郝思怡，朱群英

（陜西省藥品和疫苗檢查中心, 陜西 西安 710075）

0 引 言

雜質(zhì)是除了藥物中的活性成分以外的化學(xué)成分，其對(duì)藥物的療效與穩(wěn)定性具有不良影響，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生毒副作用，從而影響藥物的臨床安全性。由于雜質(zhì)的鑒定閾值比較低，傳統(tǒng)的分離方法如溶劑萃取等只能用于溶液的預(yù)分離，目前比較常用的雜質(zhì)分離技術(shù)為色譜分離法[1-2]。常見的色譜分離技術(shù)包括柱色譜、循環(huán)色譜、薄層色譜等方法。其中薄層色譜法(Thin Layer Chromatography,TLC)是將固定相均勻涂抹在玻璃板上(或其他支物上，如塑料片或鋁制薄板)成膜，然后用適當(dāng)?shù)狞c(diǎn)樣器將樣品點(diǎn)加在薄層的起始線上，待溶劑揮發(fā)后，置入展開槽中，用一定的溶劑展開，當(dāng)展開到適當(dāng)距離時(shí)取出，晾干，顯色后定性、定量。

柱色譜包括高壓、中壓以及常壓制備柱色譜，制備柱色譜是目前應(yīng)用最為廣泛的分離技術(shù)，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且具有很強(qiáng)的靈活性。但該方法要求各組分間必須存在較大的分離度，否則會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)率不高等情況發(fā)生。此外該方法還存在非線性的吸附現(xiàn)象從而導(dǎo)致產(chǎn)品被過度稀釋[3]。模擬移動(dòng)床（Simulated Moving Bed，SMB）技術(shù)主要通過改變樣品進(jìn)出的方式實(shí)現(xiàn)固液兩相“模擬”逆流，實(shí)際上是實(shí)施色譜分離的高度工程化過程。相比于柱色譜技術(shù)，SMB 的處理規(guī)模大、分離效率高，但其工藝較為復(fù)雜且成本較高[4]。因此，綜合考慮制備工藝、設(shè)備成本以及分離效率，研究在雙柱循環(huán)色譜的基礎(chǔ)上引入了溶劑梯度，并將其應(yīng)用于微量雜質(zhì)的提取制備中，期望此方式能為雜質(zhì)分離提取提供新思路。

1 溶劑梯度雙柱循環(huán)色譜的雜質(zhì)分離與制備

1.1 溶劑梯度雙柱循環(huán)色譜的雜質(zhì)分離

常見的色譜分離技術(shù)中的TLC 具有能同時(shí)分離多種樣品、固定相和流動(dòng)相的選擇與變換靈活性大、可利用多種定性檢測(cè)技術(shù)(如物理和化學(xué)方法等)特點(diǎn)。但該方法操作量大且精度較低，因此應(yīng)用較少。單柱循環(huán)色譜主要是通過閥門切換技術(shù)使譜帶在單色譜柱內(nèi)進(jìn)行循環(huán)往復(fù)流動(dòng)，其能夠在不外加壓力的條件下延長(zhǎng)等效柱長(zhǎng)。但其易產(chǎn)生展寬現(xiàn)象，從而導(dǎo)致分離失敗，故研究對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)并應(yīng)用于雜質(zhì)分離中，改進(jìn)后的單柱型閥切換循環(huán)色譜改變了原溶質(zhì)譜帶的經(jīng)過路徑，其不再流入貯存池而是直接流入溶劑泵。該技術(shù)減小了柱外死體積，在一定程度上提升了分離效率。此外，零死體積循環(huán)色譜技術(shù)通過使用二位4 通閥形成了閉合回路，并在循環(huán)回路外設(shè)置了溶劑泵，該方法能夠有效避免由柱外死體積所造成的譜帶展寬現(xiàn)象，但目前該技術(shù)尚未應(yīng)用到色譜的制備中[5-6]。交替泵雙柱循環(huán)色譜主要通過二位6 通閥來進(jìn)行色譜柱的位置切換，且每個(gè)色譜柱的出口處都安裝了檢測(cè)器以對(duì)溶液譜帶的洗脫情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 交替泵雙柱循環(huán)色譜Fig. 1 The alternating pump dual column cyclic chromatography

