阿卜力米提·阿卜杜喀迪爾，張其奧，李佩波，謝建平

綜 述

分枝桿菌生物被膜發(fā)育調(diào)控與抗生素耐藥菌防控新措施研發(fā)

阿卜力米提·阿卜杜喀迪爾1，張其奧1，李佩波2，謝建平1

1. 西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究所，重慶 400715 2. 重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療中心，重慶 400036

目前，已知的分枝桿菌屬有170多種，是分枝桿菌科中唯一的屬。該屬的微生物在引起人類疾病的能力方面呈現(xiàn)多樣化。分枝桿菌屬包括人類病原體(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群和麻風(fēng)分枝桿菌)和被稱為非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculosis mycobacteria，NTM)的環(huán)境微生物。分枝桿菌的一個(gè)常見(jiàn)致病因素是生物被膜的形成。細(xì)菌生物被膜通常被定義為表面附著的細(xì)菌群落，也被認(rèn)為是被包裹的微生物細(xì)胞的共享空間，包括各種胞外聚合物基質(zhì)(extracellular polymeric substances，EPS)，如多糖、蛋白質(zhì)、淀粉樣蛋白、脂類和胞外DNA (extracellular DNA，EDNA)，以及膜小泡和類腐殖質(zhì)微生物衍生的難降解物質(zhì)?；|(zhì)的組裝和動(dòng)力學(xué)主要由第二信使、信號(hào)分子或小RNA協(xié)調(diào)。完全破譯細(xì)菌如何為基質(zhì)提供結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)細(xì)胞外反應(yīng)并從中受益，仍然是未來(lái)生物被膜研究的挑戰(zhàn)。本文介紹了生物被膜五步發(fā)育模型和生物被膜形成的新模型，分析了生物被膜的致病性，與噬菌體、宿主免疫細(xì)胞的互作，同時(shí)解析了分枝桿菌生物被膜關(guān)鍵基因及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分枝桿菌生物被膜與耐藥性，以期為臨床上治療由生物被膜引起的疾病提供基礎(chǔ)。

分枝桿菌；生物被膜；抗菌素耐藥性

分枝桿菌()是一大類細(xì)胞壁中富含脂質(zhì)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，分枝桿菌屬隸屬于放線菌目(Actinomycetes)分枝桿菌科(Mycobacteriaceae)。目前已發(fā)現(xiàn)分枝桿菌屬有200多種，其中致病型分枝桿菌比較少，大多數(shù)分枝桿菌是與人類感染無(wú)關(guān)的環(huán)境微生物。分枝桿菌屬中的結(jié)核分枝桿菌()、牛結(jié)核分枝桿菌()、田鼠分枝桿菌()和非洲分枝桿菌()等因生物學(xué)特性接近又被稱為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，它們是導(dǎo)致人類結(jié)核病的主要病原菌。分枝桿菌屬中除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)。隨著分枝桿菌種類不斷增加的同時(shí)，由NTM引起的感染在全球范圍內(nèi)也在增加。從臨床標(biāo)本中分離出的分枝桿菌并進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，對(duì)于此類感染性疾病的診療具有重要的指導(dǎo)意義[1]。

