溫葉艷，張引蓮，張煜隆，林紫璇，林冬梅，林興生，李 晶*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)菌草科學(xué)與技術(shù)研究院/國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

牛樟芝（Taiwanofungus camphoratus M.Zang & C.H.Su）是中國臺(tái)灣特有的珍稀藥用菌，又名牛樟菇、樟芝，是多年生蕈菌類，具有圓柱形擔(dān)孢子，菌絲呈黃色、棕紅色或紅色，子實(shí)體生長在中國臺(tái)灣特有的牛樟樹中空內(nèi)壁上，呈暗棕紅色，形狀呈不規(guī)則狀。牛樟芝Antcin 類化合物是其主要活性物質(zhì)，常被用于解毒、止痛，具有抗氧化和抗腫瘤作用[1]。據(jù)國際抗癌協(xié)會(huì)資料統(tǒng)計(jì)，乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，全世界每年約120 萬婦女發(fā)病，其中約50 萬人死于乳腺癌，且發(fā)病率在中國逐年上升，對社會(huì)家庭產(chǎn)生巨大的影響[2]。牛樟芝中Antcin A、Antcin K、Antcin H等化合物具有不同的抗腫瘤活性作用[3]。Hsieh 等[4]認(rèn)為Antcin A、Antcin C 和Methyl anticiante A 可選擇性抑制人類癌細(xì)胞而非正常細(xì)胞的增殖；Methylantcinate B 和Antcin B 被認(rèn)為是對各種類型癌細(xì)胞的強(qiáng)細(xì)胞毒性藥物[5]；Antcin A 能抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，可作為開發(fā)乳腺癌治療抗轉(zhuǎn)移藥物的先導(dǎo)制劑[6]。分子生物學(xué)技術(shù)已成為21 世紀(jì)科技革命的主要技術(shù)之一，DNA 分子標(biāo)記技術(shù)是分子生物學(xué)技術(shù)的重要組成部分，成為作物遺傳育種、品種鑒定、遺傳多樣性分析、基因定位和克隆等研究的重要手段。在食用菌研究中，DNA 分子標(biāo)記技術(shù)和基因轉(zhuǎn)化技術(shù)等已廣泛應(yīng)用于生物遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)、種質(zhì)鑒定和物種鑒別中[7]。其中簡單重復(fù)序列區(qū)間長度多態(tài)性（Inter Simple Sequence Repeat，ISSR）和基于ITS 限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析（Internal Transcribed Spacer-Restriction Fragment Length Polymorphism，ITS-RFLP）技術(shù)成為研究真菌遺傳多樣性較為常見的分子技術(shù)之一[8]，該方法具有簡便、快速、低成本和重復(fù)性好等特點(diǎn)[9]。BOX-PCR 指紋圖譜分析技術(shù)與重復(fù)片段PCR基因指紋分析（Repetitive DNA PCR-based Genomic Fingerprinting，REP-PCR）和分型法基于腸桿菌基因間重復(fù)共有序列（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR，ERIC-PCR）技術(shù)相似，但其操作更為簡單快捷，容易獲得較為豐富的擴(kuò)增條帶，不需要菌株的特異性DNA 探針，僅需要一條單引物就能夠完成大量菌株的DNA 多態(tài)性分析，已被廣泛應(yīng)用于品種鑒定[10]。文章通過收集牛樟芝菌株并使用DNA 分子標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行種質(zhì)資源分析，并對從牛樟芝中提取到的Antcin 類化合物開展其對乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等研究，探討Antcin 類化合物的協(xié)同作用，為開發(fā)乳腺癌治療藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株和細(xì)胞

本研究所使用供試菌株均由筆者收集并保存于福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心，乳腺癌細(xì)胞由中國臺(tái)灣中興大學(xué)樹木代謝組學(xué)和天然藥物開發(fā)實(shí)驗(yàn)室王升陽教授提供（表1）。

