凌娟娟，胡繼文，王軍輝，安三平，王麗芳，許 娜，朱天擎

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林木種質(zhì)資源平臺(tái)，北京 100091；2.林木遺傳育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，北京 100091；3.甘肅省小隴山林業(yè)科學(xué)研究所，甘肅省次生林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 天水 741022)

體細(xì)胞胚胎發(fā)生（體胚發(fā)生）是規(guī)?；庇帜玖挤N的一項(xiàng)重要技術(shù)，相較其他無(wú)性繁殖方式，體胚發(fā)生具有徹底幼化、繁殖數(shù)量大及速度快等優(yōu)點(diǎn)，至今已被廣泛應(yīng)用于云杉優(yōu)良無(wú)性系繁育中。云杉（Picea asperataMast.）是構(gòu)成低緯度高海拔群落的主要針葉樹(shù)種，在陸地生態(tài)系統(tǒng)中占有重要生態(tài)地位。此外，云杉具有單位面積蓄積量高，木質(zhì)纖維長(zhǎng)而柔軟的特點(diǎn)，是高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的建筑及紙漿材原料。然而在實(shí)際生產(chǎn)中，云杉體胚的快繁技術(shù)仍面臨萌發(fā)率和轉(zhuǎn)換率低的問(wèn)題。因此，解決云杉體胚萌發(fā)率低，實(shí)現(xiàn)高效的云杉規(guī)模化繁育體系對(duì)生態(tài)文明建設(shè)及木材可持續(xù)利用均具有重要意義。

植物體胚與合子胚均具有轉(zhuǎn)變?yōu)橥暾仓甑哪芰?。通常合子胚，即種子發(fā)育的最后會(huì)經(jīng)歷成熟脫水階段，獲得脫水耐受性，提高萌發(fā)能力[1]。例如苜蓿（Medicago sativaL.）種子從果實(shí)中分離需處于成熟脫水階段才能萌發(fā)[2]，表明了脫水過(guò)程對(duì)于胚萌發(fā)的重要性。以合子胚獲得脫水耐受性可提高萌發(fā)能力為參考，早期研究發(fā)現(xiàn)將云杉體胚置于干燥或高滲透壓條件下，降低其含水量能夠有效提高體胚萌發(fā)率，該方法被稱(chēng)為干化[3-5]。干化對(duì)體胚的整體外觀和微觀形態(tài)都有著顯著影響，整體觀察，干化能使云杉體胚顏色發(fā)生改變，根據(jù)色素沉積的多少可將干化體胚分為綠色子葉胚（胚根為紅色，胚軸和子葉為綠色）和非綠色子葉胚（胚根、胚軸和子葉與干化前變化不大）兩類(lèi)。其中綠色子葉胚的萌發(fā)率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非綠色子葉胚，這種表型差異也被用以簡(jiǎn)單快捷地判斷干化是否成功[6-7]。此外，可以觀察到云杉體胚表層在干化后呈皺縮狀[8]，暗示了在干化過(guò)程中體胚細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。有研究表明，當(dāng)裸子植物合子胚經(jīng)歷脫水時(shí)，細(xì)胞收縮產(chǎn)生的張力可能導(dǎo)致干燥敏感的細(xì)胞受到不可逆的損傷，但細(xì)胞壁折疊在整個(gè)脫水過(guò)程中能保持質(zhì)膜和細(xì)胞壁的連接，從而確保細(xì)胞完整性[9-10]。這也是植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中依賴(lài)改變細(xì)胞壁構(gòu)象來(lái)應(yīng)對(duì)各種環(huán)境刺激的機(jī)制。體胚和合子胚高度相似，如白云杉成熟體胚，其形態(tài)上除了胚的大小、子葉的取向和表面起皺等方面與合子胚存在一定差異外，其總體形態(tài)與發(fā)育階段一致的合子胚非常相似[8]。然而，至今還沒(méi)有可靠的科學(xué)證據(jù)表明細(xì)胞壁構(gòu)型的動(dòng)態(tài)變化是云杉體胚響應(yīng)干化的一種模式。最近關(guān)于挪威云杉干化體胚解剖觀察的研究顯示，干化后體胚解剖結(jié)構(gòu)變化顯著，表現(xiàn)為細(xì)胞積累大量的脂質(zhì)體和顯著降低的淀粉粒[7]，然而限于顯微結(jié)構(gòu)放大倍數(shù)的，該研究并未觀察到干化細(xì)胞明顯的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化。

