蘇雪梅 鐘平玉 孫銀平

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院消化內(nèi)科,福建 龍巖 364000)

結(jié)直腸癌(CRC)是最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型之一,高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率是晚期CRC患者的主要死亡原因〔1〕。盡管近年來(lái)對(duì)于CRC的治療方法有所改進(jìn),但約有50%CRC患者在治療后仍會(huì)出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā),這導(dǎo)致總體生存率較差〔2〕。因此,闡明CRC增殖和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制對(duì)于改善CRC患者的治療和預(yù)后具有重要意義。MicroRNA(miRNA)是包含22個(gè)核苷酸的非編碼RNA,其已被證明與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔3〕。miR-520f-3p被認(rèn)為可以抑制肺癌〔4〕、肝癌〔5〕等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。而miR-520f-3p對(duì)CRC的影響尚不清楚。層黏連蛋白(LAMA)3是一種在各種腫瘤中被廣泛研究的基因,研究顯示,LAMA3在胰腺癌組織中高表達(dá),且可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移〔6〕。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-520f-3p與LAMA3存在結(jié)合位點(diǎn),而miR-520f-3p能否靶向LAMA3調(diào)控CRC細(xì)胞增殖、遷移尚不明確。關(guān)于LAMA3在CRC中具有何種效應(yīng)鮮有報(bào)道。因此,本研究主要探究miR-520f-3p對(duì)CRC細(xì)胞增殖、遷移的影響及其作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1臨床標(biāo)本收集 收集2018年2月至2021年12月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院首次確診為CRC的41例患者的癌組織及距離癌組織3 cm處癌旁組織。所有患者未接受任何形式的治療,并簽署了知情同意書(shū)。該研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞 正常結(jié)直腸細(xì)胞FHC及CRC細(xì)胞SW480、LOVO、HCT116、HT29均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3動(dòng)物 35只SPF級(jí)BALB/c雄性裸鼠購(gòu)自長(zhǎng)春卓誼生物股份有限公司,4～6周齡,體質(zhì)量15 g左右,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(吉)2019-0004,動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(吉)2020-0005,大鼠飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院動(dòng)物房,所有大鼠飼養(yǎng)于正常12 h明暗交替環(huán)境中1 w,期間可自由飲水采食,實(shí)驗(yàn)前禁食12 h,本研究得到醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理批號(hào):20211023),所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循3R原則。

1.4主要試劑與儀器 miR-520f-3p模擬物(miR-520f-3p mimics)及其陰性對(duì)照(mimics NC)、miR-520f-3p抑制物(miR-520f-3p inhibitor)及其陰性對(duì)照(inhibitor NC)、LAMA3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-LAMA3)及其陰性對(duì)照(pcDNA)均購(gòu)自廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基(批號(hào):20200806)購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(批號(hào):20200817)購(gòu)自北京宜科思源科技有限公司;miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(批號(hào):20200909)購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司;miRcute miRNA q聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20201106)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;兔源一抗LAMA3(批號(hào):20201213)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA,批號(hào):20201125)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1(批號(hào):20200918)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2(批號(hào):20200913)、GAPDH(批號(hào):20201011)及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(批號(hào):20201018)均購(gòu)自Abcam公司;CCK-8試劑盒(批號(hào):20201114)購(gòu)自北京康瑞納生物科技有限公司;ABI7500 熒光定量PCR儀(批號(hào):4351105)購(gòu)自廣州柏賽柯生物公司;Lonza酶標(biāo)儀(批號(hào):25-315S)購(gòu)自北京澤平科技公司。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將FHC、SW480、LOVO、HCT116、HT29細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LOVO細(xì)胞,利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染,并分為對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染的LOVO細(xì)胞)、inhibitor NC組(轉(zhuǎn)染inhibitor NC)、miR-520f-3p inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-520f-3p inhibitor)、mimics NC組(轉(zhuǎn)染mimics NC)、miR-520f-3p mimics組(轉(zhuǎn)染miR-520f-3p mimics)、miR-520f-3p mimics+pcDNA組(miR-520f-3p mimics和pcDNA共轉(zhuǎn)染)、miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3組(miR-520f-3p mimics和pcDNA-LAMA3共轉(zhuǎn)染)。轉(zhuǎn)染48 h后,利用實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-PCR、Western印跡分別檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-520f-3p、LAMA3蛋白表達(dá)。

