彭雙，宋丹，王一明*，林先貴

1. 江蘇開放大學(xué)環(huán)境生態(tài)學(xué)院，江蘇 南京 210017；2. 中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所/土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210008

隨著畜禽養(yǎng)殖的發(fā)展，中國(guó)是已成為世界上最大的畜禽養(yǎng)殖國(guó)，每年約有38 億噸畜禽糞便產(chǎn)生（Zhao et al.，2022）。將畜禽糞便還田仍是一種常見的廢物處理方式，可提高土壤肥力并增加糧食產(chǎn)量（Li et al.，2021）。然而，隨著抗生素在畜牧業(yè)中的廣泛應(yīng)用，畜禽糞便含有大量殘留抗生素、多種抗生素抗性基因（ARGs）和重金屬（Zhu et al.，2013；Sorinolu et al.，2021；Peng et al.，2022a）。越來(lái)越多的證據(jù)表明，施用糞肥會(huì)明顯增加土壤中ARGs的種類和豐度（Peng et al.，2017；Rahman et al.，2018），導(dǎo)致抗生素抗性細(xì)菌和ARGs 擴(kuò)散至蔬菜中（Zhang et al.，2019；Huang et al.，2021）。同時(shí)，畜禽糞肥還可能含有公共衛(wèi)生相關(guān)病原體（Neill et al.，2018；Alegbeleye et al.，2020），它攜帶的人畜共患病原體可能會(huì)污染新鮮農(nóng)產(chǎn)品（Li et al.，2020；Zhang et al.，2020），進(jìn)而導(dǎo)致食用人群的胃腸道疾病。此外，如果這些人畜共患病原體同時(shí)攜帶ARGs和移動(dòng)遺傳元件（MGE），可能會(huì)對(duì)人類健康造成更為嚴(yán)重的威脅（Zhou et al.，2019）。因此，有必要探討不同土壤環(huán)境條件下，腸道病原菌能否從施肥土壤處獲得ARGs 并在土壤中存活，這對(duì)于指導(dǎo)動(dòng)物糞便的合理施用具有重要的意義。

細(xì)菌獲得抗生素耐藥性有兩種途徑，包括通過自發(fā)基因突變產(chǎn)生ARG 和通過水平基因轉(zhuǎn)移（HGT）獲得ARG。HGT 可導(dǎo)致ARGs 在相同或不同種屬細(xì)菌間傳遞，該過程具有速度快、周期短、范圍廣的特點(diǎn)，因此HGT 被視為ARGs 傳播的主要途徑（胡小婕等，2022）。因?yàn)橹虏〖?xì)菌可以通過HGT 獲得耐藥性（Tang et al.，2023），所以ARGs的水平轉(zhuǎn)移是評(píng)估其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的重要參數(shù)之一。目前大多數(shù)關(guān)于土壤或堆肥環(huán)境中ARGs 水平轉(zhuǎn)移的研究?jī)H關(guān)注MGEs 的豐度變化特征及其與ARGs 以及細(xì)菌群落的相關(guān)性和影響因素（Zhou et al.，2021；Qiu et al.，2022；Zhang et al.，2022；Chen et al.，2023）。一些在實(shí)驗(yàn)室條件下開展的研究表明，土壤礦物硼鈉石、小于100 nm 的塑料顆粒、有機(jī)污染物等物質(zhì)可促進(jìn)ARGs 的轉(zhuǎn)移（Wu et al.，2020；Hu et al.，2022；Li et al.，2022；胡小婕等，2022）。然而，與實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)體系相比，自然狀態(tài)下的土壤或水體環(huán)境非常復(fù)雜，其中的供體/宿主細(xì)菌及抗性質(zhì)粒種類繁多，微生物的生理狀態(tài)也不同，因此量化自然環(huán)境中的ARGs 轉(zhuǎn)移頻率相對(duì)較難。質(zhì)粒介導(dǎo)的接合基因轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是HGT 的主要機(jī)制（S?rensen et al.，2005；Thomas et al.，2005）。目前，已有研究在土壤環(huán)境中觀察到質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移（Krasovsky et al.，1987）。Macedo et al.（2022）將攜帶pKJK5 質(zhì)粒的大腸桿菌（Escherichiacoli）與糞肥混合后施入土壤，發(fā)現(xiàn)質(zhì)?？梢詮募S便轉(zhuǎn)移到土壤細(xì)菌，雖然轉(zhuǎn)移的頻率很低，且主要發(fā)生在施用糞肥后的4 d 內(nèi)。Xu et al.（2021）向含有四環(huán)素的水培系統(tǒng)中接入攜帶RP4 質(zhì)粒的大腸桿菌，通過熒光標(biāo)記來(lái)追蹤質(zhì)粒在擬南芥內(nèi)生菌中的傳播，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌被內(nèi)化到植物組織中，RP4 質(zhì)粒被轉(zhuǎn)移到植物內(nèi)生細(xì)菌中，來(lái)源于土壤的細(xì)菌群落抑制了大腸桿菌的內(nèi)化，但顯著促進(jìn)了RP4 質(zhì)粒向植物微生物組的傳播。Fan et al.（2019）將攜帶抗性質(zhì)粒RP4 的惡臭假單胞菌接種到土壤微宇宙中，在75 天的培養(yǎng)過程中，觀察到RP4 的傳播增加，宿主細(xì)菌的多樣性增加，組成發(fā)生變化。上述研究通過向土壤/水培環(huán)境接入攜帶已知質(zhì)粒的供體細(xì)菌的方式證明在環(huán)境條件下能夠發(fā)生質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移；然而，如果將環(huán)境中攜帶ARGs 的細(xì)菌視作供體，人類致病細(xì)菌是否可以通過HGT 從土壤環(huán)境或糞便獲得ARGs 目前仍然未知。因此，在自然環(huán)境條件下進(jìn)行相關(guān)探索，有助于我們了解環(huán)境中的ARGs 向致病菌轉(zhuǎn)移的潛力和風(fēng)險(xiǎn)。