綜合早期研究的證據(jù)，本課題組認(rèn)為干化后云杉體胚特定的解剖結(jié)構(gòu)，特別是細(xì)胞壁的可塑性可能是萌發(fā)率提高的原因之一。為了證實(shí)這一假設(shè)，本研究通過(guò)光學(xué)顯微和電子顯微觀察精準(zhǔn)地分析干化對(duì)體胚解剖結(jié)構(gòu)的影響，建立了細(xì)胞形態(tài)變化與萌發(fā)的關(guān)系，同時(shí)分析了干化體胚子葉和胚根的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，旨在揭示干化影響粗枝云杉的關(guān)鍵表型和基因表達(dá)模式，最終為全面解析干化促進(jìn)體胚萌發(fā)的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的粗枝云杉（Picea asperataMast.）胚性細(xì)胞系a 為材料進(jìn)行云杉體胚發(fā)生，再以誘導(dǎo)形成的體胚進(jìn)一步開(kāi)展關(guān)于干化促進(jìn)體胚萌發(fā)的研究。將繼代培養(yǎng)14 d 的高胚性細(xì)胞系a 組織團(tuán)塊接種至裝有80 mL 液體增殖培養(yǎng)基（調(diào)整過(guò)的Litvay 基本培養(yǎng)基[11]+ 10 μmol·L-12,4-D + 5 μmol·L-16-BA + 10 g·L-1蔗糖 + 1 g·L-1酶解酪蛋白，培養(yǎng)基冷卻至室溫時(shí)加入過(guò)濾滅菌的谷氨酰胺至終濃度為0.5 g·L-1）中，23 ± 1 ℃，110 rpm 震蕩暗培養(yǎng)，每7 d 繼代一次。將獲得的胚性組織接種至分化培養(yǎng)基（1/2 LM + 26 mg·L-1ABA + 50 g·L-1PEG4000 + 30 g·L-1蔗糖 + 活性炭1 g·L-1+ 凝膠4 g·L-1，附加1 g·L-1水解酪蛋白，0.5 g·L-1過(guò)濾滅菌的谷氨酰胺）上誘導(dǎo)獲得成熟的體細(xì)胞胚。具體步驟為：用吸頭剪口的移液器吸取4 mL 左右的懸浮培養(yǎng)液到裝有定性濾紙（Whatman）的布氏漏斗上，使用真空泵真空抽濾，得到吸附有胚性組織的濾紙。將濾紙轉(zhuǎn)接到固體分化培養(yǎng)基上。于23 ± 1 ℃ 下暗培養(yǎng)6～8 周。挑選形態(tài)基本一致的成熟子葉胚，采用“濾紙法”[6]進(jìn)行干化處理。具體步驟為：將發(fā)育完全的體胚置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿（35 mm × 12 mm）上，隨后將培養(yǎng)皿置于大規(guī)格培養(yǎng)皿（87 mm ×15 mm）內(nèi)，大培養(yǎng)皿中加入10 mL 無(wú)菌水，用封口膜密封，最后置于15 μmol·m-2·s-1的弱光下培養(yǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1 體胚萌發(fā)狀況和萌發(fā)率統(tǒng)計(jì) 將干化處理1、7、9、12、14、20 和28 d 后的體胚分別接種至萌發(fā)培養(yǎng)基（1/2 LM + 20 g·L-1蔗糖 + 2 g·L-1活性炭，附加6 g·L-1凝膠，1 g·L-1酶解酪蛋白，0.5 g·L-1過(guò)濾滅菌的谷氨酰胺）上進(jìn)行萌發(fā)，萌發(fā)條件設(shè)置為16 h 光照，18～20 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度，24 ± 1 ℃。通過(guò)目測(cè)統(tǒng)計(jì)每份培養(yǎng)皿中體胚的生根情況，以根系分化露白為萌發(fā)指標(biāo)，計(jì)算萌發(fā)體胚占總體胚數(shù)的比例，以此作為體胚的萌發(fā)率，每個(gè)處理統(tǒng)計(jì)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)統(tǒng)計(jì)約50個(gè)體胚。使用超景深3D 顯微鏡DVM6A（Leica，Germany）觀察干化0、1、7、9 和14 d 的體胚形態(tài)。

