曾敏靜，馬瑋瑋，唐浴塵，高婷娟

（華中師范大學 化學學院 綠色農藥全國重點實驗室 農藥與化學生物學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430079）

光學顯微成像可以清晰地觀察細胞的形態(tài)和大小，實現細胞的可視化。為進一步理解細胞的生理活動調控機制，全面了解各組分的動態(tài)變化十分必要［1］。細胞器和生物分子是細胞的重要組成部分，通過生物傳感技術監(jiān)測它們的生理活動對于研究其生命功能具有重要意義［2］。熒光法是細胞成像中應用最成熟的技術，具有較高的時間和空間分辨率［3］，但熒光光譜譜帶較寬，易發(fā)生光譜重疊或光漂白現象，對于實現3~5個通道以上的多色細胞成像面臨較大挑戰(zhàn)［4］。

拉曼是一種非彈性散射光譜技術，在較寬的譜帶范圍（~200-4 000 cm-1）內呈現較為特征的指紋信號峰（~10 cm-1），相比于熒光光譜具有更多的成像通路，可對細胞內多種細胞器進行多色成像［5-6］。與熒光光譜相比，拉曼光譜無需標記或染色，可以直接檢測胞內蛋白質、脂質和DNA 的指紋信息，通過分析就能觀測它們的分布［7］。然而，自發(fā)拉曼光譜信號弱、需要延長采集時間或增強激光功率以獲得特征圖譜，此時細胞存在光毒性風險。為了克服這些問題，表面增強拉曼光譜（SERS）、相干拉曼光譜（CRS）和共振拉曼光譜（RRS）常用于增強拉曼信號。上述技術在細胞成像和生物傳感領域已展開深入研究［8］。

基于Web of science 數據庫的文獻統(tǒng)計分析，近年來，拉曼光譜在細胞成像領域的研究熱度不斷上升（表1）。本文將細胞拉曼成像分為無標記和標記兩個類別進行系統(tǒng)介紹，綜述了SERS、CRS、RRS等拉曼增強技術在細胞成像方面的應用，最后對目前細胞拉曼成像面臨的問題和未來的發(fā)展趨勢進行了總結和展望。

1 拉曼增強

1.1 表面增強拉曼光譜

1.1.1 傳統(tǒng)納米粒子增強拉曼光譜SERS 是細胞成像中的一個重要手段，其增強機制包括電磁增強（EM）和化學增強（CM），其中EM 是SERS 增強的主要機制［9］。當入射光的頻率接近貴金屬納米離子表面自由電子的振蕩頻率時，產生局域等離子體共振效應（LSPR，圖1A）［10］；當相鄰的金或銀納米顆粒相互靠近時，它們的等離子激元相互作用會形成“熱點”區(qū)域（圖1B）［11］，即形成局域極高電場強度，從而增強樣品的拉曼信號。SERS 的發(fā)生要求納米顆粒間隙小于10 nm，通常需要通過調節(jié)材料的納米陣列結構來實現。優(yōu)化后的納米陣列基底可達到極高的增強因子（1010~1012）［12］。靈敏的SERS 技術被用于細胞免疫檢測，如上海師范大學楊海峰教授課題組制備了4-巰基苯甲酸（4-MBA）修飾金納米顆粒（Au NPs）的SERS 探針，并利用Fe3O4優(yōu)化Au NPs 等離子體共振，增強4-MBA 的SERS 信號，進而實現禽流感病毒H3N2的靈敏檢測［13］。

圖1 LSPR示意圖［10］（A），“熱點”示意圖［11］（B）及SERS細胞成像圖［18］（C），TERS示意圖［20］（D）及TERS識別單個DNA堿基［21］（E），SHINERS示意圖［24］（F）及SHINERS用于癌細胞成像［26］（G）Fig.1 （A） Schematic of LSPR ［10］，（B） hot spot ［11］ ，（C） SERS cell imaging pictures ［18］；（D） Schematic of TERS ［20］，（E）TERS identification of individual DNA bases ［21］；（F） Schematic of SHINERS ［24］，（G） SHINERS imaging of cancer cells ［26］

