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)建立的免疫類器官可以富集腫瘤反應性T細胞[10]。Zhou等[11]通過膽管癌類器官與外周血T細胞共培養(yǎng)方案建立免疫類器官,成功在體外模擬了有效的抗腫瘤免疫應答反應。②另一種培養(yǎng)方式無需提前建立腫瘤類器官,只需將外源性的免疫細胞直接與腫瘤上皮細胞預混于基質(zhì)膠中進行共培養(yǎng),同樣可以模擬免疫細胞與腫瘤細胞間的相互作用[12]。聯(lián)合共培養(yǎng)的方式操作簡便,但是需要外源性添加免疫成分,可能會存在免疫成分類型單一,無法反映不同免疫細胞間相互作用等問題;另外,共培養(yǎng)的培養(yǎng)條件需要根據(jù)不同腫瘤組織及添加的免疫成分進行調(diào)整。

1.3 微流控3D培養(yǎng)

微流控3D培養(yǎng)需要使用到微流控裝置,裝置使用塑料、玻璃或聚二甲基硅氧烷等柔性聚合物材料形成灌流中空微通道,通過操控通道中的微小流體,研究人員可以控制基質(zhì)結(jié)構(gòu)、細胞組成和比例、流速等特征。微流控的核心結(jié)構(gòu)由微流體室構(gòu)成,每個微流體室包含中心凝膠區(qū)及兩側(cè)的介質(zhì)通道。具體的培養(yǎng)步驟是首先將新鮮腫瘤組織切碎消化制備成含有腫瘤細胞、免疫細胞和基質(zhì)細胞的腫瘤微球,再將腫瘤微球與膠原水凝膠混合后注入中心凝膠區(qū),從兩側(cè)的介質(zhì)通道輸入培養(yǎng)基[13]。微流控3D培養(yǎng)類器官包含自體腫瘤浸潤性免疫細胞,有利于研究內(nèi)源性免疫-腫瘤相互作用。此外,這種方式培養(yǎng)的類器官還可以實現(xiàn)動態(tài)培養(yǎng),為細胞生長提供一個活躍且穩(wěn)定的微環(huán)境,同時可以對細胞的形態(tài)和生理變化進行原位監(jiān)測,更加真實地模擬TME,還原體內(nèi)腫瘤特征[14]。但是,微流控3D類器官培養(yǎng)需要特殊裝置,且模型目前僅限于研究內(nèi)源性免疫-腫瘤相互作用,無法反映免疫細胞對腫瘤的募集[15]。

1.4 氣液界面培養(yǎng)

氣液界面(air liquid interface,ALI)培養(yǎng)是指將腫瘤組織采用物理方法切割成組織碎片,然后在包被膠原蛋白凝膠的穿透性細胞培養(yǎng)小室中進行培養(yǎng)。凝膠的頂部暴露在空氣中,同時外皿中的培養(yǎng)基通過穿透性細胞培養(yǎng)小室擴散到內(nèi)皿中,形成氣-液交互界面,使細胞獲得充足的氧氣供應。該方法使腫瘤在原生狀態(tài)下生長,保留了具有腫瘤實質(zhì)和間質(zhì)的復雜組織學TME結(jié)構(gòu)及多種內(nèi)源性免疫細胞,包括功能性的腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)[7]。由于氣液界面培養(yǎng)無需外源性添加免疫成分且不需要特殊培養(yǎng)裝置,因此實用性更高。目前ALI培養(yǎng)可以在短期內(nèi)準確反應腫瘤的特征,但是隨著時間的推移,類器官中的免疫成分會逐漸減少。研究顯示,盡管在補充白細胞介素-2的條件下,其中的免疫成分也無法維持超過2個月的時間[7]。

2 免疫類器官在腫瘤免疫治療中的各種應用

2.1 免疫檢查點阻斷治療

免疫檢查點分子是一組具有抑制免疫細胞功能的調(diào)節(jié)分子,對激活免疫系統(tǒng)、維持自身耐受和防止自身免疫的發(fā)生起著重要作用。免疫檢查點分子無法使機體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應答,同時,在腫瘤組織中,腫瘤可以利用檢查點形成免疫逃逸。免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors,ICI)又稱免疫系統(tǒng)反制點抑制劑,作用于免疫檢查點,用于增強抗腫瘤免疫應答和抗免疫逃逸。

免疫類器官是對患者ICI治療效果預測的理想平臺,可以幫助決策患者的治療方案。與此同時,免疫類器官可以幫助開展免疫治療相關(guān)的功能測定,推動腫瘤免疫學機制的研究及精準醫(yī)學的發(fā)展。在腫瘤類器官與自體TIL聯(lián)合共培養(yǎng)建立的直腸癌免疫類器官中,TIL通過基質(zhì)膠向類器官遷移,提高了腫瘤細胞的細胞毒性,這表明共培養(yǎng)類器官可以用來評估TIL的細胞毒性功能[16]。Cao等[17]使用共培養(yǎng)建立的高級別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer,HGSOC)免疫類器官對抗靶向程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1,PD-1)治療的耐藥機制展開研究,發(fā)現(xiàn)間質(zhì)腫瘤浸潤肥大細胞促進了抗PD-1治療的耐藥性,并與HGSOC的免疫逃逸亞型有關(guān)。Jenkins團隊[18]使用微流控3D培養(yǎng)技術(shù)分別建立了小鼠來源和患者來源的免疫類器官,不但可以預測免疫檢查點阻斷(immune checkpoint blockade,ICB)治療的效果,同時還捕獲了與PD-1阻斷反應和耐藥性相關(guān)的關(guān)鍵特征。此外,ALI培養(yǎng)方法建立的人和小鼠的免疫類器官同樣可以用于預測ICB治療的效果[7]。