1.2.2 掃描電鏡樣品制備 （1）將未干化和干化14 d 的體胚對(duì)半切開(kāi)，置于10 倍樣品體積的0.1 mol·L-1PB（pH7.2～7.4） 配制的 2.5%的戊二醛固定液（4 ℃預(yù)冷）中，抽真空兩次，每次10 min（第一次抽完之后，樣品沉底，將浮在上面的樣品棄掉），更換固定液4 ℃避光固定48 h。（2）使用PB 緩沖液沖洗兩次，每次15 min。（3）梯度乙醇（70%、80%、90%、95%、100%）4 ℃條件下脫水，每次15 min。（4）使用全自動(dòng)臨界點(diǎn)干燥儀（Leica EM CPD300，USA）進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥。（5）使用高真空鍍膜機(jī)（Leica EM ACE600，USA）鍍鉑金4 nm。（6）樣品置于高新場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（日立SU8230，Japan）下觀察體胚的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.3 半薄切片制作和顯微觀察 （1）將體胚切成小塊，放入2.5%戊二醛固定液中，0～4 ℃固定3 h 以上；經(jīng)0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液清洗3 次，丙酮逐級(jí)脫水，Epon 樹(shù)脂浸透包埋；最后在60 ℃烘箱中聚合。（2）通過(guò)超薄切片機(jī)（Lecia EM U7，Germany）切取1～2 μm 左右的切片。（3）然后將切片置于烤片機(jī)上45 ℃烤片，隨后使用甲苯胺藍(lán)染液進(jìn)行染色，隨后用50%乙醇沖洗，并再次把切片烘干。切片樣品在光學(xué)顯微鏡（Olympus BX51，Japan）下進(jìn)行觀察。

1.2.4 透射電鏡樣品制備和觀察 （1）將0.5～1 mm 見(jiàn)方的樣品塊置于0.1 mol·L-1PB（pH7.2～7.4） 配制的 2.5% 的戊二醛固定液（4 ℃預(yù)冷）中固定（與掃描電鏡觀察所用樣品固定方法一致）。（2）PB 緩沖液清洗4～8 遍，每次0.5～1 h。（3）1%鋨酸4 ℃避光固定2～8 h，雙蒸水清洗4 遍，每次15～30 min。（4）2%UA，2 h 避光，更換新的2 mL 管，雙蒸水清洗4 遍，每次20 min，用檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色。（5）44 ℃條件下梯度乙醇逐級(jí)脫水。（6）室溫下乙醇梯度脫水。（7）丙酮樹(shù)脂逐級(jí)滲透。（8）將樣品轉(zhuǎn)移至500 μL 管，將切面與管底部平行，45 ℃放置2 h，再60 ℃，靜置24～48 h。（9）用鉆石刀在超薄切片機(jī)下切片，制作好的切片置于透射電鏡下（HITACHI HT-7700, Japan）觀察。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)自課題組之前的研究基礎(chǔ)，詳細(xì)數(shù)據(jù)存入PICEAdatabase（http://www.piceadb.com/）[12]。本研究利用干化處理14 d 和未處理的體胚子葉和胚根的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。將readcount 數(shù)據(jù)上傳到OmicShare Tools 平臺(tái)（https://www.omicshare.com），使用DEseq2 工具來(lái)進(jìn)行差異分析，差異基因必須滿(mǎn)足以下條件: 差異倍數(shù)fold change（FC）≥ 2, 顯著性值Q value ＜ 0.05。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析和圖表制作 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan 法多重比較。使用GraphPad Prism 8 和 Adobe Illustrator CS6 軟件生成圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗枝云杉體細(xì)胞胚的分化、干化和萌發(fā)