結合適當的標簽，SERS 技術能實現細胞成像，如湖南大學李繼山教授課題組利用炔烴標記AuAg@p-SiO2NP探針，實現了活細胞內H2O2的成像［14］。吉林大學徐抒平和梁重陽教授課題組利用炔烴標記SERS探針靶向脫氧核糖核酸（DNA），實現細胞核的精確定位［15］。上海交通大學葉堅教授課題組報道了一種具有花瓣狀殼結構的P-GERTs顆粒，顆粒內部的亞納米間隙和外部的花瓣狀殼結構具有較多的強電磁熱點，可以高速實現細胞組織成像［16］。此外，在長時間的細胞孵育過程中，SERS顆?？赡芘c細胞中抗體蛋白發(fā)生非特異性吸附，進而導致假陽性結果。為解決上述問題，沈愛國和胡繼明教授課題組提出了一種Click-SERS 的技術，利用三鍵信號分子在細胞拉曼靜默區(qū)的較強信號［17］，通過分步加入探針實現靶向和探針雜交，實現多個目標物的特征信號識別，從而避免假陽性結果（圖1C）［18］。

1.1.2 針尖增強拉曼光譜常規(guī)SERS成像技術的空間分辨率僅能達到200~300 nm，而針尖增強拉曼（TERS）作為一種新型SERS手段，利用LSPR在尖端頂點發(fā)生納米聚焦效應，使成像的空間分辨率突破了光學衍射極限，達到納米級別［19］。在細胞成像時，TERS尖端附近的強電磁場會明顯增強鄰近分子的拉曼信號（圖1D）［20］，可以同時提供細胞組分的化學鍵指紋信息和表面形貌信息。TERS 原子力顯微鏡實現了雙鏈DNA 上單個堿基的識別（圖1E）［21］。結合全內反射（TIR）的TERS 技術，可實現Tau 蛋白/肝素纖維的納米尺度成像［22］。Kumar等［19］應用TERS 實現了小鼠脂肪細胞的納米級繪圖，以20 nm 的空間分辨率繪制了胞內磷脂分子的二維圖像。

1.1.3 殼層隔絕納米粒子增強拉曼光譜殼層隔絕納米粒子增強拉曼（SHINERS）是一種改進的SERS技術，由廈門大學李劍鋒教授課題組提出［23］。SHINERS 在金銀SERS 顆粒表面涂覆2 nm 厚的惰性層，隔離SERS納米結構，使其不與目標分子發(fā)生接觸或反應，并減少納米顆粒團聚，進而提高檢測信號的穩(wěn)定性（圖1F）［24］。SHINERS 被有效應用于活細胞研究，如吉林大學徐蔚青教授課題組采用Au@SiO2殼層隔絕納米粒子，基于SHINERS光譜和成像圖的差異區(qū)分正常乳腺細胞和癌變細胞［25］。此外，石墨烯具有較高的物理化學穩(wěn)定性和生物相容性，被認為是SHINERS的理想惰性殼層。湖南大學陳卓和譚蔚泓教授課題組制作了石墨烯涂覆的金納米粒子（GIAN），利用其在1 325 cm-1和1 595 cm-1附近的強SERS振動信號（分別對應石墨烯殼層的D、G 拉曼振動模式），實現了MCF-7乳腺癌細胞的拉曼成像（圖1G）［26］。此外，SHINERS 在食品安全、環(huán)境檢測中也具有應用潛力，可用于檢測果蔬中的農藥殘留、非法食品添加劑以及環(huán)境中的亞硝酸根等污染物［27］。

基于等離激元效應的SERS 技術在細胞成像方面表現出色，但SERS 納米顆粒可能對細胞的生理活動產生一定影響。此外，用于細胞拉曼成像的材料也需要達到更高的制備要求：TERS技術需制作耐激光加熱和抗污染的針尖，SHINERS 需精確控制納米顆粒的大小、形狀和表面惰性層的厚度，以獲得穩(wěn)定的光譜信號。因此，非線性拉曼光譜和分子內拉曼增強等方法有可能避免上述問題，改進細胞拉曼成像的效果。其具體研究進展綜述如下。

