賴見生,陳葉雨,顏 濤,林 玨,黃穎穎,趙鳳麒,陳永勝,周啟紅,劉曉歡,何 斌

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所,成都 611731;2.宜賓市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,四川 宜賓 644000;3.宜賓市翠屏區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,四川 宜賓 644000)

【研究意義】理縣高原鰍(Triplophysalixianensis)屬鯉形目(Cypriniformes)、鰍科(Cobitidae)、條鰍亞科(Nemachilinae)、高原鰍屬。高原鰍是一種重要的淡水魚類,大多棲息于青藏高原及附近的湖泊、河流和溪流中。高源鰍屬具有高度多樣性,由大約140種組成[1],該類群的起源和演化與青藏高原的隆升有關(guān)[2]。作為青藏高原魚類區(qū)系的重要組成部分,高原鰍對高原低氧、低壓和寒冷的環(huán)境有獨特的形態(tài)和生理適應(yīng)。高原鰍對當?shù)丨h(huán)境具有強烈適應(yīng)性,表明它們的長期進化與高原生境有關(guān)。因此,高原鰍是研究歷史氣候和地質(zhì)事件對該屬生物多樣性模式影響的理想物種。在中國的高原鰍種類中,目前在四川鑒定的有23種[3]。2008年何春林等[3]在四川省阿壩州雜谷瑙河流域采集到高原鰍標本,經(jīng)形態(tài)學鑒定為高原鰍新種,并命名為理縣高原鰍。目前,關(guān)于理縣高原鰍的報道較少,僅見于其作為新種的描述及線粒體DNA標記的開發(fā)[3-4]。有關(guān)長江流域理縣高原鰍種群結(jié)構(gòu)和種群歷史動態(tài)的信息仍然處于空白。因此,對理縣高原鰍不同地理種群的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進行評價,對進一步利用理縣高原鰍的遺傳種質(zhì)資源和野生群體保護具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】線粒體DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)具有進化速度快、缺少重組、分子小、易于測序及分析等特點,目前已成為魚類物種鑒定、進化遺傳學、分子生態(tài)學、群體遺傳結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)地理學等多種研究領(lǐng)域的重要標記[5-9]?？刂茀^(qū)(Control region,D-loop)作為線粒體DNA上最重要的一段非編碼區(qū),遺傳變異程度高,堿基替換率比線粒體DNA上的其他部分高5～10倍,是適合種群水平遺傳多樣性研究特別是遺傳多樣性較低的群體遺傳學研究的最優(yōu)標記之一[10]。研究表明,理縣高原鰍的分布非常局限,僅在長江上游岷江流域雜谷腦河發(fā)現(xiàn)[3-4]?！颈狙芯壳腥朦c】通過對大渡河流域魚類資源調(diào)查發(fā)現(xiàn),在大渡河4個不同地段,包括金川縣沙耳鄉(xiāng)、石棉縣安順彝族鄉(xiāng)、瀘定縣冷磧鎮(zhèn)和丹巴縣格宗鎮(zhèn)均發(fā)現(xiàn)有理縣高原鰍分布,這也是首次發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)于雜谷腦河以外的流域?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選取該4個不同地理種群的理縣高原鰍群體為研究對象,分析其體長與體重分布特征及其關(guān)系,并通過線粒體標記對其進行遺傳變異檢測,為揭示大渡河理縣高原鰍的遺傳背景及今后的種質(zhì)資源保護提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2021年在大渡河采集理縣高原鰍樣本,金川縣沙耳鄉(xiāng)采集30尾(31°30′50.3″ E, 102°38′5.4″ N,編號g1：1～30),大渡河石棉縣安順彝族鄉(xiāng)采集34尾(29°15′8.3″ E, 102°19′6.7″ N,編號g 2：31～64),大渡河瀘定縣冷磧鎮(zhèn)采集30尾(102°13′20.9″ E,29°46′57.3″ N,編號g 3：65～94),丹巴縣格宗鎮(zhèn)采集23尾(30°48′26.6″ E, 101°56′25.2″ N,編號g 4：95～117),共117尾,剪取鰭條保存在100%酒精管,并存于4 ℃冰箱直至提取組織基因組。采樣點分布如圖1所示,水系圖來源于四川測繪地理信息局(http：//scsm.mnr.gov.cn/index.htm)。丹巴縣格宗鎮(zhèn)23尾理縣高原鰍年齡段為3～9齡,大渡河石棉縣34尾年齡段為6～11齡,瀘定縣冷磧鎮(zhèn)30尾年齡段為6～11齡,金川縣沙耳鄉(xiāng)30尾年齡段為6～11齡,4個種群理縣高原鰍年齡段均集中在6～7齡。大渡河石棉縣34尾,包括14尾雌魚和20尾雄魚,瀘定縣冷磧鎮(zhèn)30尾,包括13尾雌魚和17尾雄魚,金川縣沙耳鄉(xiāng)30尾,包括13尾雌魚和17尾雄魚,丹巴縣格宗鎮(zhèn)23尾魚,包含7尾雌魚和10尾雄魚(其中6尾幼齡魚無法鑒定性別)。雌雄魚性腺發(fā)育期集中在III～IV期。