本研究所采用的粗枝云杉體胚由胚性組織（圖1 a）分化而來(lái)，詳細(xì)的分化過(guò)程如圖1 所示。將胚性組織置于分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加體胚的形態(tài)逐漸顯現(xiàn)（圖1 b），數(shù)量逐步增加。未成熟子葉胚的胚根處呈半透明狀，子葉未完全形成（圖1 c）。大約分化50 d 后會(huì)形成大量的成熟子葉胚（圖1 d），成熟子葉胚具有完整的子葉和胚根（圖1 e）。

分化形成的成熟子葉胚（圖2 a）通常需要經(jīng)過(guò)干化處理來(lái)提高萌發(fā)率。本研究中干化處理能使粗枝云杉體胚在形態(tài)上產(chǎn)生顯著的改變，相比于未干化的體胚，干化7 d 后體胚的胚根處逐漸變紅，隨著干化時(shí)間增加紅色隨之加深（圖2 b），而在干化14 d 后體胚形成綠色子葉（圖2 c）。干化處理后的體胚在萌發(fā)培養(yǎng)基中具有較高的萌發(fā)率，如圖2 d 所示，萌發(fā)20 d 后胚軸伸長(zhǎng)明顯。體胚苗轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)瓶后胚根繼續(xù)萌發(fā)（圖2 e），子葉逐漸展開(kāi)，隨后逐漸形成針葉（圖2 f）。

圖2 粗枝云杉體胚干化和萌發(fā)過(guò)程Fig.2 Somatic embryo desiccation and germination of P.asperata

2.2 干化時(shí)間對(duì)云杉體胚萌發(fā)的影響

為探究干化對(duì)體胚的形態(tài)影響，本研究觀察了不同干化時(shí)間粗枝云杉體胚的形態(tài)變化，研究對(duì)比了干化0、1、7、9 和14 d 的體胚以及其萌發(fā)6 d的形態(tài)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未干化和干化1 d 體胚胚根處均沒(méi)有明顯的紅色色素沉積，其中未干化的體胚（圖3a）萌發(fā)后容易形成玻璃化體胚，胚軸伸長(zhǎng)緩慢，子葉分化停滯（圖3f）。干化1 d 的體胚誘導(dǎo)萌發(fā)后可以形成較為明顯的綠色子葉，且胚軸伸長(zhǎng)顯著，然而胚軸和胚根呈半透明狀（圖3b，g）。干化7 d 和9 d 的粗枝云杉體胚胚根處呈明顯紅色，萌發(fā)后的胚軸伸長(zhǎng)顯著，但胚軸和胚根處仍呈半透明狀（圖3c，d，h，i）。而干化14 d 的體胚胚根紅色最為明顯，子葉呈淺綠色，萌發(fā)后發(fā)育正常，幾乎不再出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，子葉進(jìn)一步分化，逐漸形成針葉的雛形（圖3j），胚軸和胚根緊實(shí)，不再具有半透明特征。

圖3 干化處理不同時(shí)期粗枝云杉體胚的萌發(fā)狀態(tài)Fig.3 The germination state of somatic embryos of P.asperata at different periods under desiccation

為了高效地利用干化技術(shù)促進(jìn)云杉體胚萌發(fā)，本研究探究了不同干化時(shí)間對(duì)體胚萌發(fā)率的影響，統(tǒng)計(jì)了未干化、干化1、7、9、12、14、20 和28 d 的粗枝云杉體胚萌發(fā)30 d 的生根率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著干化時(shí)間的增加體胚的萌發(fā)率逐漸提高，干化7 d 體胚的萌發(fā)率便能顯著高于未干化體胚，且為未干化體胚的3 倍左右。而干化14 d 體胚萌發(fā)率達(dá)到最高，約72%，顯著高于其他干化時(shí)間的體胚。之后干化時(shí)間的增加不再顯著提高萌發(fā)率，干化28 d 時(shí)體胚萌發(fā)率降低至55%左右（圖4）。

