姚遠(yuǎn)，趙志如，宋嬈

（鄭州市金水區(qū)總醫(yī)院 婦科，河南 鄭州 450000 ）

宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）是一組與宮頸浸潤癌密切相關(guān)的癌前期病變的統(tǒng)稱，可分為CIN Ⅰ級(jí)、CIN Ⅱ級(jí)、CIN Ⅲ級(jí)，其中CIN Ⅰ級(jí)為低級(jí)別的癌前病變，癌變率低，絕大多數(shù)CIN Ⅰ級(jí)患者可自行恢復(fù)正常，少部分發(fā)展為CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)，而當(dāng)發(fā)展至CIN Ⅲ級(jí)時(shí)患者進(jìn)展為浸潤性宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)將增大12%，嚴(yán)重威脅患者的生命健康［1-2］。目前，外科手術(shù)是治療CIN Ⅲ級(jí)的重要方式，其中宮頸環(huán)形電切術(shù)（LEEP）因具有操作方便、創(chuàng)傷小等優(yōu)勢已廣泛應(yīng)用于治療該類患者［3］。然而不足的是，部分CIN Ⅲ級(jí)患者經(jīng)LEEP 治療后仍存在病變殘留、復(fù)發(fā)的情況，極易進(jìn)展為宮頸癌，影響患者預(yù)后。因此，臨床應(yīng)盡早識(shí)別和控制CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，以降低宮頸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，改善患者預(yù)后。女性陰道微環(huán)境中存在多種細(xì)菌定植，這些微生物菌群是維持陰道微生態(tài)平衡的關(guān)鍵［4］。因女性生理結(jié)構(gòu)特殊，宮頸上皮細(xì)胞直接暴露于陰道微環(huán)境中，容易受到病毒、細(xì)菌等多種病原體的侵襲，極易發(fā)生病變［5］。有研究顯示［6］，CIN 的發(fā)生與陰道微生物菌群變化有關(guān)。但關(guān)于CIN Ⅲ級(jí)患者陰道菌群改變及其與LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系研究較為少見。因此，本研究通過探討CIN Ⅲ級(jí)患者陰道菌群改變及其與LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，以期為臨床防控提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年3 月至2020 年8 月于鄭州市金水區(qū)總醫(yī)院行LEEP 治療的432 例CIN Ⅲ級(jí)患者為疾病組，年齡22～55 歲，平均（40.78±6.72）歲；體重指數(shù)（BMI）為19.41～28.04 kg/m2，平均（23.45±2.33）kg/m2；孕次0～3 次，平均（1.89±0.53）次；產(chǎn)次0～3 次，平均（1.58±0.32）次；首次性生活年齡18～29 歲，平均（23.26±3.38）歲。另選取同期體檢的健康女性420 例為對(duì)照組，年齡20～60 歲，平均（41.23±6.28）歲；BMI 為19.12～28.34 kg/m2，平均（23.32±2.15）kg/m2；孕次0～3 次，平均（1.93±0.41）次；產(chǎn)次0～3 次，平均（1.62±0.35）次；首次性生活年齡18～29歲，平均（23.55±3.12）歲。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。兩組年齡、BMI、孕次、產(chǎn)次、首次性生活年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①疾病組均經(jīng)細(xì)胞學(xué)及組織病理學(xué)確診為CIN，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)；②CIN 病理學(xué)分級(jí)均為Ⅲ級(jí)；③年齡≥18 歲；④疾病組均接受LEEP 治療；⑤近3 個(gè)月內(nèi)未使用過抗生素及陰道藥物；⑥月經(jīng)規(guī)律，1 周內(nèi)無性生活；⑦對(duì)照組經(jīng)體檢均身體健康；⑧受試者均知情同意，且術(shù)后隨訪方便。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并宮頸糜爛、陰道潰瘍、陰道炎、盆腔炎、尿道炎；②月經(jīng)期、妊娠期、哺乳期女性；③宮頸病變史者；④合并其他部位惡性腫瘤；⑤合并重要臟器功能不全、免疫系統(tǒng)疾病、造血系統(tǒng)疾病、凝血功能障礙；⑥既往接受子宮全切術(shù)治療者。