由圖1 所示，當(dāng)檢測(cè)器1 監(jiān)測(cè)信號(hào)值上升，且檢測(cè)器2 監(jiān)測(cè)到信號(hào)值降低時(shí)，二位6 通閥將進(jìn)行閥門的切換使譜帶流入色譜柱2 中。該色譜能夠在不使用泵的情況下使譜帶在兩個(gè)色譜柱間循環(huán)流動(dòng)，且能夠避免由泵腔死體積引起的譜帶擴(kuò)展情況發(fā)生，但其存在容納譜帶寬度不夠長(zhǎng)的問題[7]。因此，研究基于此引入了捕集系統(tǒng)，并在循環(huán)系統(tǒng)中設(shè)置了捕集柱，由此形成了帶捕集系統(tǒng)的雙柱型循環(huán)制備液相色譜。該系統(tǒng)主要將純水注入捕集柱中以增加流動(dòng)相的含水率，從而使溶液富集在捕集柱中，具體的裝置結(jié)構(gòu)如圖2 所示。

圖2 帶捕集柱的雙柱型循環(huán)色譜Fig. 2 The dual column cyclic chromatography with capture column

帶捕集柱的雙柱型循環(huán)色譜處理起到富集作用，還可以在六通閥與十通閥之間進(jìn)行耦合切換。但該系統(tǒng)要求流動(dòng)相的含水率不能過高，否則可能會(huì)導(dǎo)致固定相的塌陷以及流失，從而造成捕集能力下降。此外，通過改進(jìn)雙柱型循環(huán)結(jié)構(gòu)基本能夠避免柱外死體積的情況發(fā)生，但在實(shí)際的雜質(zhì)提取過程中，仍然存在渦流擴(kuò)散、傳質(zhì)阻力以及譜帶展寬等不良現(xiàn)象。其中，譜帶展寬主要是由非線性吸附和一些非理想因素造成的，其為雜質(zhì)的分離過程帶來了嚴(yán)重的負(fù)面影響。譜帶展寬會(huì)對(duì)合格的流份進(jìn)行稀釋從而導(dǎo)致其濃度降低，且容易引起分解變質(zhì)。而譜帶壓縮機(jī)制能夠使譜帶前沿的遷移速度低于譜帶后沿，形成溶劑梯度，進(jìn)而起到對(duì)譜帶的壓縮作用[8-9]。因此，研究進(jìn)一步引入了溶劑梯度，并將其應(yīng)用到雙柱循環(huán)色譜之中。該技術(shù)主要通過在雙柱之間不斷注入一種弱溶劑，從而在上下游的流動(dòng)相間形成了洗脫強(qiáng)度差，使得處于上游柱中的譜帶后沿速度加快。這種方式很大程度地提升了循環(huán)色譜的分離性能，且有利于產(chǎn)品濃度的增加以及產(chǎn)量的提高，提高產(chǎn)率并增大產(chǎn)品濃度，與傳統(tǒng)的雙柱型色譜相比具有顯著優(yōu)勢(shì)。因此研究將該技術(shù)運(yùn)用到微量雜質(zhì)的分離制備中，以解決雜質(zhì)分離效率過低等問題。

1.2 基于溶劑梯度的雙柱循環(huán)色譜實(shí)驗(yàn)