圖4 不同干化處理時(shí)期粗枝云杉體胚生根情況Fig.4 Rooting of somatic embryos of P.asperata at different desiccation stages

2.3 干化處理云杉體胚的顯微結(jié)構(gòu)變化

為深入探究干化對(duì)云杉體胚形態(tài)造成的影響，研究利用了光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡分別觀察了并對(duì)比了未干化和干化14 d 粗枝云杉體胚表面和細(xì)胞內(nèi)的顯微和超微結(jié)構(gòu)。掃描電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)未干化體胚（圖5a）和干化14 d體胚（圖5d）表面存在顯著差異，干化14 d 后體胚的表面呈皺縮狀。高倍視野下觀察可見(jiàn)，體胚子葉表面細(xì)胞因干化失水出現(xiàn)離散現(xiàn)象，組織表面呈皺縮狀（圖5b、e）。相對(duì)未干化體胚下胚軸（圖5c），干化體胚下胚軸表面（圖5f）的細(xì)胞同樣表現(xiàn)出皺縮狀，呈不規(guī)則排列。

圖5 干化體胚外表面超微結(jié)構(gòu)Fig.5 Ultrastructure of outer surface of somatic embryo after desiccation

研究通過(guò)光學(xué)顯微觀察了未干化和干化14 d粗枝云杉體胚的顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未干化體胚（圖6a）和干化14 d 體胚（圖6e）之間解剖結(jié)構(gòu)存在顯著差異。干化處理后體胚（圖6f）的頂端分生組織較未干化體胚（圖6b）明顯凸起，細(xì)胞數(shù)量增多。此外，干化14 d 體胚上胚軸（圖6g）和下胚軸（圖6h）的細(xì)胞均變得皺縮且分布不規(guī)則，不同于干化前（圖6c，d）整齊飽滿(mǎn)的細(xì)胞特征。特別是下胚軸部分，干化后組織結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出明顯的空洞（圖6h），但并未破壞根頂端分生組織。這種細(xì)胞皺縮的現(xiàn)象與掃描電鏡觀察的結(jié)果相一致，我們推測(cè)這種結(jié)構(gòu)變化可能與干化體胚萌發(fā)率提高有密切關(guān)系。

圖6 干化體胚顯微結(jié)構(gòu)Fig.6 Microstructure of somatic embryo after desiccation

透射電鏡的結(jié)果發(fā)現(xiàn)未干化體胚上胚軸和下胚軸的細(xì)飽形態(tài)飽滿(mǎn)，其中上胚軸細(xì)胞呈規(guī)則的多邊形，能觀察到明顯的初生壁和細(xì)胞角隅（圖7 a，c）；下胚軸細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞壁分化程度相對(duì)較低（圖7 b，d）。不同的是，干化14 d 體胚胚軸處細(xì)胞的形態(tài)受到破壞，呈現(xiàn)出明顯的皺縮狀（圖7 e，g），高倍視野下細(xì)胞壁不再具有剛性，且表現(xiàn)出松弛的扭曲狀（圖7 f，h），特別是下胚軸細(xì)胞基本已經(jīng)無(wú)法觀察到細(xì)胞壁分層結(jié)構(gòu)（圖7 h）。此外，未干化的成熟體胚細(xì)胞中富含淀粉粒（SG）（圖7 i），而經(jīng)過(guò)干化處理后體胚細(xì)胞中淀粉?；鞠В|(zhì)體（LPS）的數(shù)量顯著增多（圖7 j）。

圖7 干化體胚細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.7 Ultrastructure of cells of somatic embryo after desiccation