1.2 方法

1.2.1 陰道分泌物采集及菌群檢測 ①陰道分泌物采集：患者取截石位，使用窺器暴露患者陰道，采用兩支無菌棉簽輕拭陰道壁上1/3 段位置，將無菌棉簽旋轉(zhuǎn)4～5 周，檢查棉簽上是否附著分泌物，若棉簽上可見清晰的分泌物附著，則表示采集成功；②陰道菌群檢測：將其中一支棉簽分泌物制成玻片，常規(guī)革蘭氏染色后在顯微鏡下進(jìn)行觀察菌群密集度、菌群多樣性、霉菌、滴蟲、乳酸桿菌的檢出情況，另一支棉簽分泌物用于檢測Nugent 評(píng)分、pH 值、白細(xì)胞酯酶（LE）、過氧化氫（H2O2）、唾液酸苷酶（SNA）、β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）、乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）。其中菌群密集度以顯微鏡下細(xì)菌計(jì)數(shù)分級(jí)，Ⅰ級(jí)：細(xì)菌計(jì)數(shù)1～99 個(gè)；Ⅱ級(jí)：細(xì)菌計(jì)數(shù)100～999 個(gè)；Ⅲ級(jí)：細(xì)菌計(jì)數(shù)＞1 000 個(gè)；Ⅳ級(jí)：滿視野；Ⅰ、Ⅳ級(jí)為異常菌群密度構(gòu)成，Ⅱ、Ⅲ為正常菌群密度構(gòu)成。菌群多樣性以顯微鏡下細(xì)菌種類分級(jí)，Ⅰ級(jí)：細(xì)菌種類1～3 種；Ⅱ級(jí)：細(xì)菌種類4～6 種；Ⅲ級(jí)：細(xì)菌種類7～9 種；Ⅳ級(jí)：細(xì)菌種類＞10 種；Ⅰ、Ⅳ級(jí)為異常菌群多樣性構(gòu)成，Ⅱ、Ⅲ為正常菌群多樣性構(gòu)成。Nugent 評(píng)分［7］以半定量評(píng)估法對(duì)乳桿菌、加德納菌以及普雷沃菌、動(dòng)彎桿菌進(jìn)行評(píng)分，細(xì)菌性陰道病（BV）為＞7 分、BV 中介為4～6 分、正常為0～3 分。乳酸桿菌陽性：在顯微鏡下，5 個(gè)視野中乳酸桿菌的平均數(shù)量為＞5 個(gè)；pH 值正常范圍為3.8～4.5。

1.2.2 術(shù)前檢查及手術(shù)方法 患者均行陰道鏡活檢、經(jīng)液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（TCT），活檢組織送病理檢查，確診后行LEEP 治療。術(shù)前行高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）檢查，采用2 代雜交捕獲法，一次檢測13 種高危型HPV 亞型。采用待檢樣本的相對(duì)光單位（RLU）和標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照（PC）之比判斷HPV 陽性，其中RLU/PC≥500 為病毒高負(fù)荷狀態(tài)，RLU/PC＜500 為病毒低負(fù)荷狀態(tài)。CINⅢ級(jí)患者均于月經(jīng)結(jié)束后1 周行LEEP 治療。術(shù)前排空膀胱，患者取截石位，進(jìn)行常規(guī)消毒、鋪巾，使用窺器充分暴露宮頸，對(duì)陰道、宮頸進(jìn)行消毒后，在宮頸3、6、9、12 點(diǎn)方向局麻后將復(fù)方碘溶液涂至宮頸表面，明確病變區(qū)域，再根據(jù)病變大小對(duì)病灶進(jìn)行切除。將LEEP 刀調(diào)整至電切模式，混切50 W，電凝25 W，距碘不著色范圍3～5 mm外進(jìn)行環(huán)切，深度根據(jù)CIN 范圍約為5～20 mm，以1 cm 三角刀自宮頸9 點(diǎn)方向沿宮頸外口順時(shí)針旋轉(zhuǎn)360°，一次環(huán)切切除病灶，切除過程中盡量減少停頓，以確保切除標(biāo)本的完整性，術(shù)中創(chuàng)面若出現(xiàn)活動(dòng)性出血需采用球形電極凝固止血，并填塞含血凝酶紗布?jí)浩戎寡?4 h 后取出。