1.2 相干拉曼光譜

1.2.1 相干反斯托克斯拉曼光譜CRS 是非線性拉曼光譜技術，包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS）。泵浦光（ω1）是激發(fā)樣品的光源，將原子或分子激發(fā)到高能級。斯托克斯光（ω2）是泵浦光與樣品相互作用，并發(fā)生能量損耗后產生的拉曼散射光。當泵浦光和斯托克斯光的頻差與分子的振動頻率匹配時，產生與振動相關的相干極化。然后利用探測光（ω3）與樣品進一步相互作用，產生反斯托克斯的相干輻射（ω4），即CARS 現象（圖2A）［28］。CARS 增強了拉曼信號，提高了成像速度，可以實現活細胞中脂滴等大分子物質的無標記拉曼成像（圖2B）［29］。Borri 等［30］利用CARS 區(qū)分脂質類型和量化脂滴的空間分布，觀察了細胞分化過程中的脂質攝取過程。而由于CARS 技術在寬視場照明中通常需要較高的激光功率，研究人員結合了SERS信號增強以減少功率消耗［31］。例如，添加4-巰基吡啶（4-Mpy）修飾的Au 納米顆粒后，CARS 所需的功率密度降低了1 000 倍，同時實現了每秒120幀的成像速度。利用這項技術觀察了饑餓細胞釋放生物分子的動態(tài)過程。

圖2 CARS光譜能級躍遷圖［28］（A）及CARS無標記活細胞成像［29］（B），SRS光譜能級躍遷圖［32］（C）及SRS氘標記細胞成像［36］（D），EPR-SRS光譜能級躍遷圖［37］（E）及EPR-SRS神經元細胞成像［39］（F）Fig.2 （A） Energy transition process diagram of CARS ［28］，（B） label-free live-cell CARS imaging picture［29］；（C） Energy transition process diagram of SRS［32］，（D） SRS imaging of deuterium-labeled cells［36］；（E） Energy transition process diagrams of EPR-SRS［37］，（F） EPR-SRS imaging of neuronal cells［39］

1.2.2 受激拉曼光譜SRS是當泵浦光和斯托克斯光的頻差與分子的振動頻率匹配時，自發(fā)散射過程轉變?yōu)槭芗み^程，泵浦光的強度降低，斯托克斯光的強度增大（圖2C）［32］。謝曉亮教授課題組首次將SRS 技術用于顯微成像，發(fā)現該技術不易受到虛假背景的干擾［33］，并通過增強反向散射信號的收集提高SRS 成像質量，實現了高靈敏、高分辨和高速度的SRS 生物成像［34］。該技術可在無標記條件下對組織進行觀察，例如跟蹤脂質、蛋白質藥物在小鼠和人體皮膚中的滲透路徑。Cunha 等［35］在觀察小鼠腦組織Aβ斑塊時，發(fā)現以酰胺B作為指紋的SRS成像比CARS成像具有更高的分辨率和更快的成像速度。但SRS 也存在局限性，如蛋白質、核酸、聚糖等分子在化學組成上無明顯區(qū)別，其SRS 信號非常相似，很難區(qū)分。為解決這一問題，研究人員引入同位素標記的方法，同位素D 標記后的分子會產生與C—H鍵不同振動頻率的C—D鍵，從而與背景信號分開。閔瑋教授課題組利用D2O標記HeLa細胞等動物活細胞，由于不同類型大分子中C—D鍵周圍的化學環(huán)境不同，其拉曼位移不同，可以分別實現蛋白質、脂質和DNA的成像（圖2D）［36］。