1.6qRT-PCR檢測(cè)組織和細(xì)胞中miR-520f-3p表達(dá) 利用TRIzol試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA,使用miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過(guò)miRcute miRNA qPCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR,以U6為內(nèi)參,按照2-ΔΔCt法計(jì)算miR-520f-3p表達(dá)。引物序列:U6正向:5'-GACCGAGTGTAGCAAGG-3',反向:5'-GTTCTTCCGAGAACATATAC-3';miR-520f-3p正向:5'-GTGCCTGTTGCGTCTC-3',反向:5'-GAAAGCCTAGCCGTATTCG-3'。

1.7CKK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種在96孔板中,然后在37 ℃、5%CO2下孵育。分別在細(xì)胞孵育的0、24、48 h時(shí),向每孔中加入10 μl CCK-8溶液。孵育1 h后,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的光密度(OD)值以評(píng)估細(xì)胞增殖能力。

1.8劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將各組細(xì)胞接種至12孔板中,細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合到85%左右時(shí),利用200 μl移液器槍頭垂直12孔板底部進(jìn)行劃痕。經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后,將細(xì)胞在不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過(guò)顯微鏡觀(guān)察并拍照0、48 h的劃痕。劃痕愈合率(%)=(1-48 h劃痕距離/0 h劃痕距離)×100%。

1.9Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中LAMA3、PCNA、CyclinD1、MMP-2蛋白表達(dá) 用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度,將等量的蛋白質(zhì)經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,將膜與一抗LAMA3(1∶2 000)、PCNA(1∶1 000)、CyclinD1(1∶2 000)、MMP-2(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)在4 ℃的搖床上孵育過(guò)夜。然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗在37 ℃下孵育2 h,加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)觀(guān)察蛋白顯色情況,通過(guò)ImageJ軟件評(píng)估蛋白的灰度值。

1.10雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 分別構(gòu)建LAMA3野生型質(zhì)粒(WT-LAMA3)及突變型質(zhì)粒(MUT-LAMA3),利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將WT-LAMA3和MUT-LAMA3分別與mimics NC或miR-520f-3p mimics共轉(zhuǎn)染于LOVO細(xì)胞,48 h后,檢測(cè)熒光素酶活性。

1.11裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 將1.5中的各組細(xì)胞(1×106個(gè))分別注射到裸鼠左側(cè)腋窩皮下,分別為對(duì)照組、inhibitor NC組、miR-520f-3p inhibitor組、mimics NC組、miR-520f-3p mimics組、miR-520f-3p mimics組、miR-520f-3p mimics+pcDNA組、miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3組,每組5只,注射3 w后,處死裸鼠并收集腫瘤,稱(chēng)量并記錄腫瘤質(zhì)量。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-520f-3p、LAMA3蛋白在CRC組織中的表達(dá) 與癌旁組織比較,CRC組織中miR-520f-3p水平顯著降低,LAMA3蛋白水平顯著升高(P<0.05),見(jiàn)圖1和表1。

圖1 Western印跡檢測(cè)組織中LAMA3蛋白表達(dá)

表1 miR-520f-3p在CRC和癌旁組織中表達(dá)

2.2miR-520f-3p在不同細(xì)胞系中的表達(dá) 與正常結(jié)直腸細(xì)胞FHC(1.00±0.00)比較,CRC細(xì)胞SW480、LOVO、HCT116、HT29中miR-520f-3p表達(dá)水平(0.28±0.02、0.22±0.01、0.44±0.02、0.56±0.04)顯著降低(均P<0.05),且miR-520f-3p在LOVO細(xì)胞中的表達(dá)最低,因此,后續(xù)以L(fǎng)OVO細(xì)胞為研究對(duì)象。