1.2.3 術(shù)后隨訪及分組 術(shù)后通過復(fù)查的形式對(duì)患者進(jìn)行兩年的隨訪，每半年進(jìn)行1 次復(fù)查，復(fù)查內(nèi)容包括陰道鏡、TCT 和HR-HPV 檢查。術(shù)后半年內(nèi)無CIN 病變存在為痊愈，術(shù)后1 年內(nèi)有CIN 病變存在為病變殘留，術(shù)后≥1 年后重新出現(xiàn)CIN 病變?yōu)閺?fù)發(fā)［8］。將LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的CIN Ⅲ級(jí)患者納入復(fù)發(fā)組，LEEP 術(shù)后未復(fù)發(fā)的CIN Ⅲ級(jí)患者納入未復(fù)發(fā)組。

1.3 資料收集

收集患者一般資料，包括年齡、BMI、孕次、產(chǎn)次、首次性生活年齡、吸煙、絕經(jīng)狀態(tài)、術(shù)前TCT 結(jié)果、術(shù)前HR-HPV 載量、是否累及腺體、手術(shù)切緣狀態(tài)、病變累及象限等。

1.4 觀察指標(biāo)

①疾病組術(shù)前與對(duì)照組陰道菌群指標(biāo)比較；②術(shù)后隨訪情況及復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組手術(shù)前及術(shù)后6 個(gè)月時(shí)陰道菌群改變比較；③復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組一般資料比較；④CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素分析，包括比值比（O^R）、95% 可信區(qū)間（95%CI）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)組間差異；計(jì)數(shù)資料用百分率（%）描述，以χ2檢驗(yàn)，若任一理論頻數(shù)＞1且＜5 需對(duì)檢驗(yàn)校正，等級(jí)分布資料采用秩和檢驗(yàn)組間差異；采用Logistic 多元回歸分析探討CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 疾病組術(shù)前與對(duì)照組陰道菌群指標(biāo)比較

疾病組術(shù)前菌群密集度異常、菌群多樣性異常、霉菌（+）、滴蟲（+）、Nugent 評(píng)分＞7 分、pH值＞4.6、LE（+）、H2O2（+）、SNA（+）、GUS（+）占比均高于對(duì)照組（P＜0.05），乳酸桿菌（+）占比低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組NAG（+）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 疾病組術(shù)前與對(duì)照組陰道菌群指標(biāo)比較 ［n(%)］

2.2 術(shù)后隨訪情況及復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組術(shù)前及術(shù)后6 個(gè)月時(shí)陰道菌群改變比較

LEEP 術(shù)后對(duì)432 例CIN Ⅲ級(jí)患者隨訪兩年，有41 例患者術(shù)后復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為9.49%。復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組術(shù)前、術(shù)后6 個(gè)月NAG（+）占比比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），術(shù)后6 個(gè)月菌群密集度異常、菌群多樣性異常、霉菌（+）、滴蟲（+）、Nugent 評(píng)分＞7 分、pH 值＞4.6、LE（+）、H2O2（+）、SNA（+）、GUS（+）占比均低于術(shù)前（P＜0.05），乳酸桿菌（+）占比均高于術(shù)前；術(shù)后6 個(gè)月復(fù)發(fā)組菌群密集度異常、菌群多樣性異常、Nugent 評(píng) 分＞7 分、pH 值＞4.6、LE（+）、SNA（+）、GUS（+）占比均高于未復(fù)發(fā)組（P＜0.05），乳酸桿菌（+）占比低于未復(fù)發(fā)組（P＜0.05）。見表2。