分枝桿菌作為一種慢性感染病原體，其生物被膜(biofilm，BF)的形成在其感染中起著重要的作用。分枝桿菌生物被膜可以抵御宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，使細(xì)菌對(duì)抗傳統(tǒng)藥物的能力增強(qiáng)，并且能夠增強(qiáng)細(xì)菌的生存能力，從而導(dǎo)致治療難度的增加和慢性感染的持續(xù)。此外，生物被膜也可以促進(jìn)細(xì)菌的侵襲性和毒性，使其在宿主細(xì)胞內(nèi)形成索狀結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致細(xì)菌更難以被清除。生物被膜的形成與結(jié)核分枝桿菌毒力和耐藥性的關(guān)系在結(jié)核分枝桿菌感染肺的過(guò)程中也得到了證實(shí)[2]。生物被膜內(nèi)的分枝桿菌能夠在肺泡泡沫細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存活。這些細(xì)菌能夠隱蔽地居住在生物被膜中，并在宿主體內(nèi)形成新的感染灶，從而降低傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物的療效，并使得治療時(shí)間延長(zhǎng)。因此，生物被膜與分枝桿菌感染的關(guān)系非常密切，其研究對(duì)預(yù)防和治療分枝桿菌感染具有重要的意義。在實(shí)驗(yàn)室體外實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌通常作為單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行研究，稱為浮游培養(yǎng)物，然而在自然界中，多數(shù)細(xì)菌主要作為一個(gè)菌落存在，包裹在自身產(chǎn)生的稱為生物被膜的細(xì)胞外基質(zhì)中。與浮游細(xì)菌細(xì)胞相比，生物被膜中的細(xì)菌細(xì)胞表現(xiàn)出非常不同的表型特性[3]。細(xì)菌生物被膜的形成需要協(xié)作、分化和分工以捕獲和共享營(yíng)養(yǎng)等資源。生物被膜是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向，涉及微生物學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)、藥物學(xué)等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域，其相關(guān)研究取得了許多重要的成果。本文主要綜述了分枝桿菌生物被膜形成、功能、宿主互作和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等方面的研究進(jìn)展。

1 分枝桿菌生物被膜

生物被膜是指微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中附著于生物材料或人體組織表面，由自身產(chǎn)生的大量胞外基質(zhì)(extracellular polymeric substances，EPS)包裹的具有特定結(jié)構(gòu)的細(xì)菌群體，是微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中為了適應(yīng)生存環(huán)境而形成的一種非游離狀態(tài)菌細(xì)胞的獨(dú)特形式[4]。在過(guò)去的40年里，微生物學(xué)家將細(xì)菌歸類為在自然界中顯示兩種生命形式。在一種情況下，細(xì)菌表現(xiàn)為單一的、獨(dú)立的、自由漂浮的細(xì)胞；在另一種情況下，細(xì)菌以微生物聚集體的形式組織起來(lái)。結(jié)核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌()等多種分枝桿菌已被證明可在體外培養(yǎng)時(shí)形成生物被膜[5]，分枝桿菌生物被膜已成為研究分枝桿菌的熱門領(lǐng)域[6]。

分枝桿菌代表了一個(gè)生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌大家族，包括致病的結(jié)核分枝桿菌，以及被用作研究致病型分枝桿菌基因調(diào)控機(jī)制的模式生物恥垢分枝桿菌等[7]。分枝桿菌形成的生物被膜被包裹在細(xì)菌產(chǎn)生的胞外聚合物基質(zhì)中[8,9]。一般來(lái)說(shuō)，生物被膜基質(zhì)主要由多糖、脂類、黏附蛋白和分泌的胞外DNA組成(圖1)。然而，基質(zhì)的分子組成在不同細(xì)菌物種之間存在顯著差異[10]。

細(xì)菌可以根據(jù)環(huán)境和時(shí)間的變化調(diào)控基因表達(dá)，例如編碼電子傳遞鏈末端氫醌氧化酶基因的表達(dá)水平會(huì)隨著生物被膜中溶氧量的變化而變化，這種環(huán)境變化引起的基因異質(zhì)性表達(dá)有助于細(xì)菌在宿主體內(nèi)存活[11]。在不同的環(huán)境中，異質(zhì)菌群總是比同質(zhì)菌群表現(xiàn)出更強(qiáng)的適應(yīng)能力。

除了多糖，分枝桿菌生物被膜中還含有多種蛋白質(zhì)。其中，外膜蛋白(outer membrane proteins, OMPs)是最為重要的一類。OMPs主要分布在生物被膜的外層，具有多種功能，如調(diào)節(jié)物質(zhì)的進(jìn)出、維持細(xì)胞形態(tài)和穩(wěn)定性等。OMPs還能夠與宿主細(xì)胞相互作用，從而影響分枝桿菌的致病性和耐藥性。此外，OMPs與生物被膜電子供體和受體、氧化還原梯度、溶氧量、pH值等的差異有關(guān)[12]。也有研究表明，無(wú)機(jī)鹽的缺乏會(huì)影響細(xì)胞壁的脂肪酸組成，進(jìn)而改變了菌株滑動(dòng)和形成生物被膜的能力[13]。目前尚不清楚不同生物膜系統(tǒng)中各EPS組分的功能是否相似。

