陳 浩，王曉林，鐘方麗，劉君宇，劉 波，孟 澳

（吉林化工學(xué)院，吉林吉林 132022）

黑果腺肋花楸Aronia melanocarpa屬薔薇科腺肋花楸屬灌木，又稱野櫻莓［1］，果實(shí)具有多種活性成分［2］，文中簡(jiǎn)稱黑果.2018年國(guó)家衛(wèi)健委將黑果列為新食品原料［3］.黑果具抗氧化、控制血糖、改善血脂、抗炎、抗腫瘤等功效［4-5］.刺玫果Rosa davuricaPAII.系薔薇科薔薇屬植物山刺玫的成熟果實(shí)［6］，富含黃酮、多糖、鞣質(zhì)等成分，具有抗衰老、抗疲勞、保護(hù)心血管等藥理作用［7］，并且毒副作用小.黑果和刺玫果在食品、藥品和保健品領(lǐng)域皆被廣泛研究與應(yīng)用.

顆粒劑指原料藥物與適宜的輔料混合制成具有一定粒度的干燥顆粒狀制劑［8］.為確保黑果腺肋花楸果制劑穩(wěn)定性好、運(yùn)輸、攜帶和貯藏方便［9］，我們對(duì)其顆粒劑進(jìn)行了研究.黑果顆粒劑是以黑果為單一原料，與適宜的添加劑制成的顆粒狀功能性食品，而雙果顆粒劑是將黑果與刺玫果兩種原料合用，與適宜的添加劑制成的一種全新的顆粒狀功能性食品.

本實(shí)驗(yàn)組在前期工作的基礎(chǔ)上，建立了制劑中總黃酮、原花青素、花色苷和多糖的含量測(cè)定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，以制定該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).另外對(duì)其體外清除亞硝酸鹽能力，抑制脲酶、α-葡萄糖苷酶和抑制胰脂肪酶的活性進(jìn)行考察，為黑果腺肋花楸果制劑在食品方面的研究及開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用材料黑果購(gòu)自吉林省黑果花楸科技有限公司，刺玫果購(gòu)自安徽亳州醫(yī)藥總公司.

實(shí)驗(yàn)所用試劑有原花青素、蘆丁、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（成都曼思特生物科技有限公司），尿素酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶、對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽（p-Nitrophenyl phosphate，p-NPP）（生化級(jí)，上海寶曼生物科技有限公司），4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrobenzophenone-α-D-glucopyr anoside，PNPG）（生化級(jí)，北京夢(mèng)怡美生物科技有限公司），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

實(shí)驗(yàn)儀器主要有H1850型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司），TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、TU-1950 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）和PL-9602型酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）等.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 有效成分的質(zhì)量測(cè)定

2.1.1總黃酮的質(zhì)量測(cè)定

采用硝酸鋁比色法［10］繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程y=0.013 72x-0.025 93（R2=0.999 2）.測(cè)定樣品溶液的吸光度值并計(jì)算質(zhì)量濃度，按式（1）計(jì)算總黃酮的質(zhì)量.

式中：X1為樣品中總黃酮的質(zhì)量，mg；C1為樣液中總黃酮質(zhì)量濃度，μg/mL；V1為樣液體積，mL；N1為稀釋倍數(shù)；10-3為將μg換算成mg.

2.1.2原花青素的質(zhì)量測(cè)定

采用鐵鹽催化比色法［11］繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程y=2.020 95x-0.013 46（R2=0.999 3）.測(cè)定樣品溶液的吸光度值并計(jì)算質(zhì)量濃度，按式（2）計(jì)算原花青素的質(zhì)量.

式中：X2為樣品中原花青素的質(zhì)量，mg；C2為樣液中原花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；V2為樣液體積，mL；N2為稀釋倍數(shù).

2.1.3花色苷的質(zhì)量測(cè)定

采用亞硫酸鈉漂白法［12］繪制矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程y=0.032 23x+0.002 86（R2=0.999 5）.測(cè)定樣品溶液的吸光度值并計(jì)算質(zhì)量濃度，按式（3）計(jì)算花色苷的質(zhì)量.

式中：X3為樣品中花色苷的質(zhì)量，mg；C3為樣液中花色苷質(zhì)量濃度，μg/mL；V3為樣液體積，mL；N3為稀釋倍數(shù)；10-3為將μg換算成mg.

2.1.4多糖的質(zhì)量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法［13］繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=12.769 54x-0.038 86（R2=0.999 4）.測(cè)定樣品溶液的吸光度值并計(jì)算質(zhì)量濃度，按式（4）計(jì)算多糖的質(zhì)量.

式中：X4為樣品中多糖的質(zhì)量，mg；C4為樣液中多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V4為樣液體積，mL；N4為稀釋倍數(shù).