1.2 理縣高原鰍體長-體重的相關(guān)性及肥滿度分析

理縣高原鰍的體長-體重關(guān)系用冪函數(shù)公式擬合[11]：

W=aLb

圖1 理縣高原鰍調(diào)查采樣站位Fig.1 Sampling stations of T. lixianensis

式中,W為體重(g);L為體長(cm);a為條件因子,b為異速生長因子[12]。測量理縣高原鰍全長時,取吻端到尾鰭末端的最大長度;體長即標準長,為吻端到尾鰭基的直線長度,即全長減去尾鰭的長度。將體重和體長數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)化,利用SPSS 19.0軟件,使用線性回歸法進行擬合,估計參數(shù)a和b的95%置信區(qū)間(CI)及R2的顯著性水平。

肥滿度采用Fulton狀態(tài)指數(shù)K計算：

K=(W/L3)×100

式中,W為體重(g);L為體長(cm)。數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示。

1.3 理縣高原鰍基因組 DNA制備

理縣高原鰍基因組DNA提取采用CTAB高鹽法,取1 μL樣品通過電泳檢測DNA質(zhì)量,并用超微量分光光度計(Implen N50 touch)檢測DNA的純度和含量,保存于-20 ℃冰箱備用。

1.4 理縣高原鰍線粒體D-loop序列引物設(shè)計、合成

根據(jù)理縣高原鰍線粒體序列信息(GenBank accession number： KT966735.1),在其D-loop區(qū)上下設(shè)計特異性引物,基因引物序列F：5’-CTCACCCCTGGCTCCCAAAGC-3’,R：5’-AGGGCCCGTCTTAGCATCTTC-3’。

1.5 理縣高原鰍線粒體DNA PCR擴增體系及程序

理縣高原鰍線粒體DNA擴增體系為1 μL基因組DNA(50 ng),2×Premix LATaq聚合酶25 μL,正反向引物各1.5 μL(10 μmol/L),PCR級水21 μL,總擴增體系50 μL。PCR反應(yīng)程序包括：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,32個循環(huán);72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,將片段大小一致且條帶單一的擴增產(chǎn)物進行測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

測序結(jié)果通過BLAST程序與GenBank中理縣高原鰍線粒體DNA序列進行比對分析,確認擴增產(chǎn)物為理縣高原鰍線粒體DNA D-loop區(qū)序列。多樣性相關(guān)參數(shù),包括核苷酸多樣度(Pi)、單倍型多樣度(Hd)、多態(tài)位點數(shù)(S)、單倍型數(shù)(H)和平均核苷酸變異數(shù)(K)等,用DNAsp 5軟件進行計算。群體遺傳分化指數(shù)Fst值利用Arlequin 2.0軟件統(tǒng)計。系統(tǒng)發(fā)育樹利用MEGA 6軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining)進行構(gòu)建。使用Arlequin 2.0軟件計算錯配分布(Mismatch distribution)、Tajima’sD和Fu’sFs值來檢驗群體歷史上是否經(jīng)歷擴張, 通過偏差平方和(Sum of squared deviation, SSD)檢測核苷酸不配對分布與種群擴張模型下期望分布之間的擬合優(yōu)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 理縣高原鰍的體重-體長關(guān)系

從圖2可知,大渡河理縣高原鰍全長7.5～18.5 cm,體長6.3～15.4 cm,平均體長11.5 cm,體重2.8～44.9 g,平均體重19.6 g。a值為0.0123,95%置信區(qū)間為0.0081～0.0187,b值為2.9734,95%置信區(qū)間為2.8030～3.1440,R2>0.9121(表1)。本研究采用Fulton狀態(tài)指數(shù)K表示大渡河理縣高原鰍的肥滿度,理縣高原鰍的肥滿度為1.18±0.02(平均數(shù)±標準差)。