圖1 生物被膜的成分

2 分枝桿菌生物被膜發(fā)育過(guò)程

“生物被膜”一詞對(duì)于非專業(yè)人士來(lái)說(shuō)，仍然有些含糊。關(guān)于現(xiàn)在所說(shuō)的“生物被膜”的一些最早的提法起源于廢水處理、海洋污染和牙齒微生物學(xué)，“膜”一詞通常被用來(lái)描述在固體表面上形成的生物層，從宏觀觀察或物理接觸來(lái)看，它似乎是覆蓋在相當(dāng)大的表面上的連續(xù)層，特別是在生物廢水處理和海洋污垢方面。這表明存在一種固體表面，在該表面上散布著一層微生物——細(xì)胞以片狀、薄或多層模式定植[14]。然而，最近非表面附著的大量聚集的細(xì)菌也被認(rèn)為是生物被膜[14～16]。同樣，非表面聚集相關(guān)的生物被膜在臨床中得到承認(rèn)，慢性生物被膜感染進(jìn)一步分為表面相關(guān)感染和非表面相關(guān)感染。表面相關(guān)性感染通常是因?yàn)橹踩脶t(yī)療器械而發(fā)生的感染，而非表面相關(guān)感染則包括宿主粘液纖毛清除受損的呼吸道感染(囊性纖維癥患者在粘性呼吸道粘液中)或持續(xù)性軟組織感染，這些感染與糖尿病和易導(dǎo)致無(wú)法愈合傷口的下肢血管形成障礙等并發(fā)癥有關(guān)[17]。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為生物被膜的形成是由5個(gè)步驟完成。而近年來(lái)提出的新模型認(rèn)為，它包含了生物被膜生命的3個(gè)主要步驟：聚集與附著、生長(zhǎng)和積累以及解體與散布，該模型被認(rèn)為代表了更廣泛的生物被膜系統(tǒng)[18]。

生物被膜的形成取決于組成生物被膜的微生物種類和環(huán)境因素。細(xì)菌細(xì)胞壁的粘附素介導(dǎo)細(xì)菌最初附著于介質(zhì)表面，一旦附著，細(xì)菌就開始合成細(xì)胞外基質(zhì)，通常由糖肽、DNA和其他分子組成。這些細(xì)胞外基質(zhì)一方面附著于介質(zhì)表面，另一方面將細(xì)菌包裹在其中，作為一層天然的物理屏障，保護(hù)其中的細(xì)菌免受侵害。分枝桿菌細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)地附著后，會(huì)有一段生長(zhǎng)期，導(dǎo)致與胞外多糖基質(zhì)形成微集落。在這一階段，細(xì)胞間的信號(hào)和細(xì)胞表面的相互作用在生物被膜的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，并幫助微生物向表面擴(kuò)散。分枝桿菌生物被膜的形成受分枝菌酸、細(xì)胞壁脂質(zhì)、鐵離子、纖維素和肽聚糖的影響，還依賴于水中Ca2+、Mg2+和Zn2+離子等營(yíng)養(yǎng)成分。

最初的生物被膜形成模型是基于綠膿桿菌()的研究。該模型認(rèn)為，生物被膜的形成是一個(gè)循環(huán)過(guò)程，以特定的5個(gè)階段漸進(jìn)式發(fā)生(圖2)。這一過(guò)程是由單個(gè)浮游細(xì)胞在接觸物體表面后啟動(dòng)的，包括可逆附著、不可逆附著、生物被膜成熟(成熟I和成熟II)，最后是散布等發(fā)育步驟[19,20]。在可逆附著過(guò)程中，細(xì)菌通過(guò)細(xì)胞極或通過(guò)鞭毛附著到底物上，然后縱向附著向不可逆附著的轉(zhuǎn)變，此時(shí)細(xì)菌的鞭毛翻轉(zhuǎn)率降低、鞭毛基因表達(dá)減少、產(chǎn)生生物被膜基質(zhì)成分，附著的細(xì)胞也會(huì)顯示出耐藥的特點(diǎn)[21]。生物被膜成熟階段的特征是出現(xiàn)了幾個(gè)厚的細(xì)胞團(tuán)，并嵌入生物被膜基質(zhì)(成熟I階段)，然后完全成熟發(fā)育成微集落(成熟II階段)[19,20]。最后的散布階段伴隨著基質(zhì)成分的減少和降解，散布的細(xì)胞具有運(yùn)動(dòng)性，相對(duì)于生物被膜細(xì)胞表現(xiàn)出更高的藥物敏感性。目前這一生物被膜模型的缺陷在于沒(méi)有考慮到在臨床或環(huán)境中經(jīng)常觀察到的非表面附著聚集體。