2.4 干化處理云杉體胚差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本分析

為了探究導(dǎo)致干化后粗枝云杉體胚表型變化的內(nèi)在分子調(diào)控因素。本研究分析了干化處理前后粗枝云杉體胚子葉和胚根的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)數(shù)據(jù)，其中未干化體胚子葉檢測(cè)到20 512 個(gè)轉(zhuǎn)錄本（CD0）、未干化體胚胚根檢測(cè)到20 802 個(gè)轉(zhuǎn)錄本（RD0）、干化處理14 d 體胚子葉含有21 867 個(gè)轉(zhuǎn)錄本（CD14）以及干化處理14 d 體胚胚根檢測(cè)到22 032 個(gè)轉(zhuǎn)錄本（RD14）（Lu 等，2019）。其中CD14 含有299 個(gè)特異的轉(zhuǎn)錄本，RD14 含有435 個(gè)特異轉(zhuǎn)錄本（圖8a）。差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，CD14 vs CD0 比較組中分別檢測(cè)到4 977 和1 683 個(gè)轉(zhuǎn)錄本顯著上調(diào)和下調(diào)（圖8b）。而在RD14 vs RD0 比較組中，共發(fā)現(xiàn)4 284 個(gè)轉(zhuǎn)錄本顯著上調(diào)，1 571 個(gè)轉(zhuǎn)錄本顯著下調(diào)（圖8c）。這些轉(zhuǎn)錄本是挖掘響應(yīng)干化候選基因的主要目標(biāo)。

圖8 干化粗枝云杉體胚子葉和胚根的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本分析Fig.8 Analysis of differentially expressed transcripts in cotyledon and radicle of somatic embryo after desiccation

本研究已通過(guò)解剖結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)干化導(dǎo)致粗枝云杉體胚細(xì)胞壁松弛，細(xì)胞不再具規(guī)則多邊形形態(tài)，排列疏松。細(xì)胞壁松弛和重塑與膨脹素基因（Expansins，EXPA）、木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶基因（ Xyloglucar endotransglucosylase/hydrolase，XTH）及葡萄糖基水解酶基因（βglucosidase，BGLU）等相關(guān)。轉(zhuǎn)錄組分析（圖9）顯示29 個(gè)影響細(xì)胞壁微纖絲構(gòu)型的XTHs轉(zhuǎn)錄本中大部分顯著上調(diào)2 倍以上，僅MA_144503g0010成員在干化子葉和胚根中均顯著下調(diào)。類(lèi)似的，發(fā)現(xiàn)16 個(gè)細(xì)胞擴(kuò)展的EXPAs轉(zhuǎn)錄本在干化后體胚中差異表達(dá)，MA_467939g0010 和MA_10425823g 0010 表達(dá)量（RPKM）均超過(guò)50，具有較高的表達(dá)水平，且在干化胚根中表達(dá)分別為未干化胚根的5.54 和2.75 倍，暗示了它們可能是響應(yīng)干化影響細(xì)胞延展性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄本。此外，研究還發(fā)現(xiàn)了9 個(gè)干化后顯著上調(diào)和3 個(gè)干化后顯著下調(diào)的PMEs轉(zhuǎn)錄本。該類(lèi)基因參與細(xì)胞壁果膠的甲酯化過(guò)程，影響細(xì)胞壁的剛性，它們的差異表達(dá)可能是干化體胚細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度和流動(dòng)性改變的潛在原因之一。由此可見(jiàn)，這些細(xì)胞性質(zhì)決定基因的差異表達(dá)可能共同導(dǎo)致了干化體胚細(xì)胞壁重塑，促使其表現(xiàn)出松弛狀態(tài)。

圖9 干化體胚細(xì)胞壁重塑轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)分析Fig.9 Differential expression analysis of cell wall remodeling transcripts of somatic embryo after desiccation