2.2 黑果顆粒劑和雙果顆粒劑的制備

2.2.1黑果顆粒劑的制備

根據(jù)參考文獻(xiàn)［14］，將干燥后的黑果浸膏研磨成粉末，加入適量的乳糖、可溶性淀粉和蔗糖混合、制粒、干燥、整粒，制得3批黑果顆粒劑，備用.

2.2.2雙果顆粒劑的制備

根據(jù)參考文獻(xiàn)［15］，將干燥后的雙果浸膏研磨成粉末，加入適量的羧甲纖維素鈉、甘露醇混合、制粒、干燥、整粒，制得3批雙果顆粒劑，備用.

2.3 樣品有效成分的含量測(cè)定

各取兩種顆粒劑研磨為細(xì)粉后，分別稱取樣品1.0 g于容量瓶中，加入適量甲醇（或水），超聲使其溶解，加入相應(yīng)溶劑至刻度，離心，將上清液作為樣品溶液，測(cè)定，分別計(jì)算兩種顆粒劑中總黃酮、原花青素、花色苷和多糖的含量.

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

顯色前穩(wěn)定性：取樣品溶液適量，分別于配制后0、30、60、120、180、240、300、360 min 進(jìn)行測(cè)定，同“2.1”方法測(cè)定不同有效成分吸光度并計(jì)算RSD.

顯色后穩(wěn)定性：取樣品溶液適量，分別同“2.1”方法顯色后0、10、20、30、40、50、60 min 進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定不同有效成分吸光度并計(jì)算RSD.

2.4.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取樣品溶液適量，同“2.1”方法后測(cè)定不同有效成分，連續(xù)6 次，記錄吸光度并計(jì)算RSD.

2.4.3精密度實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取樣品溶液適量6 份，同“2.1”方法后經(jīng)2 人在不同儀器上分別測(cè)定不同有效成分吸光度，記錄吸光度并計(jì)算RSD.

2.4.4加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱取已知含量的樣品6 份，每份樣品中加入相應(yīng)的對(duì)照品適量，同“2.3”操作，制備6 份樣品溶液，按照“2.1”方法測(cè)定不同有效成分的吸光度，計(jì)算總黃酮、原花青素、花色苷和多糖的平均回收率及RSD.

2.5 黑果顆粒劑和雙果顆粒劑的含量測(cè)定

取3批黑果顆粒劑和雙果顆粒劑，同“2.3”操作，測(cè)定不同有效成分吸光度，計(jì)算總黃酮、原花青素、花色苷和多糖的含量平均值.

3 制劑的體外活性研究

3.1 清除亞硝酸鹽能力的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)［16］的方法，略加改動(dòng)，分別吸取不同質(zhì)量濃度樣品溶液1 mL 進(jìn)行試驗(yàn)，分別在538 nm處測(cè)定A0、Ai、Aj.按式（5）計(jì)算樣品對(duì)亞硝酸鹽清除率.

式中：A0為未加樣品溶液吸光度值，Ai為加入樣品吸光度值，Aj為對(duì)照吸光度值.

3.2 脲酶活性抑制率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)［17］的方法，略加改動(dòng)，分別每個(gè)孔加入25μL脲酶溶液，再加入25μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液或加入25μL磷酸緩沖溶液.分別在630 nm處測(cè)定A樣品、A空白、A對(duì)照.按式（6）計(jì)算樣品對(duì)脲酶活性抑制率.

式中：A樣品為加入樣品溶液吸光度值，A空白為不加樣品和尿素溶液吸光度值，A對(duì)照為不加樣品溶液吸光度值.

3.3 α-葡萄糖苷酶活性抑制率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)［18］的方法，略加改動(dòng)，按各反應(yīng)液組成進(jìn)行試驗(yàn)，分別在405 nm測(cè)定A樣品、A背景和A空白.按式（7）計(jì)算樣品α-葡萄糖苷酶活性抑制率.

式中：A空白為不加待測(cè)樣品的吸光度，A樣品為加入樣品溶液的吸光度，A背景為酶溶液用緩沖溶液代替的吸光度，保持其他條件不變.

3.4 胰脂肪酶活性抑制率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)［19］的方法，略加改動(dòng)，在微孔板中每個(gè)孔加入20μL 磷酸鹽緩沖液（pH6.8）或20μL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液進(jìn)行試驗(yàn)，分別在405 nm 測(cè)定Ai1、A1、Ai0和A0.按式（8）計(jì)算樣品胰脂肪酶抑制率.

式中：Ai1為加樣品溶液實(shí)驗(yàn)組吸光度值，A1為不加胰脂肪酶溶液實(shí)驗(yàn)空白組吸光度值，Ai0為不加樣品溶液對(duì)照組吸光度值，A0為不加樣品溶液和胰脂肪酶溶液空白組吸光度值.

4 結(jié)果與分析

4.1 方法學(xué)驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1.1樣品有效成分含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷和多糖的含量分別為7.29、14.11、1.65、486.92 mg/g和12.34、3.46、0.81、706.11 mg/g.