研究將引入了溶劑梯度的雙柱循環(huán)色譜應(yīng)用到實(shí)際的關(guān)鍵前雜分離中，并設(shè)計(jì)了相應(yīng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)選用的材料為奧利司他原料、乙腈、甲醇以及純凈水。實(shí)驗(yàn)采用反相色譜對(duì)奧利司他進(jìn)行分離制備，并選取甲醇與水的混合溶液作為流動(dòng)相、C8 柱作為固定相。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)選用的裝置為溶劑梯度雙柱循環(huán)色譜裝置，該裝置的組成部分包括2 根色譜柱、1 個(gè)二位10 通閥、1 個(gè)檢測(cè)器和3 個(gè)高壓恒流泵，其具體裝置如圖3 所示。

圖3 溶劑梯度循環(huán)色譜裝置Fig. 3 The solvent gradient cyclic chromatography device

目標(biāo)雜質(zhì)的體積主要由洗脫劑中的水含量決定，通過增大循環(huán)色譜的下游水含量可以使譜帶收縮。但由于增加洗脫劑中的水含量可能會(huì)導(dǎo)致溶劑消耗增大、分離時(shí)間過長(zhǎng)等問題，因此實(shí)驗(yàn)將甲醇與水的比例設(shè)為了87/13 至89/11 之間。要實(shí)現(xiàn)目標(biāo)雜質(zhì)的分離與純化，必須保證雜質(zhì)譜帶處于循環(huán)色譜系統(tǒng)的整個(gè)循環(huán)周期內(nèi)，其中，譜帶的前沿不能流出下游色譜柱，而后沿必須從上游色譜柱被洗脫出來，具體表示如式（1）所示。

式（1）中，F(xiàn)1代表上游的洗脫劑流量，F(xiàn)2指的是下游流量，VR，up、VR，down分別表示上下游流動(dòng)相組成下的關(guān)鍵雜質(zhì)的保留體積，△t 代表循環(huán)周期。其中，上游流量不能過高，否則會(huì)對(duì)檢測(cè)器造成破壞，因此其流量設(shè)為3 mL/min，下游流量過大也會(huì)對(duì)譜帶的壓縮作用造成抵消，因此實(shí)驗(yàn)將其設(shè)為了3.08 mL/min，同時(shí)，修飾劑流量設(shè)為了0.08mL/min。奧利司他的關(guān)鍵前雜分離實(shí)驗(yàn)一共分為了三個(gè)階段，分別是進(jìn)料階段、循環(huán)階段以及回收階段。其中進(jìn)料階段是指在色譜裝置處于位置A 狀態(tài)時(shí)將原料全部注入到色譜柱1 中。在循環(huán)階段中，先添加洗脫液，再在設(shè)備中添加弱溶劑，使其成為改性劑。這時(shí)，前雜波段將由1 號(hào)柱子移入2 號(hào)柱子，閥將轉(zhuǎn)換到B 位。在此過程中，奧利司他的波段向下游移動(dòng)，并向外排出，此時(shí)，目的波段由第2 色譜柱向第1 色譜柱傳遞，形成一個(gè)循環(huán)。在此基礎(chǔ)上，通過多個(gè)開關(guān)，可以將非靶標(biāo)雜質(zhì)排出體系，并將靶標(biāo)雜質(zhì)與整個(gè)能譜的前線分離?；厥针A段中，一般是在前雜與目標(biāo)組分分離到一定程度時(shí)，對(duì)目標(biāo)譜帶的前沿和后沿進(jìn)行切割處理，并收集中間純度最高的部分作為最終產(chǎn)品。

溶劑梯度循環(huán)色譜分離技術(shù)需要對(duì)溶劑梯度、循環(huán)周期、洗脫劑含水率以及循環(huán)次數(shù)進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)選取關(guān)鍵雜質(zhì)的純度、產(chǎn)率以及收率幾個(gè)指標(biāo)來對(duì)分離效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。收率計(jì)算表示如式（2）所示。

式（2）中，VProduct、VFeed分別代表產(chǎn)品以及原料的體積，AProduct、AFeed分別表示關(guān)鍵雜質(zhì)在產(chǎn)品與原料中的峰面積。產(chǎn)率的計(jì)算如式（3）所示。