在腸道病原體中，沙門氏菌是通過食物和水傳播疾病的常見病原體之一（Blanco et al.，2021）。有研究表明畜禽糞便攜帶的沙門氏菌在土壤中可存活968 d（Nicholson et al.，2005）。沙門氏菌在土壤中存活時(shí)間越長(zhǎng)，它們污染水果或蔬菜的可能性就越高。為了了解沙門氏菌在不同類型土壤中的存活時(shí)長(zhǎng)，我們?cè)谇捌谘芯恐蟹治隽松抽T氏菌在進(jìn)入3種土壤后，其存活數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)探討了淹水環(huán)境對(duì)其存活的影響（Peng et al.，2022b）。由于沙門氏菌可在篩選培養(yǎng)基上形成黑色菌落，明顯區(qū)別于其他細(xì)菌類群，為抗生素敏感型沙門氏菌是否能夠從土壤或糞肥獲得ARGs 的研究提供了可能性。四環(huán)素是動(dòng)物糞便中最常見的抗生素（Gaballah et al.，2021），豬糞中常常能夠檢出高濃度的殘留四環(huán)素和四環(huán)素抗性基因（Peng et al.，2022a）。此外，自20 世紀(jì)70 年代以來(lái)，土壤中幾乎所有類別的ARGs 都顯著增加，尤其是四環(huán)素抗性基因增加的最多（Knapp et al.，2010）。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)進(jìn)入土壤90 d 后依然存活的沙門氏菌進(jìn)行了四環(huán)素抗性篩選，對(duì)分離的抗性疑似沙門氏菌進(jìn)行了鑒定和全基因組測(cè)序；并在實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)體系下，分析了分離菌株攜帶的四環(huán)素抗性基因向E.coliO157:H7 的轉(zhuǎn)移能力。本研究探討了人畜共患病原體從土壤環(huán)境或者來(lái)源于土壤環(huán)境的細(xì)菌處獲得ARGs 的潛力，研究結(jié)果可為科學(xué)評(píng)估土壤環(huán)境中ARGs 的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和土壤樣品采集

供試土壤采集自3 個(gè)中國(guó)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)實(shí)驗(yàn)站，分別位于江西省鷹潭縣（28°15′N，116°55′E）、江蘇省常熟市（31°33′N，120°42′E）和河南省封丘縣（35°00′N，114°24′E）。從長(zhǎng)期施用化肥的田間采集土樣（0—20 cm），土壤性質(zhì)詳見Peng et al.（2022b），土壤質(zhì)地分別為紅粘土（R）、壤土（L）和砂質(zhì)壤土（S）。將土壤陰干后過5 mm 篩，將土壤含水量調(diào)節(jié)至土壤最大持水量的三分之一，取5 kg 土壤置于花盆（23 cm×22 cm）中。

鼠傷寒沙門氏菌Salmonellaentericasubsp.enteric serovar Typhimurium（CICC 21484）來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC），為四環(huán)素敏感型沙門氏菌。將單菌落接種到LB 肉湯中，并在37 ℃下培養(yǎng)約16 h。在4 ℃下離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（10 mmol·L-1，pH 7.2）洗滌3 次，懸浮在無(wú)菌去離子水中，調(diào)整菌體密度后與133.82 g 新鮮豬糞（干重為40 g）混合，使新鮮豬糞中的沙門氏菌濃度達(dá)到1011CFU·g-1。將豬糞與表層土壤混合，分別在自然條件下（接收雨水）和淹水狀態(tài)下培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)4 次，詳見Peng et al.（2022b）。在第90 天和120 天采集0—5 cm 土壤，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行四環(huán)素抗性菌株的分離和鑒定。