1.2.3 電子預共振受激拉曼光譜CARS 和SRS均發(fā)生在非電子能級共振區(qū)域。當泵浦光能量與分子內電子躍遷能級接近時，分子的振動信號會通過電子振動耦合增強（圖2E）［37］。閔瑋教授課題組報道了這種電子預共振受激拉曼（EPR-SRS）技術［37-40］。當振動被調到預共振狀態(tài)，拉曼峰信號可增強5 個數量級，從而實現胞內DNA 和蛋白的快速穩(wěn)定成像。因為EPR-SRS 的振動線寬（10 cm-1）比熒光顯微鏡（1 500 cm-1）窄約100倍，可以實現多色拉曼成像（圖2F）［39］。閔瑋等基于氰基、炔基的特征信號設計了調色方案，獲得了8 種MARS 染料，當與商用熒光染料結合使用時，可提供16 種清晰的顏色用于活細胞成像。

無標記CARS 技術的空間分辨率能達到亞微米級別，適用于觀察高濃度分子或生物大分子。但CARS易受到非共振背景的干擾，從而限制了其在細胞分析中的應用。SRS技術需要在強烈的斯托克斯光和泵浦光之間檢測非常小的差分信號，這需要調制敏感的傳輸方案才能實現，且SRS 的光譜窗口有限，將其擴展到全波段模式具有技術挑戰(zhàn)。EPR-SRS 通常需要較高的光譜能量密度來探測低濃度的生物分子，成像時難以避免高功率激光對細胞的光毒性?？傮w來說，此類CRS 技術需要復雜、高端的光學儀器才能實現。與此相比，分子內增強拉曼的思路有望擺脫這方面困擾。如果與特定的小分子拉曼探針相結合，這種增強策略將大幅降低對細胞成像光學儀器的苛刻要求，有望實現細胞不同組分的特異性高靈敏成像。

1.3 共振拉曼光譜

1.3.1 表面增強共振拉曼光譜共振拉曼光譜（RRS）利用共振效應實現拉曼信號增強，一般可實現2~4 個數量級的增強［41］。表面共振增強拉曼散射（SERRS）利用信號分子的共振效應和LSPR 效應相結合，可以進一步提高SERS 的靈敏度。如Kaya 等［42］將銀負載鐵-氨基三乙酸（Fe-NTA）的SERRS 探針用于檢測多巴胺，在銀納米顆粒表面產生LSPR 效應增強拉曼信號，同時NTA-Fe-多巴胺復合物通過與633 nm激光的共振進一步增強拉曼信號，可以實現多巴胺的靈敏檢測，檢出限低至0.5 pmol/L（圖3A）。此外，SERRS 技術可以檢測到非常小的癌前病變［43］并進行癌細胞成像（圖3B）［44］。Harmsen 等［43］開發(fā)了一種生物相容和檢出限極低（10-15mol/L）的SERRS-NPs（納米粒子），通過小鼠腸胃內窺鏡的拉曼成像觀察到癌前病變組織。Jermyn 等［45］應用SERRS 在手術中觀察腫瘤邊緣，準確區(qū)分了正常腦細胞和癌變細胞。該技術在指導癌癥治療方面具有較大應用潛力。

圖3 銀納米粒子負載Fe-NTA的SERRS示意圖［42］（A）及癌細胞SERRS成像［44］（B），AERS示意圖［52］（C）及AERS線粒體成像［52］（D）Fig.3 （A） Schematic of SERRS using silver nanoparticles loaded with Fe-NTA［42］，（B） cancer cell SERRS imaging［44］；（C） Schematic of AERS［52］，（D） mitochondrial AERS imaging［52］

1.3.2 分子內共振拉曼光譜類胡蘿卜素和細胞色素等細胞分子在可見光區(qū)有較強吸收，通過觀察其共振增強拉曼信號，可以實現無標記RRS 成像［46-48］。但大多數細胞分子僅吸收紫外光，而紫外光對細胞具有光毒性，限制了RRS無標記成像的應用［49］。為解決上述問題，研究人員設計了一種適用于細胞成像的共振拉曼探針，該探針在475 nm處具有最大吸收峰，在532 nm激光激發(fā)下可將偶氮苯的特征信號（1 375 cm-1）提高550 倍，實現較低光毒性的RRS 成像［50-51］。該研究展示了此探針用于細胞膜、線粒體的高對比度成像和免疫標記成像。