式（3）中，CFeed代表關(guān)鍵雜質(zhì)在原料中的濃度，T表示運(yùn)行時(shí)間，其中包括了進(jìn)料、循環(huán)以及回收階段所消耗的時(shí)間。為了直觀看出濃度譜帶的收縮程度，還需要計(jì)算相對(duì)濃度，其計(jì)算如式（4）所示。

2 溶劑梯度循環(huán)色譜在雜質(zhì)分離中的應(yīng)用分析

研究為驗(yàn)證溶劑梯度循環(huán)色譜分離技術(shù)的有效性，分別采用不同的洗脫劑含水率、溶劑梯度、循環(huán)周期，以及循環(huán)次數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比，實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果如表1 所示。

表1 溶劑梯度循環(huán)色譜分離技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果Table 1 The experimental conditions and results of solvent gradient cyclic chromatography separation technology

由表1 可得，洗脫劑含水率分別為11%、12%、13%，原料進(jìn)料體積分別為52.9mL、62.4mL、73.3mL，循環(huán)周期時(shí)長(zhǎng)分別為18.5min、21.5min、24.5min，溶劑梯度均為1.0%。不同洗脫劑含水量情況下的純度、收率與產(chǎn)率結(jié)果如圖4 所示。由圖4可知，洗脫劑含水率越高，產(chǎn)品的純度、收率以及產(chǎn)率均隨之提升。相比于11%的洗脫劑含水率，13%的洗脫劑含水率的純度、收率及產(chǎn)率分別提升了15.2%、7%、5.2%。說明洗脫劑含水量的增加有利于關(guān)鍵雜質(zhì)與奧利司他的分離。同時(shí)可以看出，產(chǎn)率與收率隨水含量增加的趨勢(shì)逐漸變緩，說明循環(huán)周期對(duì)其影響逐步增加，倘若繼續(xù)增加含水量可能造成產(chǎn)率與收率降低且會(huì)增加溶劑消耗，因此研究選用的洗脫劑含水率為13%。此外，從三次實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵雜質(zhì)相對(duì)濃度的數(shù)據(jù)來看，可以說明溶劑梯度能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)關(guān)鍵雜質(zhì)的分離以及富集。

圖4 不同洗脫劑含水量的純度、收率與產(chǎn)率Fig. 4 The purity, yield, and productivity of different eluents with different water contents

實(shí)驗(yàn)3~實(shí)驗(yàn)5 主要考察了溶劑梯度對(duì)分離過程的影響，其中，實(shí)驗(yàn)設(shè)置的洗脫劑均為13%，原料體積為73.3mL，循環(huán)次數(shù)均為8 次，循環(huán)周期均為24.5min，溶劑梯度依次為1.0%、2.0%、1.5%。同時(shí)需要保證在修飾劑流量不變的條件下改變修飾劑的含水量以調(diào)整溶劑梯度大小。由表1 可知，目標(biāo)組分的相對(duì)濃度溶劑隨著溶度梯度的增大而增加，說明譜帶受到的壓縮力隨著梯度的增加而有所提升。溶劑梯度對(duì)產(chǎn)品純度、收率以及產(chǎn)率的影響效果如圖5 所示。由圖5 可知，產(chǎn)品的純度在溶劑梯度為1.5%時(shí)達(dá)到最高，其值為52.3%。因此研究選用的溶劑梯度為1.5%。

圖5 不同溶劑梯度的純度、收率與產(chǎn)率Fig. 5 The purity, yield, and productivity of different solvent gradients