1.2 土壤中四環(huán)素抗性疑似沙門氏菌菌株的分離和生理生化鑒定

將5 g 新鮮土壤樣品添加到50 mL 磷酸鹽緩沖液（10 mmol·L-1，pH 7.2）中，并在180 r·min-1條件下振蕩30 min。取0.5 mL 土壤懸浮液涂布到添加四環(huán)素的木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂（中國(guó)，海博）平板上，并在37 ℃下培養(yǎng)過夜。XLD平板中四環(huán)素濃度為8 μg·mL-1，在這個(gè)濃度下，土壤中的四環(huán)素抗性細(xì)菌數(shù)量約為106CFU·g-1干土（Peng et al.，2016）。沙門氏菌一般在XLD 上形成黑色菌落，該方法的檢測(cè)限約為100 CFU·g-1干土。經(jīng)平板涂布培養(yǎng)法檢測(cè)，供試土壤和新鮮豬糞中均不含能夠在XLD 培養(yǎng)基上形成黑色菌落的細(xì)菌。

使用從青島海博生物購(gòu)買的HBI 沙門氏菌生化鑒定條（HBIG01）、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)對(duì)分離的抗性細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定，相關(guān)操作根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行，每株菌3 個(gè)重復(fù)。同時(shí)，用HE 瓊脂、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、SS 瓊脂、亞硫酸鉍BS 瓊脂、麥康凱MAC 和三糖鐵TSI 等篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，以鼠傷寒沙門氏菌SalmonellaTyphimurium （CICC 21484）作為對(duì)照，觀察分離菌株在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征。

1.3 DNA 提取、ARGs 檢測(cè)和四環(huán)素抗性菌株16S測(cè)序鑒定

將分離的菌株劃線接種到XLD（含8 μg·mL-1四環(huán)素）平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)；挑單克隆到裝有50 mL LB（含8 μg·mL-1四環(huán)素）的三角瓶中，振蕩培養(yǎng)8h，將菌液轉(zhuǎn)移到50 mL 無(wú)菌離心管中，8 000 g 離心10 min，棄上清，用無(wú)菌水洗兩次，用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（TransGen Biotech,Beijing）提取DNA。土壤或豬糞DNA 分別用FastDNA?SPIN Kit for soil/feces（MP Biomedicals，Santa Ana，CA）試劑盒提取，用HT-qPCR 方法（Peng et al.，2022a）檢測(cè)土壤、豬糞和四環(huán)素抗性菌株是否攜帶329 ARGs 和35 MEGs。

用細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物27F/1492R（Popowska et al.，2012）擴(kuò)增菌株的16S rRNA 基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，得到與預(yù)期相符的條帶，并連接到pEASY-T3 載體上（TransGen Biotech，Beijing），然后克隆到Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞中（TransGen Biotech，Beijing），挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，PCR 驗(yàn)證其攜帶的條帶大小，然后將正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送交華大基因進(jìn)行Sanger 測(cè)序鑒定。

1.4 全基因組測(cè)序和基因注釋

全基因組測(cè)序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成，采用單分子測(cè)序技術(shù)，測(cè)序平臺(tái)為PacBio 和Illumina，使用SMRT Link v5.0.1 軟件對(duì)reads 進(jìn)行組裝，得到初步組裝結(jié)果，把reads比對(duì)到組裝序列上，統(tǒng)計(jì)測(cè)序深度的分布情況，根據(jù)序列長(zhǎng)度及比對(duì)的方法區(qū)分初步組裝的序列為染色體序列還是質(zhì)粒序列，并檢驗(yàn)序列是否成環(huán)。使用GeneMarkS 軟件（http://topaz.gatech.edu/）進(jìn)行細(xì)菌的編碼基因預(yù)測(cè)?；驆u可以編碼多種功能，涉及共生關(guān)系和發(fā)病機(jī)理，還能提高生物的適應(yīng)性。使用軟件IslandPath-DIOMB 預(yù)測(cè)基因島。整合在宿主基因組上的溫和噬菌體的核酸稱之為前噬菌體，通過軟件phiSpy 預(yù)測(cè)前噬菌體。分別使用Diamond 軟件和Resistance Gene Identifier（RGI）軟件，與ARDB 和CARD 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)ARGs進(jìn)行注釋。使用Diamond 軟件，與VFDB 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，注釋毒力因子信息。使用PlasmidFinder（https://cge.food.dtu.dk/services/PlasmidFinder/）注釋質(zhì)粒分型。T2 菌株的全基因組測(cè)序結(jié)果已經(jīng)提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（SUB12441302）。