2.3各組LOVO細(xì)胞中miR-520f-3p表達(dá)比較 與對(duì)照組(1.00±0.00)、inhibitor NC組(1.02±0.11)比較,miR-520f-3p inhibitor組miR-520f-3p表達(dá)水平(0.22±0.01)顯著降低(均P<0.05);與對(duì)照組、mimics NC組(1.03±0.12)比較,miR-520f-3p mimics組miR-520f-3p表達(dá)水平(2.69±0.21)顯著升高(P<0.05);與miR-520f-3p mimics組、miR-520f-3pmimics+pcDNA組(2.71±0.23)比較,miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3組miR-520f-3p表達(dá)水平(2.72±0.22)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4各組LOVO細(xì)胞增殖能力比較 與對(duì)照組、inhibitor NC組比較,miR-520f-3p inhibitor組細(xì)胞在24、48 h的OD450值顯著升高(P<0.05);與對(duì)照組、mimics NC組比較,miR-520f-3p mimics組細(xì)胞在24、48 h的OD450值顯著降低(P<0.05);與miR-520f-3p mimics組、miR-520f-3p mimics+pcDNA組比較,miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3組細(xì)胞在24、48 h的OD450值顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表2。

2.5各組細(xì)胞遷移能力比較 與對(duì)照組、inhibitor NC組比較,miR-520f-3p inhibitor組細(xì)胞劃痕愈合率顯著升高(P<0.05);與對(duì)照組、mimics NC組比較,miR-520f-3p mimics組細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.05);與miR-520f-3p mimics組、miR-520f-3p mimics+pcDNA組比較,miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3組細(xì)胞劃痕愈合率顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表3、圖2。

表2 各組細(xì)胞增殖能力比較

1)與對(duì)照組比較;2)與inhibitor NC組比較;3)與mimics NC組比較;4)與miR-520f-3p mimics組比較,5)與miR-520f-3p mimics+pcDNA組比較:均P<0.05,下表同

表3 各組細(xì)胞劃痕愈合率及LAMA3、PCNA、CyclinD1、MMP-2蛋白表達(dá)比較

2.6各組細(xì)胞中LAMA3、增殖、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組、inhibitor NC組比較,miR-520f-3p inhibitor組LAMA3、PCNA、CyclinD1、MMP-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與對(duì)照組、mimics NC組比較,miR-520f-3p mimics組細(xì)胞中LAMA3、PCNA、CyclinD1、MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與miR-520f-3p mimics組、miR-520f-3p mimics+pcDNA組比較,miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3組細(xì)胞中LAMA3、PCNA、CyclinD1、MMP-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表3、圖3。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移(×40)

2.7miR-520f-3p靶向調(diào)控LAMA3 通過(guò)Targetscan預(yù)測(cè)miR-520f-3p與LAMA3的結(jié)合位點(diǎn),見(jiàn)圖4。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示,與mimics NC和WT-LAMA3共轉(zhuǎn)染組比較,miR-520f-3p mimics和WT-LAMA3共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低(P<0.05);與mimics NC和MUT-LAMA3共轉(zhuǎn)染組比較,miR-520f-3p mimics和MUT-LAMA3共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表4。

1～7:對(duì)照組,inhibitor NC 組,miR-520f-3p inhibitor組,mimics NC組,miR-520f-3p mimics組,miR-520f-3p mimics+pcDNA組,miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3組;圖5同圖3 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中LAMA3、PCNA、CyclinD1、MMP-2蛋白表達(dá)

圖4 Targetscan預(yù)測(cè)miR-520f-3p與LAMA3的結(jié)合位點(diǎn)