實(shí)驗(yàn)5~實(shí)驗(yàn)7 主要考察了循環(huán)周期對(duì)分離效果的影響，其中，實(shí)驗(yàn)設(shè)置的洗脫劑含水量均為13%，溶劑梯度均為1.5%，循環(huán)次數(shù)均設(shè)為了8 次，循環(huán)周期分別設(shè)為了24.5min、26.5min、28.5min。循環(huán)周期時(shí)長(zhǎng)對(duì)產(chǎn)品純度、收率以及產(chǎn)率的影響效果如圖6 所示。由圖6 可知，產(chǎn)品的純度以及收率隨著循環(huán)周期的加長(zhǎng)而增大，其中循環(huán)周期為28.5min 的產(chǎn)品純度為72.5%，相比于24.5min 的循環(huán)周期增長(zhǎng)了20.4%。同時(shí)，循環(huán)周期為28.5min 的產(chǎn)品收率高達(dá)90.1%，說明隨著循環(huán)周期時(shí)長(zhǎng)的增加，奧利司他與關(guān)鍵雜質(zhì)的分離效果也隨之提升。但產(chǎn)率波動(dòng)不大，主要原因在于其受到循環(huán)周期與收率的限制。此外，循環(huán)周期不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)組分流出下游的色譜柱，因此研究選用28.5min 作為循環(huán)周期。

圖6 不同循環(huán)周期下的純度、收率與產(chǎn)率Fig. 6 The purity, yield, and productivity under different cycle cycles

實(shí)驗(yàn)7~實(shí)驗(yàn)9 主要考察循環(huán)次數(shù)對(duì)分離過程的影響，其中，實(shí)驗(yàn)設(shè)置的洗脫劑含水量均為13%，溶劑梯度均為1.5%，循環(huán)周期時(shí)長(zhǎng)為28.5min，循環(huán)次數(shù)依次為8 次、10 次以及12 次。圖7 為循環(huán)次數(shù)對(duì)的純度、收率以及產(chǎn)率的影響結(jié)果。

圖7 不同循環(huán)次數(shù)下的純度、收率與產(chǎn)率Fig. 7 The purity, yield, and productivity under different cycles

通過圖7 可得，當(dāng)循環(huán)次數(shù)為8~10 次時(shí)，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，雜質(zhì)的純度和收率均隨著循環(huán)次數(shù)的增加而提升，但循環(huán)次數(shù)從10 次到12 次的增長(zhǎng)較為平緩。主要原因在于奧利司他以及關(guān)鍵前雜的總寬度會(huì)隨著循環(huán)系數(shù)的增加而增大，而譜帶壓縮機(jī)制會(huì)抑制總譜帶的展寬。因此當(dāng)循環(huán)次數(shù)繼續(xù)增加到12 次時(shí)，譜帶的壓縮與總譜帶的展寬會(huì)趨于動(dòng)態(tài)平衡，因此，研究選擇10 次作為最終的循環(huán)次數(shù)。

3 結(jié) 論

藥物微量雜質(zhì)的分離提取對(duì)藥物的安全性具有重要影響作用。研究將溶劑梯度與雙柱循環(huán)色譜技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計(jì)出了一種藥物雜質(zhì)分離新方法。結(jié)果表明，在探究循環(huán)周期對(duì)分離效果的影響實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)品的純度以及收率隨著循環(huán)周期的加長(zhǎng)而增大，其中循環(huán)周期為28.5min 的產(chǎn)品純度為72.5%，相比于24.5min 的循環(huán)周期增長(zhǎng)了20.4%。在探究洗脫劑含水率對(duì)分離效果的影響實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)品的純度、收率以及產(chǎn)率隨洗脫劑含水率的提升而增加。在考察洗脫劑含水率對(duì)分離過程的影響實(shí)驗(yàn)中，關(guān)鍵雜質(zhì)的純度和收率隨著循環(huán)次數(shù)的增加而提升。說明溶劑梯度雙柱循環(huán)色譜技術(shù)能夠有效解決雜質(zhì)分離效率過低、分離純度不高等問題。但研究對(duì)于溶劑梯度在雙柱循環(huán)色譜技術(shù)中的應(yīng)用只考慮到反相層面，因此有待進(jìn)一步改進(jìn)。