表2 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組術(shù)前及術(shù)后6 個(gè)月時(shí)陰道菌群改變比較 ［n(%)］

2.3 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組一般資料比較

復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組年齡、BMI、孕次、產(chǎn)次、首次性生活年齡、吸煙、術(shù)前TCT 結(jié)果、病變累及象限比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），復(fù)發(fā)組絕經(jīng)、術(shù)前HR-HPV 載量高負(fù)荷、累及腺體、手術(shù)切緣陽性占比均高于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組一般資料比較

2.4 CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素分析

經(jīng)Logistic 回歸分析可知，術(shù)后6 個(gè)月的菌群密集度異常、菌群多樣性異常、Nugent 評(píng)分＞7分、pH 值＞4.6、LE（+）、SNA（+）、GUS（+）、絕經(jīng)、術(shù)前HR-HPV 載量高負(fù)荷、累及腺體、手術(shù)切緣陽性均為影響CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），乳酸桿菌（+）為CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的保護(hù)因素（P＜0.05）。見表4。

表4 多因素Logistic 回歸分析

3 討論

宮頸癌在女性惡性腫瘤中最為多見，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且逐漸趨于年輕化，對(duì)女性生命健康造成嚴(yán)重威脅［9］。CIN 是宮頸癌的癌前病變之一，研究顯示［10］，CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)具有較高的癌變率，故需積極治療以降低風(fēng)險(xiǎn)。LEEP 是臨床治療CIN Ⅲ級(jí)的常用方法，能夠有效切除病灶，但部分患者仍存在術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，且復(fù)發(fā)病灶進(jìn)展至浸潤性癌的風(fēng)險(xiǎn)更高。本研究中CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)率為9.49%，與既往司馬琴［11］研究結(jié)果相近，均證實(shí)CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。因此，需積極探討CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)危險(xiǎn)因素，并及早采取有效的防治措施，以降低宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

本研究結(jié)果顯示，術(shù)前疾病組菌群密集度異常、菌群多樣性異常、霉菌（+）、滴蟲（+）、Nugent 評(píng)分＞7 分、pH 值＞4.6、LE（+）、H2O2（+）、SNA（+）、GUS（+）占比均高于對(duì)照組，乳酸桿菌（+）占比低于對(duì)照組，提示與健康女性相比，CIN Ⅲ級(jí)患者陰道菌群失衡，有害菌呈不同程度定植，優(yōu)勢菌減少。陰道生態(tài)系統(tǒng)由多種類、多數(shù)量的微生物構(gòu)成并形成與宿主、環(huán)境相互制約、相互協(xié)調(diào)的一種動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)維護(hù)陰道自凈及身體健康具有重要意義［12］。有研究顯示［13］，陰道內(nèi)致病菌數(shù)量增多、乳酸桿菌數(shù)量減少將會(huì)影響pH值及陰道清潔度的改變，從而擾亂陰道微生態(tài)平衡，破壞局部免疫細(xì)胞功能，由于女性生理結(jié)構(gòu)特殊，宮頸上皮細(xì)胞直接暴露于陰道微環(huán)境中，易發(fā)生病理改變，最終導(dǎo)致各種陰道疾病的發(fā)生。由此可見，陰道微生物菌群失調(diào)與女性生殖疾病密切相關(guān)。