本課題組提出了偶氮增強拉曼散射（AERS）的新方法，合成了系列AERS 探針的分子庫，揭示了其分子結構對信號增強的影響機制（圖3C）［52］：通過共軛鏈接偶氮苯與特征振動基團，增加電子能級與振動能級的耦合程度，分子吸收峰紅移至可見區(qū)，可實現共振拉曼效應，大幅提高拉曼散射強度。同時，偶氮苯順反異構化導致非輻射能量釋放，抑制熒光背景，可進一步提高拉曼散射的信噪比。將偶氮苯作為增強模塊，可使多種振動模式的拉曼信號增強至2~4 個數量級?；诖?，設計了可以靶向線粒體的靈敏AERS 探針，并實現了多色細胞成像（圖3D）和多色標記的混合細胞解碼。由于AERS 的多色成像和多色編碼可用于多個對象的同時觀測，該技術將為研究細胞內不同細胞器和生物分子之間的相互作用提供有效工具［53］。

綜上所述，共振拉曼技術可以增強拉曼信號的強度。但SERRS共振標簽和目標分子在顆粒表面的吸附并不均勻，難以利用其拉曼散射信號強度定量分析細胞分子的濃度；分子內共振拉曼散射要求設計與合成分子內共軛結構，同時避免共軛結構的熒光背景干擾。

2 細胞拉曼成像

不同的拉曼增強技術具有不同的優(yōu)勢。SERS技術具有較高的靈敏度，CRS技術可實現高分辨快速成像，而RRS 技術結合小分子探針可實現全譜帶高分辨快速成像。它們在細胞成像領域均有廣泛應用，其應用范圍分為無標記和標記拉曼成像。無標記成像具有較高的生物相容性，而標記成像可在復雜的細胞環(huán)境中特異性識別目標物。利用這些技術觀察細胞器的動態(tài)變化和生物分子的代謝過程，對于了解細胞的生理狀態(tài)具有重要意義。

2.1 細胞無標記拉曼成像

無標記拉曼成像技術在不添加探針標記的前提下，直接進行活細胞成像。通常無標記拉曼成像需使用非線性CRS 技術增強信號強度。脂滴是脂質的聚集體，含有大量相同的C—H 鍵，使得脂滴非常適合進行相干成像，成為常見的研究對象［54］?；凇狢H2—鍵的伸縮振動峰（2 845 cm-1），Fueser 等［55］對線蟲體內脂滴進行了CARS成像，并觀察了環(huán)境污染物微塑料對線蟲體內脂滴分布的影響，發(fā)現0.1μm的聚苯乙烯微球（PS）會導致脂滴的明顯積累。Borri等［30］利用CARS觀察了脂肪干細胞中單個脂滴的時空分布，發(fā)現脂肪干細胞分化成熟后，細胞內脂滴的化學含量對外源變化的反應速度會顯著降低（圖4）。此外，拉曼成像可以作為一種細胞脂滴含量的測量工具。Pacia等［56］利用拉曼成像分析了內皮細胞中脂滴的含量，并分析了脂滴的不飽和程度。雖然無標記拉曼成像被廣泛應用，但在實際應用中仍存在挑戰(zhàn)，例如成像分辨率不高、難以區(qū)分結構相似的生物分子等。為解決這些問題，標記拉曼技術被廣泛采用。

圖4 脂肪干細胞中的脂滴CARS成像［30］Fig.4 CARS imaging of lipid droplets in adipose-derived stem cells［30］