2.2 理縣高原鰍線粒體DNA控制區(qū)堿基特征

117尾理縣高原鰍線粒體DNA控制區(qū)序列PCR產(chǎn)物特異性較好。對117尾理縣高原鰍個體的測序結(jié)果比對分析發(fā)現(xiàn),去掉引物及部分端部序列,同源重排后的長度為878 bp。序列中T、C、A、G堿基所占比例分別為32.5%、21.4%、32.9%、13.2%,AT和CG所占比例為65.4%和34.6%,可見AT比例顯著高于CG比例(表2),說明理縣高原鰍線粒體DNA組成符合硬骨魚線粒體DNA堿基組成的特征。

2.3 理縣高原鰍不同地理種群的遺傳結(jié)構(gòu)

金川縣、石棉縣、瀘定縣和丹巴縣4個理縣高原鰍種群D-loop區(qū)共存在32個變異位點和28個單倍型(表3)。4個理縣高原鰍群體的單倍型多樣度(Hd)在0.637～0.921,丹巴縣格宗鎮(zhèn)樣本單倍型多樣度最高。理縣高原鰍群體的核苷酸多樣性在0.000 91～0.005 70,大渡河瀘定縣冷磧鎮(zhèn)樣本核苷酸多樣性最低(表3)。金川縣沙耳鄉(xiāng)樣本理縣高原鰍有11個單倍型,大渡河石棉縣安順彝族鄉(xiāng)樣本有7個單倍型,大渡河瀘定縣冷磧鎮(zhèn)樣本有7個單倍型,丹巴縣格宗鎮(zhèn)理縣高原鰍樣本有11個單倍型。單倍型Hap1出現(xiàn)的頻率最高,但4個理縣高原鰍地理種群未有共享的單倍型。金川縣和丹巴縣2個理縣高原鰍群體之間的個體存在共享的單倍型,石棉縣和瀘定縣2個種群之間也存在共享單倍型,但金川縣和石棉縣或瀘定縣群體之間的個體未出現(xiàn)共享單倍型,丹巴縣和石棉縣或瀘定縣理縣高原鰍群體之間的個體也未出現(xiàn)共享單倍型(表4)。

圖2 理縣高原鰍體長和體重的回歸曲線Fig.2 Regression curves of relationship between body weight and body length of T. lixianensis

從表5可知,金川縣沙耳鄉(xiāng)和石棉及大渡河瀘定縣冷磧鎮(zhèn)的理縣高原鰍樣本遺傳距離分別為0.251 73和0.275 55,說明發(fā)生了中度遺傳分化,與丹巴縣格宗鎮(zhèn)樣本之間的遺傳距離為-0.001 39,表明未出現(xiàn)遺傳分化。石棉和大渡河瀘定縣及丹巴縣格宗鎮(zhèn)理縣高原鰍樣本之間的遺傳距離為0.025 99和0.231 92,大渡河瀘定縣和丹巴縣格宗鎮(zhèn)樣本之間的遺傳距離為0.257 09,說明發(fā)生了遺傳分化。

表1 理縣高原鰍體重和體長關(guān)系函數(shù)的a和b參數(shù)

表2 不同地理種群理縣高原鰍mtDNA控制區(qū)序列堿基組成

2.4 理縣高原鰍不同地理種群的系統(tǒng)進化樹

利用MEGA建立理縣高原鰍4個地理種群個體的NJ分子系統(tǒng)樹(圖3),從系統(tǒng)樹可以看出,117個理縣高原鰍個體在進化樹上形成2個獨立的分支。其中,金川縣沙耳鄉(xiāng)和丹巴縣格宗鎮(zhèn)的個體形成一個獨立分支,而大渡河石棉縣安順彝族鄉(xiāng)和瀘定縣冷磧鎮(zhèn)的個體形成另一個分支,與各地理種群的遺傳距離結(jié)果一致。

表3 理縣高原鰍不同地理種群的遺傳多樣性參數(shù)

表4 理縣高原鰍不同種群的28個單倍型分布

表5 理縣高原鰍4個地理種群的遺傳分化Fst值

金川縣：1～30;石棉縣：31～64;瀘定縣：65～94;丹巴縣：95～117。Jinchuan county： 1-30; Shimian county： 31-64; Luding county： 65-94; Danba county： 95-117.圖3 基于線粒體D-loop區(qū)序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)樹Fig.3 NJ tree based on D-loop region of mitochondrial DNA

2.5 理縣高原鰍種群歷史動態(tài)分析

中性檢驗結(jié)果顯示, 金川縣和丹巴縣理縣高原鰍地理群體的Tajima’sD值大于0,而石棉縣和瀘定縣地理群體的Tajima’sD值小于0,且均未達到顯著水平(P>0.05)。Fu’sFs檢驗結(jié)果顯示, 4個理縣高原鰍地理群體的Fu’sFs均小于0,其中,石棉縣和瀘定縣群體均呈顯著負值(P<0.05), 金川縣和丹巴縣群體均呈不顯著負值(P>0.05,表6)。