4.1.2穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表1、表2所示，數(shù)據(jù)得出黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷、多糖均在顯色前360 min 內(nèi)和顯色后60 min 內(nèi)有良好的穩(wěn)定性，且RSD＜3.0%，可滿足含量測(cè)定的要求.

表1 顯色前穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 顯色后穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1.3重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表3所示，黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷、多糖的吸光度值RSD≤1.0%，說(shuō)明此測(cè)定方法重復(fù)性好.

表3 重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1.4精密度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表4所示，黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷、多糖吸光度值RSD＜2.0%，表明此測(cè)定方法精密度良好，可以滿足含量測(cè)定要求.

表4 精密度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1.5加樣回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表5所示，黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷、多糖的加樣回收率分別為98.63%～102.50%和98.27%～103.00%，且RSD＜2.0%，表明此測(cè)定方法加樣回收率良好.

表5 黑果顆粒劑加樣回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 雙果顆粒劑加樣回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1.6黑果顆粒劑和雙果顆粒劑含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表7 所示，3 批黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷、多糖的含量平均值分別為7.27、14.10、1.56、473.95 mg/g和12.35、3.44、0.80、700.12 mg/g.

表7 黑果顆粒劑和雙果顆粒劑含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.2 體外活性研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.2.1清除亞硝酸鹽能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

黑果顆粒劑線性方程為y=11.676 3x+34.020 3（R2=0.992 4）.雙果顆粒劑線性方程為y=10.973 8x+30.434 5（R2=0.968 2）.Vc對(duì)照線性方程為y=13.614 6x+34.299 6（R2=0.985 8）.根據(jù)上述線性方程可知，黑果顆粒劑、雙果顆粒劑、Vc的IC50值為1.37、1.78、1.15 mg/mL.樣品對(duì)亞硝酸鹽均具有一定清除能力，在一定的條件下，其能力大小為Vc＞黑果顆粒劑＞雙果顆粒劑.

4.2.2脲酶活性抑制率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

黑果顆粒劑線性方程為y=13.731 5x+31.904 5（R2=0.992 1）.雙果顆粒劑線性方程為y=16.455 8x+20.114 6（R2=0.988 7）.根據(jù)上述線性方程可知，黑果顆粒劑和雙果顆粒劑的IC50值為1.32 mg/mL和1.82 mg/mL.樣品對(duì)脲酶活性均具有一定抑制能力，在一定的條件下，其能力大小為黑果顆粒劑＞雙果顆粒劑.

4.2.3α-葡萄糖苷酶活性抑制率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

黑果顆粒劑線性方程為y=12.494 0x+31.843 4（R2=0.981 6）.雙果顆粒劑線性方程為y=11.888 1x+32.817 7（R2=0.985 6）.阿卡波糖線性方程為y=15.193 8x+33.706 1（R2=0.981 2）.根據(jù)上述線性方程可知，黑果顆粒劑、雙果顆粒劑、阿卡波糖的IC50值為1.45、1.44、1.07 mg/mL.樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶活性均具有一定抑制能力，在一定的條件下，其能力大小為阿卡波糖＞雙果顆粒劑＞黑果顆粒劑.

4.2.4胰脂肪酶活性抑制率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

黑果顆粒劑線性方程為y=15.809 6x+25.582 7（R2=0.978 5）.雙果顆粒劑線性方程為y=15.466 7x+19.011 2（R2=0.968 4）.根據(jù)上述線性方程可知，黑果顆粒劑、雙果顆粒劑的IC50值為1.54 mg/mL 和2.00 mg/mL.樣品對(duì)胰脂肪酶活性均具有一定抑制能力，在一定的條件下，其能力大小為黑果顆粒劑＞雙果顆粒劑.

5 結(jié)論

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出，黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷、多糖均在顯色前360 min 內(nèi)和顯色后60 min 內(nèi)有良好的穩(wěn)定性，重復(fù)性RSD≤1.0%，精密度RSD＜2.0%，加樣回收率分別為98.63%～102.50%和98.27%～103.00%，且RSD＜2.0%，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證可以滿足制劑中含量測(cè)定要求.3 批黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷、多糖的含量平均值分別為7.27、14.10、1.56、473.95 mg/g和12.35、3.44、0.80、700.12 mg/g.

根據(jù)體外活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，兩種顆粒劑均具有清除亞硝酸鹽的能力、抑制脲酶活性、α-葡萄糖苷酶活性、胰脂肪酶活性的能力，預(yù)示著黑果制劑可能具有抗腫瘤活性、降低尿酸的活性、降低血糖的活性、抑制甘油三酯吸收的活性.本文建立的兩種顆粒劑中4 類有效成分總黃酮、原花青素、花色苷和多糖的含量測(cè)定方法，可為黑果腺肋花楸制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)，為黑果制劑后續(xù)的上市開(kāi)發(fā)提供依據(jù).