1.5 四環(huán)素抗性菌株的抗性基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)12 h 的T2 和四環(huán)素敏感型E.coliO157:H7（CICC 10907）菌液離心，收集菌體并用磷酸鹽緩沖液（10 mmol·L-1，pH 7.2）洗滌3 次，用磷酸鹽緩沖液將菌體重懸，制備成菌懸液，兩種菌懸液的濃度均為109CFU·mL-1。參照Wang et al.（2019）的方法將等體積的T2 與E.coliO157:H7 菌懸液混合共培養(yǎng)，并添加鹽酸四環(huán)素使混合液中的四環(huán)素濃度分別為0、0.05、0.5、1、5、8、10、20 和40 μg·mL-1。將混合菌液置于25 ℃培養(yǎng)12、24、120 h后，重新懸浮菌體，取100 μL 共培養(yǎng)菌液，分別涂布于添加四環(huán)素（終濃度為8 μg·mL-1）的XLD 和O157 顯色培養(yǎng)基（青島，海博），同時(shí)在不含四環(huán)素的兩種平板上涂布混合菌液和O157 作為對(duì)照，以計(jì)算混合菌液中T2 和O157 的數(shù)量并確認(rèn)平板中的抗生素有效。利用T2 和E.coliO157:H7 在含或不含四環(huán)素的XLD 和O157 顯色培養(yǎng)基上形成不同顏色的菌落來(lái)區(qū)分供體、受體和接合子：XLD 平板上T2 菌落呈黑色，O157 菌落呈黃色；在O157 顯色培養(yǎng)基上，T2 菌落呈藍(lán)色，O157 菌落為淺紅色。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤和豬糞中ARGs 的構(gòu)成和含量

為了充分了解3 種土壤和豬糞中的ARGs 和MGEs 組成，用HT-qPCR 方法檢測(cè)了豬糞和施用豬糞第1 天的土壤樣品（未淹水處理組）中的329 ARGs 和35 MEGs。豬糞中檢測(cè)到183 種ARGs，26 種MGEs；3 種土壤樣品中分別檢測(cè)到146（L）、152（S）、166（R）種ARGs 和20（L）、22（S）、24（R）種MGEs。土壤和豬糞中不同類型ARGs 的總相對(duì)豐度如圖1 所示，豬糞中含量最多的是氨基糖苷類抗性基因（Aminoglycoside），占比34.8%，其次為四環(huán)素類抗性基因（Tetracycline），占比30.8%。土壤中四環(huán)素類ARGs 在3 種土壤中占比分別為47.3%（R）、30.6%（L）和21.4%（S），氨基糖苷類ARGs 占比分別為18.0%（R）、22.1%（L）和25.5%（S）。其中，tetW、tetO和ermB是土壤和豬糞樣品中平均豐度最高的ARGs；tnpA-06/IS1216和tnpA-04/IS6100是平均豐度最高的MGEs。

圖1 豬糞和施用豬糞第1 天的土壤中ARGs和MGEs 的總相對(duì)豐度Figure 1 The relative abundance (ARG copies/16S rRNA gene copies) of ARGs and MGEs detected in pig manure and different types of soils under natural condition collected on the first day

2.2 土壤中四環(huán)素抗性疑似沙門氏菌菌株的分離和生理生化鑒定

在施肥后的第90 天，通過添加四環(huán)素的XLD平板篩選，僅在不淹水的紅粘土中分離得到3 株能在XLD 平板上形成黑色菌落的四環(huán)素抗性疑似沙門氏菌，該抗性疑似沙門氏菌形成的菌落相對(duì)較小，生長(zhǎng)較慢；該時(shí)期該處理土壤中存活的沙門氏菌數(shù)量為 (4.89±1.89)×104CFU·g-1干土。用沙門氏菌生化鑒定條和篩選培養(yǎng)基分別對(duì)分離到的這3 株抗性菌進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果如表1 所示，3 株抗性菌株可產(chǎn)生半乳糖苷酶，能分解鄰硝基酚-半乳糖苷（ONPG），生成黃色的鄰硝基酚，且不能利用西蒙氏枸櫞酸鹽，吲哚陽(yáng)性，在這些生理生化特性上，與實(shí)驗(yàn)添加的沙門氏菌存在差異，根據(jù)這些特性初步判斷3 株抗性菌為大腸桿菌。在施肥后的第120 天，未分離到具有四環(huán)素抗性的疑似沙門氏菌。

表1 沙門氏菌、大腸桿菌和3 株四環(huán)素抗性菌的生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical identification results of Salmonella, E. coli and three tetracycline resistant strains

2.3 四環(huán)素抗性菌株的測(cè)序鑒定和ARGs 檢測(cè)結(jié)果

對(duì)菌株的基因組進(jìn)行16S rRNA 基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序后，將測(cè)得的序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，結(jié)果如表2 所示，3 個(gè)抗性菌株與大腸桿菌的相似度均達(dá)到99%，說(shuō)明3 株抗性細(xì)菌均為能夠產(chǎn)生H2S 的大腸桿菌，而不是獲得四環(huán)素抗性的沙門氏菌。

表2 3 株四環(huán)素抗性菌測(cè)序和NCBI 比對(duì)結(jié)果Table 2 Sequencing and NCBI comparison results of three tetracycline resistant strains