在有底物、氧氣和接觸分泌物的情況下，單個(gè)生物被膜或聚集體的微環(huán)境存在巨大差異[22～24]，這使得對(duì)來(lái)自不同環(huán)境的生物被膜的評(píng)價(jià)變得更加復(fù)雜。對(duì)此，Karin等[18]提出了一個(gè)更新的、更全面的模型，描述了生物被膜形成中的3個(gè)主要的基本事件：聚集、生長(zhǎng)和解聚(圖3)。該模型被認(rèn)為可以用來(lái)描述生物被膜形成的大多數(shù)不同場(chǎng)景，包括體外、原位和體內(nèi)，涵蓋了生物被膜聚合發(fā)展的不同可能性和途徑。

3 生物被膜的致病性及與噬菌體、宿主免疫細(xì)胞的互作

當(dāng)細(xì)菌成功地在宿主體內(nèi)形成生物被膜時(shí)，感染通常是很難被治愈，并在低度炎癥的持續(xù)下發(fā)展為慢性狀態(tài)。最近的研究結(jié)果表明，細(xì)菌在急性和慢性感染中的差異是由于代謝活動(dòng)而不是聚集[25]。分枝桿菌生物被膜是其致病性的重要因素之一。生物被膜能夠保護(hù)菌體免受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，從而增強(qiáng)其致病性；能夠與宿主細(xì)胞相互作用，影響宿主細(xì)胞的功能和代謝；影響分枝桿菌耐藥性、降低細(xì)胞外酶的活性等。

圖2 生物被膜形成機(jī)制

該模型展示生物被膜的形成是一個(gè)循環(huán)過(guò)程，以特定5個(gè)階段漸進(jìn)式發(fā)生，包括可逆附著、不可逆附著、生物被膜成熟(成熟I和成熟II)，最后是散布。

圖3 生物被膜生命循環(huán)

該示意圖展示了生物被膜形成的新模型，包括生物被膜形成中獨(dú)立于表面和單細(xì)胞浮游細(xì)菌啟動(dòng)的3個(gè)主要事件，因此涵蓋了體外、原位和體內(nèi)系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的5步模型不同，此模型考慮了不同的生境、條件和微環(huán)境以及可能的新細(xì)胞涌入。

傳統(tǒng)上，噬菌體-細(xì)菌動(dòng)力學(xué)研究是在浮游培養(yǎng)環(huán)境中進(jìn)行的，沒(méi)有考慮空間組織和異質(zhì)性[26]。然而，意識(shí)到細(xì)菌主要生活在具有不同活動(dòng)的結(jié)構(gòu)化群落中，這引發(fā)了人們對(duì)解決環(huán)境中噬菌體和細(xì)菌之間的相互作用的顯著興趣?？臻g結(jié)構(gòu)的細(xì)菌群落研究涉及微生物生態(tài)及其相互作用，這其中又包括有機(jī)顆粒在微觀尺度上代謝活性提高、物種演替、生物被膜的更大和更復(fù)雜的群落的組裝等方面[27]。分枝桿菌噬菌體SWU1基因可以改變分枝桿菌細(xì)胞壁成分，從而改變菌落行為和生物被膜的形成[28]。此外，與生物被膜相關(guān)的細(xì)胞表現(xiàn)出單獨(dú)或在生物被膜外不可能實(shí)現(xiàn)的特征和活動(dòng)，通常被稱為應(yīng)急特性。這些新出現(xiàn)的特性包括酶、長(zhǎng)期的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、建立營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、pH和產(chǎn)氧微生境的梯度以及高度的異質(zhì)性[3]。