表6 理縣高原鰍4個地理種群的中性檢驗

柱狀圖代表出現(xiàn)頻率的觀測值,曲線代表基于種群擴張事件模型的期望頻率。A：金川縣,B：石棉縣,C：瀘定縣,D：丹巴縣。The histograms indicate the observed frequencies, and the lines represent the expected frequencies based on the model of sudden population expansion. A： Jinchuan county, B： Shimian county, C： Luding county, D： Danba county.圖4 理縣高原鰍4個地理種群的單倍型錯配分布 Fig.4 Mismatch distribution of haplotypes in four populations of T. lixianensis

對單倍型錯配分布分析發(fā)現(xiàn),金川縣和丹巴縣理縣高原鰍地理群體的單倍型錯配分布呈多峰分布(圖4),同時,錯配分析SSD不顯著;而石棉縣和瀘定縣理縣高原鰍地理群體的單倍型錯配分布呈單峰分布且SSD不顯著,表明2個種群可能經(jīng)歷過群體擴張(圖4-B、4-C)。

3 討 論

本研究中,理縣高原鰍的生長參數(shù)b值為2.9734,當b值小于3時,種群為負異速生長, 即體長的增速大于體重的增速,當b值等于3 時,種群為等速生長,當b值大于3 時,種群為正異速生長,體型表現(xiàn)為肥滿而不是纖細[13]。本研究表明,大渡河理縣高原鰍的b值保持在2.5～3.5的預(yù)期范圍內(nèi),接近3,說明采樣時間段(10—12月)理縣高原鰍生長狀況良好。由于缺乏理縣高原鰍體重體長關(guān)系的文獻報道,因此本研究結(jié)果無法進行比較。但研究顯示,阿克蘇河小鰾高原鰍b值為2.876[14],塔里木河巨頭高原鰍b值為2.583[14],伊犁河斯氏高原鰍b值為1.22[15],伊犁河黑斑高原鰍b值為1.113[15],烏倫古河小體高原鰍b值為 2.52[16],湟水河似鲇高原鰍b值為2.67[17]。大多數(shù)高原鰍屬魚類b值小于3,處于負異速生長,而大渡河理縣高原鰍b值高于其同屬的其他高原鰍。b值的差異可以歸因于多種因素,如檢測的標本數(shù)量、捕獲個體的長度范圍、棲息地類型、季節(jié)性和地理區(qū)域[16,18-20]。生長環(huán)境是顯著影響b值的因素之一[21]。Jisr等[22]發(fā)現(xiàn),棕線石斑魚等的生長參數(shù)b值在高溫環(huán)境下明顯高于低溫環(huán)境。Sileesh等[23]對黑頭魚、深海鯡,蛇鯖等研究也表明b值水平顯著受環(huán)境因素影響。

本研究采用線粒體基因組中進化速率最快的控制區(qū)序列分析方法,研究理縣高原鰍在大渡河的4個不同地理種群共117個個體的堿基組成和變異情況,獲得理縣高原鰍野生群體的種質(zhì)資源遺傳變異基本數(shù)據(jù)。117個理縣高原鰍個體的mt DNA 控制區(qū)序列中,4種堿基組成呈現(xiàn)出一定的偏向性,各群體均存在A+T所占比例高于C+G的現(xiàn)象,這與絕大多數(shù)魚類的線粒體控制區(qū)組成特征相符[24]。