表1 供試菌株及細(xì)胞來源

1.1.2 主要工具酶及試劑

牛樟芝固體培養(yǎng)基主要配方為2.5%葡萄糖、0.5% 蛋白胨、0.3% 麥芽糖、0.3% 酵母提取物、0.1% KH2PO4、0.1% MgSO4·7H2O、0.1%維生素B1、0.25%檸檬草水提取物[10]、2%瓊脂粉，培養(yǎng)基于121 ℃滅菌20 min 后倒平板冷卻備用。Antcin B（ATB）和Antcin H（ATH）化合物從牛樟芝AC001 子實(shí)體中分離得到，純度均＞99%[11]。2 × Taq Master Mix、D2000（plus）Marker、真菌DNA 提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoR I，Dra I，BspD I，Apal I，MspA1 I 等購于NEW ENGLAND BIOLABS 公司，二甲基亞砜（DMSO），Roswell Park Memorial Institute-1640 培養(yǎng)基（RPMI），胎牛血清（FBS），丙酮酸鈉，三苯氧胺（Tamoxifen，TAM），青霉素（Penicillin，AMP）、吉姆薩染色液（Giemsa） 等由Invitrogen（Carlsbad，CA） 提供，Matrigel 基質(zhì)基底膜由Discovery Labware（Bedford，USA）提供，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。本文主要引物均由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成（表2）。

表2 本研究所用引物

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA 提取

將供試菌株采用牛樟芝固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行活化，分別取新鮮菌絲體按真菌DNA 提取試劑盒說明書要求操作，經(jīng)Nanodrop 2000 檢測濃度和純度合格后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ITS-RFLP 序列擴(kuò)增供試菌株

ITS 序列擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，其中2 × Taq Master Mix1 2.5 μL、DNA 模板1 μL、ITS1 與ITS4 引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行產(chǎn)物回收、純化和測序。

通過限制性內(nèi)切酶EcoR I，Dra I，BspD I，Apal I，MspA1 I 對ITS PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切。反應(yīng)體系（總體積30 μL）：10 × FastDigest Green Buffer 2 μL、FastDigest enzyme 1 μL、PCR 產(chǎn)物10 μL、ddH2O 17 μL。酶切程序：37 ℃反應(yīng)5 min 后65 ℃加熱10 min 使酶失活。以1%瓊脂糖凝膠，100 V 電壓電泳30 min，經(jīng)切膠回收測序后，所得到的序列與NCBI 中GenBank 數(shù)據(jù)庫做比對分析。序列采用軟件MEGA7.0 以鄰接（Neighbor-joining，簡稱NJ）法構(gòu)建進(jìn)化樹，以外源菌株金福菇TO03 作為外源對照。

1.2.3 BOX-PCR 序列擴(kuò)增

BOX-PCR 序列擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，其中包括2 × Taq Master Mix 3.3 μL，DNA 模板1 μL，引物1 μL，ddH2O 19.7 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性7 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸8 min，30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸15 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后拍照記錄。

1.2.4 ISSR 序列擴(kuò)增

ISSR 序列擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包括2 × Taq Master Mix 12.5 μL，DNA 模板1 μL，引物1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，以50～60 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 % 瓊脂糖凝膠電泳后拍照。采用軟件Ntsyspc 2.10e 以非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類分析和Tree Plot 法對凝膠電泳圖進(jìn)行分析并建立進(jìn)化樹。

1.2.5 乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)及MTT 試驗(yàn)

將乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 接種在含有10%胎牛血清、1.5 g·L-1NaHCO3和100 U·L-1AMP 的RPMI 培養(yǎng)基中，在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃繼代培養(yǎng)至第6 代，以第7 代MDA-MB-231 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象。

MTT 試驗(yàn)是將MDA-MB-231 細(xì)胞分別以104個(gè)·孔-1（200 μL） 的密度接種在含有10% FBS、1.5 g·L-1NaHCO3和1%青霉素的RPMI 培養(yǎng)基的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別以0、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1的ATB、ATH 和ATB+ATH 組合分別處理MDA-MB-231 細(xì)胞24 h 和72 h，以490 nm 處的吸光度值設(shè)置細(xì)胞增殖率為100%，計(jì)算Antcin 類化合物對乳腺癌細(xì)胞致死率。

1.2.6 劃痕試驗(yàn)

將2 × 104個(gè)·孔-1（70 μL）MDA-MB-231 細(xì)胞接種到具有無硅細(xì)胞培養(yǎng)插入物的6 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h 后取出插入物，用PBS 洗滌孔中細(xì)胞，加入2 mL無FBS 的RPMI 培養(yǎng)基和一定濃度的ATB、ATH 分別繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h 和48 h，以5 μmol·L-1TAM 處理組為陽性對照（下同），并在0 h、12 h、24 h 和48 h 用倒置顯微鏡對細(xì)胞生長情況進(jìn)行記錄，以監(jiān)測細(xì)胞在培養(yǎng)皿中的遷移情況，并通過軟件ImageJ 分析處理組與對照組相比的細(xì)胞遷移百分比。