面對(duì)壓力條件，細(xì)菌通常會(huì)改變其生長(zhǎng)模式，形成生物被膜[29]，這是浮游細(xì)菌表面的微生物細(xì)胞的附著和功能群落[30]。細(xì)菌生物被膜被認(rèn)為是對(duì)抗壓力的一種自然防御[31]。一般認(rèn)為生物被膜為細(xì)菌提供“避難所”，抵御噬菌體和捕食細(xì)菌，生物被膜在感染期間的保護(hù)作用的研究較多。但是，Vidakovic等[32]發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌生物被膜在白細(xì)胞附近形成高濃度的毒素，以便殺傷免疫細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)顛覆了傳統(tǒng)觀點(diǎn)，細(xì)菌形成的生物被膜不僅是抵御入侵的“避難所”，更是攻克免疫細(xì)胞的“軍事基地”(圖4)。

4 分枝桿菌生物被膜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因

生物被膜的形成受到嚴(yán)格的調(diào)控。分枝桿菌具有獨(dú)特的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)；然而，其生物被膜形成的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制在很大程度上仍不清楚。分枝桿菌厚厚的細(xì)胞壁含有獨(dú)特的長(zhǎng)鏈分枝桿酸，這些分枝菌酸通過(guò)酯鍵與阿拉伯半乳糖共價(jià)連接[33～35]。有趣的是，這些特定的分枝菌酸被發(fā)現(xiàn)是致病和非致病分枝桿菌生物被膜的成分[36～38]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多個(gè)基因通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁脂的代謝來(lái)影響分枝桿菌生物被膜的形成，例如防止錯(cuò)誤折疊，促進(jìn)在壓力條件下產(chǎn)生的未折疊多肽的重折疊和正確組裝的[38]、參與還原S-亞硝基的谷胱甘肽的和參與真菌硫醇生物合成的[39]，以及編碼一種廣泛調(diào)節(jié)脫脂蛋白表達(dá)的核蛋白[40]。此外，Wang等[41]發(fā)現(xiàn)編碼包含PIN域的毒素蛋白VapC43的基因改變了恥垢分枝桿菌生物被膜的形態(tài)和功能。

圖4 生物被膜殺死免疫細(xì)胞

生物被膜的形成和解構(gòu)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，涉及到多種因素和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括了信號(hào)分子、第二信使、轉(zhuǎn)錄因子、養(yǎng)分和其他環(huán)境因素等。其中，養(yǎng)分的可獲得性通常被認(rèn)為是調(diào)節(jié)因素之一。例如，枯草芽孢桿菌對(duì)谷氨酰胺的限制減緩了生物被膜的生長(zhǎng)[42]；MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與生物被膜的形成和毒力有關(guān)[43]；恥垢分枝桿菌VWA蛋白MSMEG_3641參與細(xì)菌生物被膜的形成，并能影響細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的侵襲和存活，促進(jìn)了對(duì)生物被膜形成機(jī)制的理解[44]；此外還發(fā)現(xiàn)許多蛋白如多聚磷酸酶1(polyphosphate kinase 1)[45]、PE31[46]等參與到分枝桿菌生物被膜的形成和持久性。

細(xì)菌生物被膜的形成是一個(gè)程序化的過(guò)程，生物被膜發(fā)育的不同階段基因的表達(dá)不同，轉(zhuǎn)錄因子在形成生物被膜的過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用。結(jié)核分枝桿菌基因組中大約有200個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，目前已經(jīng)報(bào)道的參與調(diào)控分枝桿菌生物被膜形成的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量相對(duì)有限。在鼠疫耶爾森菌()中，轉(zhuǎn)錄因子RovM負(fù)調(diào)控hmsHFRS操縱子，在營(yíng)養(yǎng)有限的條件下抑制β-GlcNAc的產(chǎn)生和生物被膜的形成[47]。在格登鏈球菌中，一種精氨酸依賴的調(diào)節(jié)因子ArcR通過(guò)調(diào)節(jié)精氨酸的生物合成或分解代謝所需的基因來(lái)正向控制生物被膜的形成[48]。近年來(lái)，也有報(bào)道稱環(huán)-二-鳥苷酸(c-di-GMP)參與了控制細(xì)菌生物被膜的形成[49,50]。例如，高c-di-GMP濃度有利于綠膿桿菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌等幾種細(xì)菌的生物被膜的形成[51]。此外，細(xì)菌中的群體感應(yīng)系統(tǒng)通過(guò)感應(yīng)環(huán)境中的化學(xué)信號(hào)分子來(lái)調(diào)節(jié)生物被膜的生長(zhǎng)[52]。雖然糖是生物被膜的一種成分[53]，但在分枝桿菌中，糖代謝和生物被膜形成之間的聯(lián)系仍然不清楚。更有趣的是，除了類核相關(guān)蛋白Lsr2外，目前還沒(méi)有報(bào)道其他的轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)分枝桿菌生物被膜的形成[54,55]。