2.2 過繼細胞免疫治療

過繼細胞免疫治療通常是指從腫瘤患者體內(nèi)分離免疫活細胞,在體外進行擴增和功能鑒定,然后向患者回輸。如利用基因工程,將T細胞與腫瘤嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)結(jié)合,經(jīng)過改造的嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)可以識別腫瘤抗原,從而達到直接殺傷腫瘤或激發(fā)機體免疫應答殺傷腫瘤細胞的目的[19]。CAR-T療法在血液系統(tǒng)腫瘤中顯示出強大的治療效果,但對于實體腫瘤的療效一直難以捉摸[20]。Schnalzger團隊[21]成功模擬了嵌合抗原受體自然殺傷細胞92(chimeric antigen receptor-engineered natural killer-92 cells,CAR-NK-92)靶向腫瘤抗原EGF受體變異體III(EGF receptor variant III,EGFRvIII)和卷曲蛋白受體(frizzled,FZD)對結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)免疫類器官的腫瘤抗原特異性細胞毒性。Zou等[22]構(gòu)建了T細胞與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共培養(yǎng)的肝細胞癌免疫類器官,并發(fā)現(xiàn)CD39+的HBVs-CAR-T細胞可以誘導類器官的凋亡。共培養(yǎng)免疫類器官在建立時具有高選擇性,可作為開展CAR介導的免疫治療研究的良好平臺。

2.3 溶瘤病毒療法

溶瘤病毒是一類能選擇性感染和殺傷腫瘤細胞的病毒,可以保留非腫瘤性宿主細胞,直接溶解腫瘤細胞并將病毒傳播到附近細胞,同時觸發(fā)細胞因子的釋放和免疫系統(tǒng)的激活,刺激機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應[23]。Raimondi等[24]建立了正常胰腺類器官與胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)腫瘤類器官,測試了類器官作為溶瘤腺病毒治療篩選平臺的可行性,結(jié)果顯示溶瘤腺病毒具有良好的選擇性,僅在PDAC類器官中復制;該研究還顯示了溶瘤腺病毒的細胞毒性及與標準化療協(xié)同作用的個體差異性,表明類器官可以作為溶瘤病毒治療臨床前反應的合適模型。此外,在一項基于乳腺癌(breast cancer,BC)類器官的研究中,研究者測試了麻疹疫苗病毒和痘苗病毒對于BC溶瘤治療的效果,結(jié)果提示所有溶瘤病毒均顯著抑制了BC類器官的存活[25]。借助類器官平臺可以幫助測試和設(shè)計溶瘤病毒治療方案,但目前基于溶瘤病毒研究所使用的是腫瘤類器官平臺;腫瘤類器官在溶瘤病毒的傳染性和細胞毒性方面均顯示了良好的潛力,但尚缺乏溶瘤病毒引發(fā)免疫反應的實驗研究,免疫類器官的應用也許可以為溶瘤病毒療法帶來新的希望。

2.4 聯(lián)合治療

免疫治療逐漸開始聚焦于探索免疫聯(lián)合療法,比如利用多個免疫檢查點和免疫抑制細胞群聯(lián)合療法、免疫治療與放化療聯(lián)合治療及ICI與分子靶向聯(lián)合治療等[26-28]。免疫類器官作為體外優(yōu)勢模型,在精確捕獲腫瘤異質(zhì)性的同時高度模擬TME,可以較為真實地反映患者體內(nèi)的病理生理變化,為聯(lián)合治療的探索和療效評估提供了有力平臺。Jenkins等[18]利用微流控3D培養(yǎng)建立免疫類器官,發(fā)現(xiàn)TANK結(jié)合激酶1/kappa B抑制因子激酶ε抑制劑可以通過靶向抑制細胞因子信號通路,增強腫瘤細胞對PD-1阻斷劑的反應;這種聯(lián)合治療模式可能為克服PD-1阻斷劑耐藥提供一種新的解決方案[18]。Usui等[29]利用ALI法建立了包含腫瘤干細胞的CRC免疫類器官,通過使用刺猬信號通路抑制劑抑制干細胞標記物c-Myc、CD44和Nanog的表達,可以逆轉(zhuǎn)腫瘤對5-氟尿嘧啶和伊立替康的耐藥性,抑制類器官的生長。免疫類器官可以提供一種操作性和準確性極高的平臺,以開發(fā)新的聯(lián)合治療組合,推動臨床轉(zhuǎn)化,最終實現(xiàn)個性化免疫治療。

3 結(jié)論與展望

在合適培養(yǎng)條件下,免疫類器官模擬的TME也許能做到包含完整的免疫細胞類型,接近真實地反映體內(nèi)腫瘤上皮細胞-免疫細胞間的相互作用,從而評估免疫治療反應。但是免疫類器官中的TME成分會隨著時間部分丟失,如何使免疫細胞長期維持是一個亟待解決的問題。除此之外,免疫類器官的培養(yǎng)成功率主要取決于腫瘤類型和取材部位,在某些情況下,還會受到建立時間的影響[30],為了使免疫類器官成為有效的臨床前決策工具,控制類器官的建立時間至關(guān)重要。

免疫類器官在模擬免疫治療效果、研究耐藥機制及開發(fā)新的聯(lián)合治療方案方面具有巨大潛力,相信隨著培養(yǎng)方案的不斷優(yōu)化,免疫類器官可以推動腫瘤免疫治療的臨床轉(zhuǎn)化,最終實現(xiàn)個性化免疫治療。