3 討論

體細(xì)胞胚與合子胚的發(fā)育過(guò)程高度相似，合子胚在成熟過(guò)程中往往會(huì)經(jīng)歷脫水耐受和后熟階段，以促進(jìn)新陳代謝的重組和貯藏化合物積累（蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物）為萌發(fā)作準(zhǔn)備。如果未達(dá)到適宜的條件，即使形態(tài)上完整的胚也不能夠保證正常的萌發(fā)[13]。研究人員參照合子胚獲得脫水耐受性能促進(jìn)萌發(fā)的模式，采用干化處理來(lái)促進(jìn)體胚的萌發(fā)[3]。

干化對(duì)體胚的影響類(lèi)似于大多數(shù)合子胚萌發(fā)需經(jīng)歷的后熟過(guò)程，其誘導(dǎo)的分子和生物學(xué)變化不是單純的延長(zhǎng)成熟階段[14]。干化就像起到了一種使胚從“發(fā)育模式”轉(zhuǎn)向“萌發(fā)模式”的“開(kāi)關(guān)”作用。有研究發(fā)現(xiàn)，形態(tài)成熟的體胚在干化處理后進(jìn)一步改變了狀態(tài)，比較明顯的例子是粗枝云杉體胚在干化后胚軸和子葉呈深綠色，胚根轉(zhuǎn)變?yōu)樯罴t色[6]，這也成為了鑒別粗枝云杉干化成功與否的標(biāo)志。在此基礎(chǔ)之上，本研究觀察并比較了干化后粗枝云杉體胚微觀解剖特征的變化。掃描電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)粗枝云杉體胚干化14 d 后體胚外表皮呈皺縮狀，該結(jié)果與白云杉干化體胚表皮皺縮結(jié)果一致[8]。光學(xué)顯微和透射電鏡的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)干化后粗枝云杉體胚細(xì)胞排列疏松表現(xiàn)出明顯的形變特征，細(xì)胞壁不再具有規(guī)則剛性結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為松弛狀態(tài)。隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化與細(xì)胞壁延展性的變化有關(guān)[15]，也逐漸意識(shí)到細(xì)胞分化過(guò)程中，細(xì)胞壁的組成、機(jī)械性質(zhì)等發(fā)生改變不再只是細(xì)胞分化的“結(jié)果”，也可能會(huì)反過(guò)來(lái)調(diào)控細(xì)胞分化[16]，例如，細(xì)胞壁果膠甲酯化程度降低利于葉原基的分化[17]；Tabernaemontana catharinensisA.DC.的乳汁管分化和生長(zhǎng)始于莖尖細(xì)胞壁的分解和松散[18]。纖維素細(xì)胞壁的正確構(gòu)建對(duì)于植物細(xì)胞的塑造和分化至關(guān)重要[19]。因此，我們推測(cè)干化導(dǎo)致的體胚細(xì)胞壁松弛可能解除了細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞分化和伸長(zhǎng)的束縛，利于器官的形成，提高體胚萌發(fā)率。