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了分枝桿菌生物被膜相關(guān)的數(shù)據(jù)集GSE70718、GSE165352，利用R語(yǔ)言分析基因表達(dá)差異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌生物被膜中下調(diào)明顯的幾個(gè)基因都與烴類的氧化還原有關(guān)，上調(diào)顯著的幾個(gè)基因功能不清楚；而膿腫分枝桿菌生物被膜中差異明顯的幾個(gè)基因相關(guān)功能還不清楚(圖5，圖6)。相較于浮游培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌，在形成生物膜的結(jié)核分枝桿菌中、、、、等基因顯著下調(diào)；、、、等基因顯著上調(diào)。其中，功能未知，可能編碼脫氫酶/還原酶, 轉(zhuǎn)錄組分析鑒定的mRNA：在高溫下上調(diào)，饑餓24小時(shí)后上調(diào)[56]；參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，編碼ArsR抑制蛋白[57]；被認(rèn)為與脂肪酸代謝有關(guān)，AlkB催化從正辛烷和還原的紅霉素生成辛醇和氧化紅霉素，也羥基化脂肪酸在Ω位置，可能編碼可能的跨膜烷烴1-單加氧酶AlkB[58]。Rv2913水解特定的D-氨基酸,可能編碼D-氨基酸氨基水解酶(D-氨基酸水解酶)[57]；RubA參與烴類羥基化系統(tǒng)，該系統(tǒng)將電子從NADH轉(zhuǎn)移到紅素氧還蛋白(rubbredoxin)然后通過(guò)紅素氧還蛋白轉(zhuǎn)移到烷烴1-單加氧酶[59]；基因可能是參與了細(xì)菌在宿主內(nèi)的持久性[60]。()參與合成三?；视?，編碼三酰基甘油合成酶(二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶)，該酶脂代謝途徑重要的合成酶之一[61]。()可能在細(xì)胞壁合成中起作用，因?yàn)閘-丙氨酸是肽聚糖層的重要組成部分。編碼分泌型l-丙氨酸脫氫酶Ald (40 kDa抗原)(TB43)，該酶功能類別屬于中間代謝和呼吸[62]。參與細(xì)胞壁和細(xì)胞過(guò)程中硫酸鹽跨膜運(yùn)輸，負(fù)責(zé)底物跨膜的易位[63]。相較于浮游培養(yǎng)的膿腫分枝桿菌，在形成生物膜的膿腫分枝桿菌中等基因顯著下調(diào)，且功能均未知；等基因顯著上調(diào)，且功能均未知。

總之，生物被膜的形成是一個(gè)高度調(diào)控的過(guò)程，需要多種內(nèi)外因素的協(xié)同作用。通過(guò)進(jìn)一步理解這些調(diào)控因素的作用機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的相互關(guān)系，人們可以更好地探索生物被膜的形成和防治方法。

圖5 結(jié)核分枝桿菌生物被膜和游離細(xì)菌中基因表達(dá)差異分析

A：結(jié)核分枝桿菌生物被膜中基因表達(dá)差異火山圖。藍(lán)色點(diǎn)為下調(diào)表達(dá)的基因，紅色點(diǎn)為上調(diào)表達(dá)的基因，灰色點(diǎn)為無(wú)顯著變化的基因，= 0.01；、、、、等基因顯著下調(diào)；、、、等基因顯著上調(diào)。B：結(jié)核分枝桿菌生物被膜中基因表達(dá)差異熱圖。綠色為對(duì)照組(浮游培養(yǎng))，黃色為生物被膜。