通過HT-qPCR 檢測(cè)方法，用329 對(duì)ARGs 和35 對(duì)MEGs 引物對(duì)3 株菌的DNA 進(jìn)行了檢測(cè)（部分ARG 種類有多條檢測(cè)引物）。T1、T2 和T3 分別有55、64 和63 個(gè)ARG 引物檢出陽(yáng)性，其中包含了38、44 和43 種ARGs（表3）。T1、T2 和T3 分別攜帶7、11 和10 個(gè)MGEs，其中T3 攜帶的10 種MGEs 在T2 中均能檢測(cè)到。如表3 所示，有37 種ARGs 和5 種MGEs 在3 株菌中共有，此外，3 株菌分別攜帶一些特有ARGs 和MGEs。根據(jù)3 株菌攜帶的ARGs 數(shù)量，選擇T2 進(jìn)行全基因組測(cè)序，以進(jìn)一步了解該菌的基因構(gòu)成和ARGs 分布位點(diǎn)。

表3 3 株四環(huán)素抗性菌攜帶的ARGs 和MGEs 檢測(cè)結(jié)果Table 3 ARGs and MGEs carried by the three tetracycline resistant strains detected by HT-qPCR

2.4 抗性菌株T2 的全基因組分析

將 T2 菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，共得到867 963 947 bp Clean Data，平均序列讀長(zhǎng)為8 951 bp，經(jīng)生物信息學(xué)分析后，該菌株含有一個(gè)4.723 Mb 的染色體（GC 含量為50.88%）和兩個(gè)長(zhǎng)度分別為40.48kb（GC 含量為44.87%）和93.31 kb（GC含量為51.09%）的質(zhì)粒，三者均為環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖2）。共含有4690 個(gè)編碼基因、30 個(gè)CRISPR 序列（均位于染色體上），15 個(gè)基因島（其中1—13 位于染色體，14 和15 分別位于兩個(gè)質(zhì)粒上），8 個(gè)前噬菌體（均位于染色體上），170個(gè)非編碼RNA（指tRNA、rRNA 及sRNA 等3 種），217 個(gè)散在重復(fù)序列。

圖2 T2 菌株染色體和質(zhì)粒圈圖Figure 2 Chromosome and plasmid circle diagrams of strain T2

使用Diamond 軟件，把T2 的4 690 個(gè)基因的氨基酸序列，與NR 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，把T2 的基因和其相對(duì)應(yīng)的功能注釋信息結(jié)合起來(lái)，總共有4 653 個(gè)基因在NR 數(shù)據(jù)庫(kù)得到注釋，其中有3 512個(gè)基因與Escherichia coli的基因相似，595 個(gè)基因與Achromobactersp 基因相似。該注釋結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了16S rRNA 基因測(cè)序鑒定結(jié)果，證實(shí)該菌株為大腸桿菌。該菌株攜帶的兩個(gè)質(zhì)粒序列經(jīng)過blast比對(duì)，結(jié)果如表4 所示，兩個(gè)質(zhì)粒均與大腸桿菌攜帶的質(zhì)粒序列高度相似，其中質(zhì)粒1 攜帶的部分序列與沙門氏菌相似。使用PlasmidFinder 對(duì)兩個(gè)質(zhì)粒的分型進(jìn)行檢索，結(jié)果質(zhì)粒1 為IncX1 型質(zhì)粒（相似度98.93%），質(zhì)粒2 為IncY 型質(zhì)粒（相似度99.48%）。

表4 T2 菌株攜帶的兩個(gè)質(zhì)粒序列比對(duì)結(jié)果Table 4 Sequence comparison results of the two plasmids carried by strain T2

全序列與COG、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot、Nr 等通用數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，其中，與COG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到了3 807 個(gè)注釋基因，包含前噬菌體和轉(zhuǎn)座子共197 個(gè)；與KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到4586 個(gè)注釋基因，其中包含了多個(gè)對(duì)人類致病的基因，例如幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、軍團(tuán)菌病、百日咳、沙門氏菌感染、肺結(jié)核基因等。再將序列與ARDB、CARD、VFDB 和PHI 等功能數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到ARDB 注釋基因34 個(gè)（相似度大于98%）、CARD 注釋基因62 個(gè)（相似度大于91%）（表5），438 個(gè)VFDB 毒力因子，和440 個(gè)經(jīng)PHI注釋的病原體與宿主互作蛋白。注釋的ARGs 中包括了3 種四環(huán)素抗性基因，均位于質(zhì)粒2 上，但是兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果存在差異。

表5 菌株T2 的全基因組序列與ARDB、CARD 比對(duì)后注釋的ARGsTable 5 Antibiotic resistance gene annotated after comparing the whole genome sequence of strain T2 with ARDB and CARD

2.5 四環(huán)素抗性菌的基因轉(zhuǎn)移

將T2 菌體與E.coliO157:H7（四環(huán)素敏感型）菌株共培養(yǎng)，并施加不同濃度梯度的四環(huán)素，觀察T2 菌株能否將四環(huán)素抗性基因轉(zhuǎn)移到E.coliO157:H7。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0、0.05、0.5、1、5、8、10、20 和40 μg·mL-1四環(huán)素作用下，均未分離到獲得四環(huán)素抗性的E.coliO157:H7。說(shuō)明T2 與E.coliO157:H7 在共培養(yǎng)期間，T2 攜帶的四環(huán)素抗性基因沒有轉(zhuǎn)移到O157 菌株。