核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)和單倍型多樣性指數(shù)(Hd)是線粒體DNA用來評估群體遺傳多樣性的2個重要參數(shù)。通過對理縣高原鰍D-loop區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn),其總體的Hd在0.8以上,處于較高水平,而Pi偏低,僅為0.000 91～0.005 70。說明,目前理縣高原鰍野生群體存在單倍型多樣性較高而核苷酸多樣性較低的情況,推測理縣高原鰍種群可能正從一個更小的有效種群經(jīng)歷種群擴張,它們在較短的時間內(nèi),通過堿基突變積累其單倍型多態(tài)性,但不足以使核苷酸多態(tài)性也處于較高狀態(tài)。由于核苷酸多樣性指數(shù)考慮各單倍型在群體中所占的比例,因而較單倍型多樣性指數(shù)更可靠[25]。類似結(jié)果在同屬的其余高原鰍種群中也有發(fā)現(xiàn)。晁燕等[26]利用線粒體DNA cytb序列對大通河區(qū)域的似鲇高原鰍進行遺傳多樣性研究,結(jié)果顯示似鲇高原鰍大通河種群的Hd為0.86,Pi為0.0036。顏淵等[27]利用D-loop區(qū)對西部黃河流域不同水域的黃河高原鰍種群研究發(fā)現(xiàn),其Hd在0.9420～1.0000,Pi為0.0030～0.0043;楊成等[28]對擬硬刺高原鰍黃河種群和寶庫河種群進行研究,發(fā)現(xiàn)其Hd為0.65～0.89,Pi為0.0010～0.0025;姚雁鴻等[29]利用線粒體D-loop序列對湖南烏龍山湘西盲高原鰍線粒進行分析,發(fā)現(xiàn)其Hd在0.083～0.282,其Pi范圍為0.000 09～0.000 32?？梢?以核苷酸多樣性指數(shù)判斷,目前理縣高原鰍屬的物種大部分都處于遺傳多樣性較低的狀態(tài),需要進行有效的遺傳管理來增加其種群的遺傳多樣性。而從不同地理種群多樣性差異分析,金川縣和丹巴縣理縣高原鰍種群核苷酸多樣度遠遠高于石棉縣和瀘定縣種群。金川縣和丹巴縣屬于藏區(qū),人類活動較少,無人為干擾的生境保留了其遺傳信息。前期實地調(diào)查也發(fā)現(xiàn),石棉縣和瀘定縣人為捕撈等活動更頻繁,導致該地段魚類種群的多樣性偏低。

通過構(gòu)建進化樹可以發(fā)現(xiàn),4個理縣高原鰍地理種群的個體在NJ系統(tǒng)樹上形成2大分支,推測這117個個體的單倍型可能來源于2個不同遺傳背景的祖先。其中,金川縣沙耳鄉(xiāng)和丹巴縣格宗鎮(zhèn)的理縣高原鰍個體形成一個獨立分支,而大渡河石棉縣安順彝族鄉(xiāng)和瀘定縣冷磧鎮(zhèn)的個體形成另一個分支,說明金川縣、丹巴縣群體和石棉縣、瀘定縣群體形成明顯的分化。單倍型分布、遺傳分化和聚類分析結(jié)果均顯示大渡河金川縣和丹巴縣2個理縣高原鰍種群之間存在廣泛的基因交流,石棉縣和瀘定縣之間的種群也存在基因交流。金川縣和石棉縣或瀘定縣之間,丹巴縣和石棉縣或瀘定縣之間的理縣高原鰍種群均未發(fā)生基因交流,群體間存在顯著的遺傳分化,基于控制區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示了兩兩種群之間形成獨立分支,也支持上述結(jié)論。4個理縣高原鰍群體的中性檢驗結(jié)果表明,金川縣和丹巴縣的Tajima’sD值大于0,Fu’sFs小于0,但均未達到顯著水平,說明未檢測到群體擴張跡象,可能未發(fā)生群體擴張事件。而石棉縣和瀘定縣理縣高原鰍地理群體的Tajima’sD和Fu’sFs均小于0,且后者呈現(xiàn)顯著負值,表明這2個群體可能經(jīng)歷過群體快速擴張事件。石棉縣和瀘定縣理縣高原鰍地理群體的歧點分布呈單峰分布, 且SSD也不顯著,進一步說明該2個群體動態(tài)未顯著偏離原假設(shè)(種群擴張模型),近期都經(jīng)歷了快速的群體擴張。

目前,大渡河丹巴縣和瀘定縣之間暫無已建電站,無人為因素阻礙該2個區(qū)域理縣高原鰍的基因交流;而丹巴縣和金川縣及石棉縣之間存在數(shù)個已建和在建電站,包括猴子巖水電站、長河壩水電站、黃金坪水電站、瀘定水電站等,可能在一定程度上阻礙了壩上壩下魚類的基因交流。對于物種遺傳多樣性和物種完整性的保護在于客觀鑒別物種的關(guān)鍵遺傳單元,然后采用合適的方式管理這些單元[30]。

4 結(jié) 論

目前大渡河流域石棉至金川段理縣高原鰍生長狀態(tài)良好。線粒體分子標記分析發(fā)現(xiàn),大渡河理縣高原鰍種群遺傳多樣性處于較低水平,并建議將大渡河金川縣和丹巴縣種群作為一個整體進行管理和保護,石棉縣和瀘定縣也作為一個整體進行管理和保護,而金川縣和丹巴縣、石棉縣和瀘定縣的種群分開管理和保護。