細(xì)胞壁的松弛主要由多種蛋白質(zhì)介導(dǎo)，包括EXPA、XTH 和BGLU[20]。其中EXPA 是一類(lèi)最早被發(fā)現(xiàn)作為細(xì)胞壁pH 依賴(lài)性延伸的介質(zhì)蛋白，可分為EXPA、EXPB、EXLA 和EXLB 四個(gè)亞家族[21]。在酸性條件下被激活，并通過(guò)改變纖維素微纖維和木葡聚糖之間的交聯(lián)而誘導(dǎo)不可逆的壁延伸[15,20]。這種細(xì)胞壁的延展性變化直接影響植物器官的發(fā)育，有研究表明擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.）種子萌發(fā)前EXPA2 能調(diào)節(jié)胚乳細(xì)胞擴(kuò)張輔助胚的生長(zhǎng)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)EXPAs在干化體胚中顯著上調(diào)表達(dá)，可能是導(dǎo)致細(xì)胞壁松弛的主要因素，驅(qū)動(dòng)了胚胎細(xì)胞的擴(kuò)張，這可能也是導(dǎo)致干化粗枝云杉體胚萌發(fā)過(guò)程中胚軸顯著伸長(zhǎng)的原因。類(lèi)似的，XTH 負(fù)責(zé)圍繞著纖維素微纖絲的木葡聚糖分子的裂解和連接，導(dǎo)致細(xì)胞壁松弛和重塑，該基因的表達(dá)直接與細(xì)胞擴(kuò)展性和胚軸伸長(zhǎng)相關(guān)[23-24]，因?yàn)槟酒暇厶鞘峭ㄟ^(guò)氫鍵與纖維素微纖絲結(jié)合，該結(jié)構(gòu)變化有助于細(xì)胞伸長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞壁的松動(dòng)或硬化[25]。本研究中多個(gè)XTHs在干化粗枝云杉體胚中顯著差異表達(dá)，且大部分上調(diào)表達(dá)，可能進(jìn)一步改變了干化粗枝云杉體胚細(xì)胞壁的物理性質(zhì)，促進(jìn)了組織分化和生長(zhǎng)。細(xì)胞壁中果膠能夠在水合作用和硬度方面發(fā)生巨大變化，從而改變細(xì)胞和組織的表型，例如，增加細(xì)胞壁果膠的硬度可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)下降。另一方面，果膠的甲酯化程度決定了細(xì)胞壁的剛性、流動(dòng)性等物理性質(zhì)，通常果膠甲酯化程度越低細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度越高[26]，這一過(guò)程由果膠甲酯酶（Pectin methylesterase，PME）介導(dǎo)完成，PME 主要行使去甲酯化的作用[27]，調(diào)節(jié)細(xì)胞壁中果膠的甲酯化程度來(lái)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育。已有報(bào)道表明果膠的去甲酯化是歐洲栓皮櫟（Quercus suberL.）體胚發(fā)生所必需的[28]。粗枝云杉體胚干化后9 個(gè)顯著上調(diào)，3 個(gè)顯著下調(diào)的PMEs可能也參與了體胚細(xì)胞壁強(qiáng)度調(diào)控，PMEs抑制表達(dá)是細(xì)胞壁流動(dòng)性增強(qiáng)的因素，而多個(gè)PMEs上調(diào)表達(dá)理論可能限制細(xì)胞的生長(zhǎng)，這不符合干化降低細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)限制的假設(shè)，推測(cè)下調(diào)表達(dá)的PMEs可能才是真正在干化過(guò)程中行使功能的，此外，該過(guò)程可能還存在果膠甲酯酶抑制因子（Pectin methylesterase inhibitor，PMEI）等基因參與其中，類(lèi)似與花粉管伸長(zhǎng)由PME 和PMEI 兩類(lèi)分子合作完成[29]。值得注意的是，在細(xì)胞擴(kuò)展整個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞壁的松弛、重塑和合成必須協(xié)調(diào)進(jìn)行，使細(xì)胞壁在適應(yīng)生長(zhǎng)的同時(shí)，維持完整性[30]。這其中涉及多種基因的共同調(diào)控作用。介于此，我們認(rèn)為EXPAs、XTHs以及PMEs等影響細(xì)胞壁性質(zhì)的基因差異表達(dá)，降低了粗枝云杉體胚下胚軸細(xì)胞壁剛性，解除了胚根細(xì)胞伸長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)限制，最終協(xié)同調(diào)控了體胚細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，最終為萌發(fā)創(chuàng)造了條件。

4 結(jié)論

干化14 d 能有效提高粗枝云杉體胚萌發(fā)率。顯微和超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)干化后體胚子葉和胚根細(xì)胞離散分布，細(xì)胞壁剛性結(jié)構(gòu)消失，呈松弛形態(tài)。多個(gè)影響細(xì)胞壁性質(zhì)和參與細(xì)胞壁重塑的基因，如EXPAs、XTHs和PMEs在干化體胚中顯著高表達(dá)是這一現(xiàn)象產(chǎn)生的潛在原因。本研究認(rèn)為干化導(dǎo)致的體胚細(xì)胞壁松弛可能解除了細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞分化和生長(zhǎng)的限制，從而促進(jìn)了云杉體胚萌發(fā)。