2.2 細胞標記拉曼成像

2.2.1 細胞器標記拉曼成像線粒體是細胞供能、代謝調節(jié)、應激響應的重要細胞器［57］。線粒體中含有大量細胞色素C，當激發(fā)光與細胞色素C產生共振效應時，可以進行線粒體的無標記成像［58-59］。但細胞色素C 的特征譜帶可能被細胞內蛋白質和脂質的拉曼信號掩蓋［60］。為實現更準確的線粒體成像，研究者開發(fā)了特異靶向線粒體的拉曼探針。Sodeoka 課題組將雙芳基丁二炔（BADY）與三苯基膦（TPP+）連接合成線粒體探針（MitoBADY），利用帶正電荷的TPP+特異性靶向帶高負電荷的線粒體，實現細胞內線粒體的準確成像［61］。Wilson 等［62］添加Mitokyne探針實現HeLa細胞中線粒體的高分辨率成像，并利用探針對pH 的拉曼光譜響應，實現了線粒體pH 傳感。新加坡國立大學黃志偉教授課題組設計了一種二炔拉曼標記探針（BDDBPDM），將兩個苯環(huán)連接到二炔鍵的兩端以增強C≡C 鍵周圍的電子離域程度［63］。BDDBPDM 探針與三苯基膦（TPP）鏈接后，可以高特異性地靶向線粒體。利用SRS顯微鏡，觀察了藥物誘導后線粒體的分離和聚集過程（圖5A）。此外，線粒體的多色、動態(tài)成像對于研究其生命功能具有重要意義。復旦大學季敏標教授課題組通過設計炔標記的二芳基乙烯（DTE）實現線粒體的光致多色成像［64］。當DTE 發(fā)生光致異構化時，閉環(huán)反應會改變DTE 的電子結構，誘導共軛炔基發(fā)生拉曼位移并增強SRS 信號。他們通過小范圍紫外線照射的方式使部分線粒體光致變色，利用SRS 顯微鏡實現了線粒體的多色成像和動態(tài)觀察。

圖5 BDDBPDM-TPP探針的線粒體標記拉曼成像［63］（A）；DAERI溶酶體成像圖［67］（B），溶酶體均方位移（MSD）動力學分析及溶酶體運動軌跡示例［67］（C）；氘標記的SRS成像示意圖［71］（D）及內質網-氘標記的SRS成像［71］（E）Fig.5 （A） BDDBPDM-TPP labeled mitochondrial Raman imaging［63］；（B） DAERI of lysosomes［67］，（C） mean square displacement analysis of lysosomes and motion tracks of lysosomes［67］；（D） Schematic of deuterium-labeled SRS imaging［71］，（E） ERdeuterium-labeled SRS imaging［71］

溶酶體是細胞物質和能量循環(huán)的重要場所，參與細胞的自噬過程，其主要功能是清除細胞內外源有害物質，如錯誤折疊的蛋白質、受損細胞器和病原體等［65］。Prasad 教授課題組設計了BBQ650-Lyso探針，其共振拉曼增強發(fā)生于低毒性的紅光光譜范圍，減少了細胞的光損傷，可以實現對活細胞中溶酶體的準確成像［66］。華中科技大學羅亮教授課題組采用主客體拓撲化學聚合策略進行二乙炔聚合，此PDDA-Lyso 探針可以實現胞內溶酶體的高分辨成像［32］。本課題組開發(fā)了基于偶氮增強的活細胞高分辨快速動態(tài)拉曼成像技術（DAERI），展示了70個溶酶體的生物物理特征統(tǒng)計以及每個溶酶體的生理運動軌跡（圖5B、C）［67］。DAERI 采用低功率（75 μW/μm2）和線掃描的方式，可以實現多細胞器的高分辨（270 nm）、快速動態(tài)（3.5 s/frame）、全譜（500~3 200 cm-1）自發(fā)拉曼成像。

內質網（ER）是細胞中蛋白質和脂質合成的重要場所和胞內最大的膜結構［68］。ER 中含有高濃度的磷脂，Czamara 等［69］利用磷脂膽堿中N+（CH3）3的伸縮振動峰（720 cm-1）實現ER 的成像。但Majzner 等認為其他細胞器中也含有磷脂，利用脂質中—CH2—的伸縮振動峰（2 830~2 900 cm-1）進行區(qū)分的準確性更高，他們利用這個特征信號實現了ER的成像［70］。另外，棕櫚酸酯是脂質合成的主要原料之一，閔瑋教授課題組利用氘標記的棕櫚酸酯也實現了ER 成像（圖5D、E）［71］。他們基于C—D 鍵的SRS 圖像，觀察到新合成的脂質在ER上會發(fā)生相分離。