圖6 膿腫分枝桿菌生物被膜和游離細(xì)菌中基因表達(dá)差異分析

A：膿腫分枝桿菌生物被膜中基因表達(dá)差異火山圖。藍(lán)色點(diǎn)為下調(diào)表達(dá)的基因，紅色點(diǎn)為上調(diào)表達(dá)的基因，灰色點(diǎn)為無(wú)顯著變化的基因，= 0.01；_1360c、_1358c、_1742、_、_2042c等基因顯著下調(diào)；_1067、_、_、、_等基因顯著上調(diào)。B：膿腫分枝桿菌生物被膜中基因表達(dá)差異熱圖。綠色為對(duì)照組(浮游培養(yǎng))，黃色為生物被膜。

5 分枝桿菌生物被膜與細(xì)菌耐藥性及防治措施

很多研究表明，分枝桿菌生物被膜對(duì)環(huán)境侵襲和消毒劑的抵抗力比浮游細(xì)菌更強(qiáng)。自從這個(gè)概念出現(xiàn)以來(lái)，生物被膜就被認(rèn)為是人類感染的一個(gè)特別重要的致病因素[64]。雖然急性感染主要由浮游細(xì)菌引起，但慢性疾病的發(fā)病機(jī)制與生物被膜的形成也密切相關(guān)。此外，導(dǎo)管或假體等生物材料在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的日益重要性也促進(jìn)了生物被膜及其調(diào)控機(jī)制在人類疾病中的重要性[65,66]。分枝桿菌作為一種常見(jiàn)的多重耐藥菌，其耐藥性主要與生物被膜有關(guān)。生物被膜能夠限制抗生素的進(jìn)入，從而減少抗生素的效果。生物被膜的形成是細(xì)菌耐藥的重要因素。它提供了許多細(xì)菌物種的保護(hù)，以對(duì)抗通常對(duì)浮游狀態(tài)下的相同細(xì)菌具有活性的抗生素[67～69]。這種抗性涉及不同的機(jī)制(滲透性、代謝狀態(tài)、抗性基因的激活、持留細(xì)胞)[70,71]。形成生物被膜的微生物對(duì)抗生素、消毒劑和殺菌劑的耐藥性可能導(dǎo)致治療失敗。臨床表明，必須從物理上根除生物被膜才能解決感染問(wèn)題[72]。已有研究發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌生物被膜在體外對(duì)消毒劑或抗生素，包括阿米卡星和克拉霉素具有耐藥性。例如，即使最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)表明膿腫分枝桿菌分離株對(duì)阿米卡星和克拉霉素敏感，這些藥物在被測(cè)試的最高濃度的生物被膜中也只有最低限度的活性[73,74]。Mu?oz-Egea等[75]發(fā)現(xiàn)，在4種快速生長(zhǎng)的分枝桿菌中，MIC和最低生物被膜根除濃度(mini-mum biofilm eradicate concentration，MBEC)之間的差異，在接觸環(huán)丙沙星的粘液分枝桿菌中不到100倍，在暴露于克拉霉素的膿腫分枝桿菌和周圍分枝桿菌中大于100,000倍；與克拉霉素或阿米卡星相比，環(huán)丙沙星是對(duì)這些生物被膜最有效的抗生素。在這些研究中，當(dāng)在生物被膜發(fā)育的早期階段添加抗生素時(shí)，對(duì)生物被膜的處理更有效，可能是因?yàn)榧?xì)胞的表型不完全適應(yīng)生物被膜的生長(zhǎng)。

此外，生物被膜還能夠降低細(xì)胞外酶的活性和生物被膜對(duì)不同抗菌劑的滲透性，從而減少抗生素的降解和代謝[76]。其他機(jī)制，包括抗藥性基因的激活，例如在許多種類的分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)的可誘導(dǎo)的甲基酶[77]已經(jīng)被推斷其存在，但仍未得到證實(shí)。針對(duì)生物被膜的防控也成為了當(dāng)前醫(yī)學(xué)上的研究熱點(diǎn)之一。防治生物被膜感染需要從多個(gè)方面入手，通過(guò)綜合采取多個(gè)手段，可以更有效地降低生物被膜的形成和感染的風(fēng)險(xiǎn)。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