3 討論

3.1 在土壤環(huán)境中，沙門氏菌未通過HGT 獲得四環(huán)素抗性基因

細(xì)菌病原體對(duì)抗生素的耐藥性發(fā)展使危及生命的細(xì)菌感染的治療大大復(fù)雜化（O’Neill，2014），因此抗菌藥物耐藥性被認(rèn)為是21 世紀(jì)全球衛(wèi)生面臨的主要挑戰(zhàn)之一（Berendonk et al.，2015）。人類攜帶的抗性共生菌或致病菌被認(rèn)為可以通過食物鏈或環(huán)境在人和動(dòng)物之間直接或間接交換傳播；動(dòng)物和人類之間的聯(lián)系，以及環(huán)境在促進(jìn)這種聯(lián)系方面的重要性，被稱為“One Health”框架（Hernando-Amado et al.，2019）。在“One Health”框架下，了解ARGs 在環(huán)境中的歸趨及其向人類致病菌的轉(zhuǎn)移潛力對(duì)于評(píng)估ARGs 的潛在風(fēng)險(xiǎn)和控制ARGs 在環(huán)境中的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散至關(guān)重要。本研究通過向3 種土壤施入含有大量沙門氏菌的糞肥的方式，嘗試了解糞肥及土壤中的四環(huán)素抗性基因轉(zhuǎn)移到沙門氏菌中的可能性。結(jié)果表明，在土壤中存在大量沙門氏菌受體的情況下，無(wú)論土壤是否處于淹水狀態(tài)，沙門氏菌沒有從糞肥和土壤處獲得四環(huán)素抗性基因并在土壤中長(zhǎng)期存活。研究表明，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是 ARGs 含量的主要決定因素，而不是 HGT（Forsberg et al.，2014）。盡管土壤微生物攜帶多種ARGs，但僅有少數(shù)與人類病原體共有，而且這些基因在土壤群落內(nèi)以及從土壤向其他細(xì)菌的傳播并不常見（Sommer，2014）。ARGs 已被公認(rèn)為環(huán)境中的新型污染物，雖然HGT 是ARGs 傳播與擴(kuò)散的主要途徑，但其常受環(huán)境條件變化和共存物質(zhì)的影響（胡小婕等，2022）。據(jù)報(bào)道，ARGs 的轉(zhuǎn)移頻率可能受各種非抗生素條件的影響，例如環(huán)境溫度和pH、環(huán)境介質(zhì)的特征、額外的電場(chǎng)和聲場(chǎng)等（Shi et al.，2022）。因此，在自然條件下精確評(píng)估HGT 在環(huán)境ARGs 的擴(kuò)散中發(fā)揮的作用，對(duì)于我們科學(xué)評(píng)估環(huán)境中ARGs 的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要。

絕大多數(shù)沙門氏菌可以產(chǎn)生硫化氫（hydrogen sulfide，H2S），因此，H2S 是初篩與鑒定沙門菌的重要生化指標(biāo)。XLD 瓊脂培養(yǎng)基是常見的用來(lái)鑒別和篩選沙門氏菌的培養(yǎng)基，在堿性的條件下，培養(yǎng)基中的硫代硫酸鈉及檸檬酸鐵銨與沙門氏菌產(chǎn)生的H2S 反應(yīng)，使菌落的顏色呈黑色。我們從紅壤中分離到3 株具有四環(huán)素抗性且能夠產(chǎn)生H2S 的細(xì)菌，但是經(jīng)過生理生化和測(cè)序鑒定，最終確定為大腸桿菌，而不是獲得抗性的沙門氏菌。大腸桿菌是和臨床關(guān)系最為密切的細(xì)菌之一，與畜牧獸醫(yī)、公共衛(wèi)生有關(guān)，長(zhǎng)期以來(lái)一直作為糞源性細(xì)菌污染的衛(wèi)生指標(biāo)，是國(guó)際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)指示菌。大腸桿菌一般不產(chǎn)H2S，近年來(lái)也偶見產(chǎn)H2S 大腸桿菌的報(bào)道（張曉玲等，2021）。有研究表明，H2S 的產(chǎn)生在大腸桿菌中是由質(zhì)粒介導(dǎo)的（Bouanchaud et al.，1975），而且一些菌株可以通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移將此特性傳遞給不產(chǎn)H2S的大腸桿菌（Harnett et al.，1996）。H2S 是一種可自由穿梭細(xì)胞的小分子，擴(kuò)散性強(qiáng)。已有研究指出，H2S 不僅是細(xì)菌硫代謝的副產(chǎn)物，還在大腸桿菌、沙門菌耐藥過程中發(fā)揮重要作用，H2S 可利用其還原性清除抗生素氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)（ROS），發(fā)揮細(xì)菌耐藥作用（吳府麗，2017）。沙門菌中，phs操縱子編碼硫代硫酸鹽還原酶，由phsA、phsB和phsC等3 段基因組成，是沙門菌產(chǎn)生H2S 的重要功能基因（吳府麗，2017）。我們?cè)赥2 菌株的質(zhì)粒2 上也發(fā)現(xiàn)了phsA、phsB和phsC基因，且與 TCDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中Salmonellatyphimurium 攜帶的基因一致；此外，在添加沙門氏菌之前，土壤和豬糞中并未檢測(cè)到能夠產(chǎn)生H2S 的菌株。因此，我們推測(cè)可能是T2 從添加的沙門氏菌處獲得了這3 段基因，從而獲得了產(chǎn)生H2S 的能力；這可能暗示著在土壤環(huán)境中大腸桿菌能夠通過自然轉(zhuǎn)化（細(xì)菌從環(huán)境中直接攝取游離DNA 并獲得相應(yīng)的遺傳特征）或基因轉(zhuǎn)移獲得特定功能；也暗示著大腸桿菌從環(huán)境中獲得基因的潛力可能高于沙門氏菌。