2.2.2 生物分子標記拉曼成像蛋白質是細胞修復與再生的主要原料，參與細胞代謝、信號傳導和化學運輸等重要過程。拉曼探針標記可以實現胞內蛋白質成像。Fujioka等［72］設計了4種氰基拉曼探針，分別靶向3種氨肽酶和1種糖苷酶，實現了活細胞中4種酶的同時成像。特異性識別細胞或組織表面的蛋白質，可為腫瘤或癌細胞的診斷提供依據［73］。北京大學湯新景教授課題組設計了3種生物正交SERS納米探針，分別靶向3 種癌細胞標志物核仁素、αvβ3 整合素和CD44，實現了乳腺癌細胞多色成像［74］。北京航空航天大學王曉天教授課題組設計了SERS 納米探針B-TiO2，能夠快速靶向MCF-7/ADR 癌細胞表面的P-糖蛋白，實現癌細胞成像［75］。湖南大學陳卓和譚蔚泓教授課題組設計了一系列同位素C13石墨烯-Au 納米探針（GIAN），利用不同探針與膜蛋白的親和力差異，開發(fā)了一種SERS 條形碼癌細胞分選系統(tǒng)，通過A549 和HepG2 的分子表達區(qū)分，實現了癌細胞多色成像（圖6）［76］。GIAN 編碼器具有高靈敏度和低熒光背景干擾的特點，在癌細胞鑒定方面具有應用潛力。

圖6 GIAN編碼器識別癌細胞示意圖［76］（A）及A549、HepG2癌細胞成像［76］（B）Fig.6 （A） Schematic of GIAN-encoders identifying cancer cells［76］，（B） A549 and HepG2 cell imaging［76］

糖類是細胞活動所需能量的主要來源。糖類代謝異?？勺鳛樘悄虿　⒛[瘤發(fā)生的診斷指標［64］。同位素標記通常不會干擾糖類的正常功能，是糖類等小分子代謝的理想示蹤劑。Li等［77］利用氘標記的葡萄糖探針（D7-glucose），通過SRS 觀測了胰腺癌細胞中葡萄糖用于脂質的合成過程（圖7A），為細胞代謝中的異質性研究提供了一種可視化手段。閔瑋教授課題組報道了炔基標記的葡萄糖探針（3-OPG）用于觀察單細胞的葡萄糖攝取過程，借助細胞拉曼靜默區(qū)的特征拉曼信號，實現高特異性的葡萄糖SRS成像［78］。由于3-OPG（2 129 cm-1）和D7-glucose（2 060~2 250 cm-1寬峰）之間的拉曼峰有光譜重疊，很難實現雙色成像。該課題組利用同位素C13標記3-OPG 探針（2 053 cm-1），將其特征峰與D7-glucose 的寬峰分離，從而利用兩者的特征信號實現了雙色成像，同時觀察了小鼠腦組織細胞的葡萄糖攝入和異質性代謝過程［79］。

圖7 細胞葡萄糖代謝過程的SRS成像［77］（A），EdU標記的HeLa細胞核SRS成像［83］（B）Fig.7 （A） SRS imaging of cellular glucose metabolism［77］；（B） SRS imaging of EdU labeled HeLa nucleus［83］

核酸是遺傳信息的載體，指導基因表達和蛋白質合成。核酸的突變或異常調節(jié)可能導致疾病發(fā)生，因此胞內核酸成像具有重要意義［80］。Meister 等［81］發(fā)現5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（EdU）易于整合到細胞DNA 并在細胞核中積累，隨后日本Sodeoka 教授課題組［82］報道了炔基標記EdU 探針用于細胞成像，并觀察了HeLa 細胞增殖時DNA 的合成過程。北京大學黃巖誼教授和陳興教授課題組開發(fā)了一種生物正交SRS 成像技術，利用炔類標簽處于1 800~2 800 cm-1拉曼靜默區(qū)的特征信號，明顯提升了EdU 的SRS 成像效果，準確定位了細胞核（圖7B）［83］。黃巖誼課題組利用具有大量π 共軛結構的苯乙炔（PPE）衍生物作為探針，進一步提升了細胞成像的對比度［84］。該研究展示了共軛多炔聚合物在細胞成像中的應用潛力。SERS探針也被廣泛應用于核酸成像，如Huefner等［85］利用Au-NPs探針連接靶向核酸的肽序列（Flu），實現細胞核的準確成像。異常表達的微小核糖核酸（miRNA）有望作為癌癥發(fā)生的標志物，但其濃度極低、較難被檢測。湖南大學李繼山教授課題組通過核酸酶和DNA 水凝膠制成了SERS 傳感陣列，利用SERS增強拉曼信號，實現了miRNA的識別和定量［86］。