肺結(jié)核病難治療，肺外結(jié)核病更難治療，結(jié)核分枝桿菌生物被膜可能是根本原因。需要更多的研究來(lái)分析結(jié)核分枝桿菌生物膜在肺外結(jié)核發(fā)病機(jī)制中的作用。

分枝桿菌生物被膜成為了一個(gè)臨床治療的特定領(lǐng)域，并呈現(xiàn)出了獨(dú)特的特征。分枝桿菌生物被膜在環(huán)境衛(wèi)生和臨床治療中的重要性毋庸置疑。在臨床上，對(duì)生物被膜的了解對(duì)于許多由分枝桿菌感染引起的疾病的正確治療至關(guān)重要，特別是與生物材料相關(guān)的疾病，因?yàn)樾纬缮锉荒な狗种U菌對(duì)常用的抗生素治療和其他治療手段產(chǎn)生了很強(qiáng)的耐藥性。目前在感染組織無(wú)法完全清除的情況下，需要用新的策略來(lái)對(duì)付分枝桿菌的這種“武裝形式”。在未來(lái)，生物被膜的研究仍將面臨多方面的挑戰(zhàn)。人們需要更全面認(rèn)識(shí)生物被膜結(jié)構(gòu)和組成，生物被膜調(diào)控機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其形成和解聚的規(guī)律，從而尋找更高效的生物被膜清除和防治策略，指導(dǎo)藥物釋放、組織修復(fù)、人工器官等。關(guān)于分枝桿菌生物被膜的研究為這一極其重要的挑戰(zhàn)提供了一個(gè)新的視角，對(duì)結(jié)核分枝桿菌生物被膜的進(jìn)一步研究可能會(huì)在未來(lái)幾年改變這一實(shí)體的治療策略。

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Regulation ofbiofilm development and novel measures against antibiotics resistance

Abulimiti Abudukadier1, Qi-ao Zhang1, Peibo Li2, Jianping Xie1,2

Currently, there are over 170 recognized species of, the only genus in the family. Organisms belonging to this genus are quite diverse with respect to their ability to cause disease in humans. Thegenus includes human pathogens (complex and) and environmental microorganisms known as non-tuberculosis mycobacteria (NTM). A common pathogenic factor ofis the formation of biofilms. Bacterial biofilms are usually defined as bacterial communities attached to the surface, and are also considered as shared spaces of encapsulated microbial cells, including various extracellular polymeric substrates (EPS), such as polysaccharides, proteins, amyloid proteins, lipids, and extracellular DNA (EDNA), as well as membrane vesicles and humic like microorganisms derived refractory substances. The assembly and dynamics of the matrix are mainly coordinated by second messengers, signaling molecules, or small RNAs. Fully deciphering how bacteria provide structure for the matrix, thereby promoting extracellular reactions and benefiting from them, remains a challenge for future biofilm research. This review introduces a five step development model for biofilms and a new model for biofilm formation, analyses the pathogenicity of biofilms, their interactions with bacteriophages and host immune cells, and the key genes and regulatory networks of mycobacterial biofilms, as well as mycobacterial biofilms and drug resistance, in order to provide a basis for clinical treatment of diseases caused by biofilms.

; biofilm; antibiotic resistance

2023-09-16;

2023-11-18;

2023-11-20

西南大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(編號(hào)：SWUB23040)資助[Supported by the Graduate Research Innovation Project of Southwest University (No. SWUB23040)

阿卜力米提·阿卜杜喀迪爾，博士研究生，研究方向：微生物與宿主及環(huán)境互作。E-mail: 1014420935@qq.com

謝建平，博士，研究員，研究方向：結(jié)核分枝桿菌等重要病原致病耐藥機(jī)理與新防控措施研發(fā)。E-mail: georgex@swu.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-205

(責(zé)任編委: 張?zhí)煊?