土壤是“One Health”框架下一個(gè)極其重要的組成部分，通過與人類和/或動(dòng)物相關(guān)微生物的相互作用，ARGs 逐漸富集并可能最終流入人類食物鏈（Wang et al.，2022）。盡管我們?cè)? 種土壤中都未發(fā)現(xiàn)沙門氏菌從土壤或糞肥處獲四環(huán)素抗性功能，但是并不排除有其他類型ARGs 發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性。此外，未淹水土壤中沙門氏菌初始濃度約為108CFU·g-1干土，因?yàn)椴荒苓m應(yīng)土壤環(huán)境，其數(shù)量在施肥14 d 后逐漸減少，大多數(shù)在施入土壤后90 d 內(nèi)死亡（Peng et al.，2022b），因此本研究只關(guān)注了90 d 后仍然存活的沙門氏菌是否獲得了耐藥性，對(duì)于施肥后90 d 內(nèi)是否有沙門氏菌從土壤獲得ARGs 并未關(guān)注。Pornsukarom et al.（2017）從施用豬糞7—21 d 的土壤中分離到多株攜帶IncF1 質(zhì)粒的耐藥沙門氏菌，且它們攜帶的質(zhì)粒都可以通過培養(yǎng)體系下的接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)傳遞給E.coliJM109?？紤]到各種生物和非生物因素，腸道病原體在土壤中的存活率是高度可變的，為了避免糞肥中的病原微生物直接或通過食物鏈間接對(duì)人造成感染，應(yīng)該盡可能地延長(zhǎng)施肥和收獲間隔，讓帶入農(nóng)田的病原微生物數(shù)量得到充分削減。

3.2 在純培養(yǎng)體系下，從土壤中分離的T2 菌株未向病原菌E.coli O157:H7 轉(zhuǎn)移四環(huán)素抗性基因

水平基因轉(zhuǎn)移（HGT）在ARGs 的傳播中起著重要作用，其中接合轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是ARGs 在環(huán)境中傳播的主要方式之一。在本研究中，分離到的3 株四環(huán)素抗性菌均攜帶多種ARGs（表3），對(duì)其中攜帶ARGs 種類最多的T2 進(jìn)行全基因組測(cè)序，明確T2 攜帶了兩個(gè)質(zhì)粒并且質(zhì)粒上攜帶了多個(gè)四環(huán)素抗性基因（表5）。為了了解T2 菌株攜帶的四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)移潛力，在施加不同濃度四環(huán)素的條件下，將其與四環(huán)素敏感型E.coliO157:H7 菌株共培養(yǎng)，結(jié)果未觀察到T2 菌株的四環(huán)素抗性基因發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前，關(guān)于耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的研究多采用的是純培養(yǎng)的供體和/或受體細(xì)菌，研究的質(zhì)粒以RP4 質(zhì)粒（Jia et al.，2021；Zhang et al.，2022；Zhai et al.，2022；Liu et al.，2023）或pUC 質(zhì)粒（Fang et al.，2022；Wang et al.，2022）較為多見。不同的質(zhì)粒有不同的宿主范圍，這在一定程度上可能影響質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移效率，RP4 質(zhì)粒是一種典型的IncP-1α類質(zhì)粒，IncP-1 和IncQ-1 類型質(zhì)粒宿主范圍較寬，為泛宿主質(zhì)粒（broad-host-range plasmids），且常含有抗生素抗性特征，由于它們可以有效的接合轉(zhuǎn)移并在廣泛的宿主中穩(wěn)定復(fù)制，因此被認(rèn)為有助于水平基因轉(zhuǎn)移（Dungan et al.，2020）。所有革蘭氏陰性菌都是IncP 和IncW 質(zhì)粒的潛在宿主（Droge et al.，2000）。本研究分離的T2 攜帶的兩個(gè)質(zhì)粒經(jīng)過序列比對(duì)與數(shù)據(jù)庫(kù)中大腸桿菌攜帶的質(zhì)粒非常相似（表4），經(jīng)過PlasmidFinder 分型發(fā)現(xiàn)兩個(gè)質(zhì)粒分別屬于IncX1 和IncY 型，IncX 質(zhì)?？勺匪莸角翱股貢r(shí)代，是腸桿菌科的狹宿主質(zhì)粒（narrowhost-range plasmids），它們編碼IV 型菌毛，使其自身能夠接合轉(zhuǎn)移，并為宿主細(xì)菌提供輔助功能，如抗微生物藥物耐藥性和生物膜形成（Johnson et al.，2012）。IncY 質(zhì)粒也屬于狹宿主質(zhì)粒（Hawkey，2008），在腸桿菌科中比較常見，如大腸桿菌、沙門氏菌和肺炎克雷伯桿菌等（Zhang et al.，2017）。除了質(zhì)粒的宿主范圍之外，供體細(xì)菌攜帶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移潛力對(duì)接合轉(zhuǎn)移的發(fā)生頻率也很重要，結(jié)合質(zhì)粒（conjugative plasmid）可編碼結(jié)合系統(tǒng)控制基因，該基因可以促使細(xì)菌自發(fā)地進(jìn)行接合（Li et al.，2022），例如RP4 質(zhì)粒是一種IncP 類泛宿主質(zhì)粒，該IncP 質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移取決于trfA和trbB基因的產(chǎn)物（Qiu et al.，2012）。有研究報(bào)道，IncF、IncA/C、IncL/M、IncI1、IncHI2 和IncN 質(zhì)粒家族是與腸桿菌科耐藥性在全球范圍內(nèi)傳播特別相關(guān)的質(zhì)粒家族（Bustamante et al.，2017）。因此，需要進(jìn)一步研究不同類型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移潛力及其在環(huán)境ARGs 的傳播擴(kuò)散中發(fā)揮的作用。