表4 熒光素酶活性比較

2.8各組裸鼠體內(nèi)移植瘤比較 與對(duì)照組〔(0.79±0.06)g〕、inhibitor NC組〔(0.80±0.07)g〕比較,miR-520f-3p inhibitor組腫瘤質(zhì)量〔(1.06±0.11)g〕顯著升高(P<0.05);與對(duì)照組、mimics NC組〔(0.81±0.07)g〕比較,miR-520f-3p mimics組腫瘤質(zhì)量〔(0.34±0.02)g〕顯著降低(P<0.05);與miR-520f-3p mimics組、miR-520f-3p mimics+pcDNA組〔(0.36±0.03)g〕比較,miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3組腫瘤質(zhì)量〔(0.63±0.05)g〕顯著升高(P<0.05),見(jiàn)圖5。

圖5 各組裸鼠體內(nèi)移植瘤比較

3 討 論

CRC是全球第三大最常見(jiàn)癌癥,2018年報(bào)告的新病例超過(guò)184萬(wàn),僅次于肺癌和乳腺癌〔7,8〕。據(jù)統(tǒng)計(jì),CRC患者的高死亡率和不良預(yù)后主要與腫瘤細(xì)胞的高轉(zhuǎn)移率有關(guān),轉(zhuǎn)移患者的生存率低于10%〔9〕。因此,探究CRC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)于提高CRC患者的生存率具有重要意義。

miRNA失調(diào)導(dǎo)致靶基因異常表達(dá),并與癌癥發(fā)展有關(guān)〔10〕。miR-520f-3p的失調(diào)已在多種腫瘤中被報(bào)道。如miR-520f-3p在膽管癌細(xì)胞中低表達(dá),敲低miR-520f-3p可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔11〕;過(guò)表達(dá)miR-520f-3p可抑制胃癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔12〕;下調(diào)miR-520f-3p促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔13〕。本研究結(jié)果與其一致。PCNA、CyclinD1是與細(xì)胞增殖相關(guān)的因子〔14〕,而MMP-2是常被用于衡量細(xì)胞遷移能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)〔15〕。本研究結(jié)果提示,在體外水平上過(guò)表達(dá)miR-520f-3p可顯著抑制LOVO細(xì)胞增殖、遷移,而少量的miR-520f-3p(即沉默miR-520f-3p)則不能起到抑制LOVO細(xì)胞增殖、遷移的作用,因此表現(xiàn)出促進(jìn)LOVO細(xì)胞增殖、遷移的作用;表明過(guò)表達(dá)miR-520f-3p可抑制CRC細(xì)胞增殖、遷移及體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)LAMA3為miR-520f-3p的靶基因。LAMA3是細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白家族中的成員,也是基底膜中的主要非膠原成分,其與細(xì)胞黏附、分化、遷移、信號(hào)傳導(dǎo)等多種生物過(guò)程有關(guān)〔16〕。據(jù)報(bào)道,LAMA3在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào),其表達(dá)情況與患者的腫瘤大小、TNM分期顯著相關(guān)〔17〕;LAMA3在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織〔18〕;LAMA3在喉鱗狀細(xì)胞癌中具有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用〔19〕。通過(guò)本研究結(jié)果推測(cè)過(guò)表達(dá)miR-520f-3p可能通過(guò)下調(diào)LAMA3抑制CRC細(xì)胞增殖、遷移及體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。本研究結(jié)果提示,上調(diào)LAMA3可減弱過(guò)表達(dá)miR-520f-3p對(duì)CRC細(xì)胞增殖、遷移抑制,也逆轉(zhuǎn)了對(duì)裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制,表明過(guò)表達(dá)miR-520f-3p通過(guò)下調(diào)LAMA3抑制CRC細(xì)胞增殖、遷移。本研究為CRC進(jìn)展新分子機(jī)制的研究提供參考,這可能為阻止CRC轉(zhuǎn)移提供一種新的治療策略。