本研究Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后6 個(gè)月的菌群密集度異常、菌群多樣性異常、Nugent 評(píng)分＞7 分、pH 值＞4.6、LE（+）、SNA（+）、GUS（+）均為影響CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，乳酸桿菌（+）為CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的保護(hù)因素。正常情況下，宮頸陰道菌群種類、數(shù)量繁多，以乳酸桿菌為優(yōu)勢菌，乳酸桿菌能夠通過分解引導(dǎo)上皮糖原產(chǎn)生乳酸維持酸性環(huán)境，從而維持正常菌群密集度及多樣性；此外乳酸還能夠分泌H2O2、細(xì)菌素等，不僅能夠直接殺滅細(xì)菌或病毒，還能夠激活免疫細(xì)胞，提高陰道局部免疫功能［14-15］。乳酸桿菌（+）占比少提示患者陰道微生態(tài)平衡被破壞，陰道菌群失調(diào)、清潔度異常，在堿性條件下陰道鱗狀上皮內(nèi)化生延長，產(chǎn)生丙酸、丁酸等有害物質(zhì)損害上皮細(xì)胞，對(duì)HPV感染具有協(xié)同作用。曾江忠等［16］研究顯示，陰道菌群密集度異常、菌群多樣性異常均為導(dǎo)致HPV感染或感染持續(xù)的高危因子，增加CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)；Nugent 評(píng)分＞7 分提示患者存在BV，BV 是一類微生物疾病，該病易導(dǎo)致流產(chǎn)、胎膜早破、HPV 感染等，病原菌進(jìn)入陰道后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，有利于增加局部血流和血管通透性，從而達(dá)到清除病原微生物的目的，但持續(xù)的刺激可逐漸進(jìn)展為慢性炎癥反應(yīng)，局部創(chuàng)傷使新生癌細(xì)胞增加，從而導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)；pH值＞4.6 提示陰道內(nèi)優(yōu)勢菌為乳酸桿菌的數(shù)量減少，陰道自潔功能減弱，微生物菌群失調(diào)，術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加；LE、SNA、GUS 均為陰道菌群代謝產(chǎn)物，能夠反映陰道炎癥水平或致病菌增殖水平［17］。LE 是白細(xì)胞在炎癥狀態(tài)下分泌的一種特異性酶類，SNA 是厭氧菌產(chǎn)生的代謝物，GUS 是參與腫瘤細(xì)胞侵襲或轉(zhuǎn)移過程中的基質(zhì)降解酶，LE（+）、SNA（+）、GUS（+）均提示患者存在XU 等［18］研究顯示，BV 是HPV 感染的高危因素，BV 能夠?qū)е玛幍兰皩m腔黏膜屏障被破壞，使HPV 進(jìn)一步感染，從而導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)。

另本研究結(jié)果還顯示，絕經(jīng)、術(shù)前HR-HPV載量高負(fù)荷、累及腺體、手術(shù)切緣陽性均為影響CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，與既往研究結(jié)果一致［19-20］。女性絕經(jīng)后會(huì)發(fā)生宮頸萎縮，從而使移行帶內(nèi)移入宮頸管內(nèi)，且隨著年齡的增大，患者免疫功能逐漸下降，術(shù)后再次感染HPV的風(fēng)險(xiǎn)增大，故更易復(fù)發(fā)；HR-HPV 是引起CIN的主要原因，術(shù)前HR-HPV 載量越高，HPV 復(fù)制越活躍，引起宮頸炎癥損傷，誘發(fā)上皮內(nèi)瘤變，不僅如此，HR-HPV 載量高負(fù)荷使手術(shù)難度增加，病灶切除后易出現(xiàn)殘留，從而導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高；宮頸腺體一旦被化生的上皮覆蓋，手術(shù)切除難度會(huì)增加，易出現(xiàn)殘留，增加復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)；手術(shù)切緣陽性說明切緣周圍仍存在病灶殘留組織，切除效果不理想，術(shù)后殘留癌細(xì)胞能夠再次增殖，易導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)。

綜上所述，陰道菌群改變與CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)，陰道菌群失衡能夠增加術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，此外，絕經(jīng)、術(shù)前HR-HPV 載量高負(fù)荷、累及腺體、手術(shù)切緣陽性均為影響CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，CIN Ⅲ級(jí)患者LEEP 術(shù)后應(yīng)規(guī)范隨訪、積極預(yù)防，以有效控制CIN 復(fù)發(fā)，臨床可根據(jù)上述因素開展針對(duì)性的防治措施，減少疾病復(fù)發(fā)，改善患者預(yù)后。