此外，純培養(yǎng)體系下細(xì)菌質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的研究方法也有多種，例如Pornsukarom et al.（2017）在接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了42 ℃熱激處理；而其他一些研究則只是將受體和供體菌株在培養(yǎng)液中混合培養(yǎng)（Lin et al.，2016；Zhang et al.，2022；Alvarez-Molina et al.，2023）；為了避免細(xì)菌繁殖，在另外一些研究中用磷酸鹽緩沖液（Wang et al.，2019；Jia et al.，2021；Yan et al.，2023；Li et al.，2023）或生理鹽水（Chen et al.，2019；Zhai et al.，2022）替代培養(yǎng)液。接合實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件，包括初始細(xì)菌濃度，供體細(xì)菌與受體細(xì)菌的比率，養(yǎng)分供應(yīng)，實(shí)驗(yàn)體系的溫度和pH，接合時(shí)間的長(zhǎng)短等都可能對(duì)細(xì)菌質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移頻率產(chǎn)生影響。本研究將T2 和E.coliO157:H7 在磷酸鹽緩沖液中共培養(yǎng)，并在實(shí)驗(yàn)體系中加入不同濃度的四環(huán)素，但是均未分離到接合子。因此，需要進(jìn)一步優(yōu)化接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)條件，以進(jìn)一步分析T2 攜帶的兩個(gè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移潛力及其影響因素。此外，還需要建立合適的ARGs 水平轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)體系，模擬真實(shí)的環(huán)境條件，綜合利用多種技術(shù)對(duì)ARGs 的接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行跟蹤和檢測(cè)。

4 結(jié)論

1）向3 種土壤施入含有大量沙門氏菌的豬糞，無(wú)論土壤是否處于淹水狀態(tài)，沙門氏菌均未從糞肥和土壤處獲得四環(huán)素抗性基因并在土壤中長(zhǎng)期存活；說(shuō)明自然條件下，沙門氏菌通過HGT 從土壤環(huán)境獲得抗性基因并長(zhǎng)期存活的可能性很小。

2）從紅壤中分離到3 株具有四環(huán)素抗性且能夠產(chǎn)生H2S 的細(xì)菌，經(jīng)過生理生化和測(cè)序鑒定，最終確定為大腸桿菌；經(jīng)HT-qPCR 檢測(cè)，T1、T2 和T3 分別攜帶38、44 和43 種ARGs，7、11 和10 個(gè)MGEs。

3）對(duì)T2 進(jìn)行全基因組測(cè)序與分析，結(jié)果表明T2 攜帶了兩個(gè)長(zhǎng)度分別為40.48kb 的IncX1 型和93.31kb 的IncY 型質(zhì)粒，15 個(gè)基因島，前噬菌體和轉(zhuǎn)座子共197 個(gè)；經(jīng)ARDB 注釋獲得34 個(gè)ARGs，其中包括了2 種四環(huán)素抗性基因均位于IncY 型質(zhì)粒上。

4）將T2 菌體與四環(huán)素敏感型E.coliO157:H7菌株共培養(yǎng)，在施加不同濃度四環(huán)素的條件下，T2攜帶的四環(huán)素抗性基因沒有向E.coliO157:H7 菌株轉(zhuǎn)移。