2.2.3 離子標記拉曼成像離子在調節(jié)細胞內滲透壓和酶催化反應中發(fā)揮重要作用。目前常用的細胞離子成像方法包括二次離子質譜法、熒光探針法和拉曼探針法等［87-88］。其中，二次離子質譜和熒光探針法可以實現細胞內Al3+、K+、Ca2+等金屬離子成像。4-MBA、4-Mpy 等拉曼探針可用于胞內質子成像［89］。廈門大學任斌教授課題組將4-Mpy 修飾在SERS 粒子表面，利用4-Mpy 的苯環(huán)C=C對稱伸縮峰（1 610 cm-1）和苯環(huán)C=C反對稱伸縮峰（1 575 cm-1）進行比例型pH 傳感，觀察了癌細胞凋亡過程中的pH 變化［90］。由于在成像過程中SERS 顆粒易受到胞內其他小分子干擾，南京大學王康教授課題組利用涂覆在顆粒表面的精氨酸作為保護殼層，實現修飾后探針的較高穩(wěn)定性，使探針在酸堿介質中24 h 內仍具備pH 傳感能力［91］。相比于大尺寸的SERS探針，小分子拉曼pH 探針具有更高的生物相容性。Wilson等［62］報道了一種pH-mito 探針靶向線粒體，利用酚羥基的得失質子能力產生拉曼響應，實現胞內線粒體的氫質子成像。本課題組設計了一種AERS-pH 探針，靈敏地觀察到質子化/去質子化過程中化學鍵的斷裂與生成。由此引起的1 350 cm-1和1 606 cm-1處振動指紋的比例型變化，可用于觀測溶酶體在正常和饑餓狀態(tài)下的質子分布變化（圖8）［92］。

圖8 HeLa細胞溶酶體內質子分布的AERS成像［92］Fig.8 AERS imaging of proton distribution in HeLa cell lysosomes［92］

3 總結與展望

細胞拉曼成像在生命科學和藥物研究領域具有廣闊的應用前景，其優(yōu)點包括振動指紋傳感的特異性和多色細胞成像的能力。各種細胞拉曼成像技術具有各自的特點（表2）。SERS 技術使用納米顆粒作為探針，需要有效提升等離基元材料的性能重現性，并避免其對細胞的生理干擾。SRS 技術具有較高的細胞成像質量，但在一次測量中只能獲取有限的拉曼探測波段信息，限制了其用于多色成像的便利程度。分子內共振拉曼技術借助小分子拉曼探針的化學結構設計，具有更大的靈活性。其靈活性不僅提供細胞成像所需的靈敏度，還提供了各種細胞器、胞內生物分子、離子等的靶向或響應位點，因此分子內共振拉曼技術也展現了細胞成像的應用潛力。將分子內共振拉曼技術與SERS、CRS、TERS 等相結合，是未來值得嘗試的新方向，有可能進一步提高細胞成像的時間和空間分辨率。

表2 細胞拉曼成像技術總結Table 2 Summary of cell Raman imaging methods

目前拉曼成像技術主要處于實驗室研究階段，未來這些技術能否在醫(yī)學基礎研究甚至臨床應用研究中發(fā)揮關鍵作用，將依賴于細胞拉曼成像的具體應用場景，并取決于相應的細胞拉曼成像技術攻關。這一重要目標的實現，需要相關交叉領域的研究者們未來共同攜手努力。