1.2.7 Transwell 侵襲試驗(yàn)

10 μL Matrigel 基質(zhì)放于聚碳酸酯膜濾膜上，37℃保溫2 h 使其凝固；收集培養(yǎng)好的MDA-MB-231 細(xì)胞經(jīng)無FBS 的RPMI 培養(yǎng)基洗3 次并調(diào)整細(xì)胞濃度為104個(gè)·mL-1（200 μL），加入一定濃度ATB、ATH。底部腔室中加入700 μL 含F(xiàn)BS 的RPMI 培養(yǎng)基作為趨化因子。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，用4 ℃甲醇固定濾膜上的細(xì)胞15 min，采用Giemsa 染色溶液染色30 min 后用PBS 洗滌若干次。最后，通過顯微鏡（200×）拍攝照片，并用軟件ImageJ 分析細(xì)胞數(shù)量。

1.2.8 成球試驗(yàn)

將200 μL Matrigel 作為粘性層滴注在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，并在37 ℃下保溫2 h 使其凝固。制備以104個(gè)·孔-1（2 mL）MDA-MB-231 細(xì)胞接種到RPMI 培養(yǎng)基中，待細(xì)胞完全沉降后，用含5%基質(zhì)凝膠的完全培養(yǎng)基代替RPMI 培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間共15 d，每3 d 更換1 次培養(yǎng)基，結(jié)束后用PBS 洗滌表面細(xì)胞后采用Giemsa 染色溶液染色30 min，最后用PBS 洗滌若干次，自然晾干后在顯微鏡下記錄結(jié)果。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

每項(xiàng)試驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，使用軟件Graphpad prism 5.01 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用ANOVA 方差分析與t 檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評估，所有統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果中* 表示在P<0.05具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS-RFLP 序列擴(kuò)增

ITS-PCR 擴(kuò)增序列經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到的片段大小約750 bp （圖2），對供試菌株的ITS 序列和NCBI 中比對的近20 條序列的遺傳距離進(jìn)行分析（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AC001 與AC005 親緣關(guān)系較近，而AC002、AC003、AC004 和AC006 親緣關(guān)系較近。

圖1 供試菌株

圖2 供試菌株ITS 擴(kuò)增的PCR 譜帶

圖3 Neighbor-joining 法構(gòu)建的ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹

酶切結(jié)果如圖4 所示，不同牛樟芝菌株的條帶間并未有明顯區(qū)別，無法顯著區(qū)分菌株間差異。

圖4 不同限制性內(nèi)切酶對ITS 序列進(jìn)行酶切后產(chǎn)物

2.2 BOX-PCR 序列擴(kuò)增

如圖5 所示，采用BOXAIR 引物擴(kuò)增的條帶均在250～2000 bp，不同牛樟芝菌株條帶在1500 bp 左右，且與金福菇TO03（CK）菌株條帶區(qū)別顯著。

圖5 BOX-PCR 擴(kuò)增條帶凝膠電泳

2.3 ISSR 序列擴(kuò)增

由圖6 可見，從28 條ISSR 常用引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性高的引物，主要包括P1、P4、P5、P13、P14、P23、P24、P25，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同引物可以通過條帶顯著區(qū)分不同菌株間差異性，ISSR 擴(kuò)增多態(tài)性譜帶采用UPGMA 法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果共獲得812 條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比例達(dá)41%。表明其遺傳多樣性較為豐富，牛樟芝菌株與金福菇菌株之間的遺傳相似系數(shù)為0.34，說明二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；6 株牛樟芝菌株之間也存在不同程度的相對親緣關(guān)系，在遺傳相似系數(shù)0.48 處可聚為3 類，其中AC002、AC003、AC004和AC005 可以聚為一類（圖7）。

圖6 部分ISSR 引物擴(kuò)增凝膠電泳譜帶

圖7 UPGMA 聚類圖譜

2.4 Antcin 類化合物對細(xì)胞毒性的作用

通過MTT 法分別測定牛樟芝ATB 和ATH 對MDA-MB-231 細(xì)胞毒性結(jié)果表明，與0.05% DMSO（CK）相比，10 μmol·L-1ATB 處理、40 μmol·L-1ATH處理對細(xì)胞毒性的作用無顯著性差異（P＞0.05），且5 μmol·L-1ATB 處理和20 μmol·L-1ATH 處理菌株在24 h 和72 h 條件下對細(xì)胞毒性的作用無顯著性差異（P＞0.05）；當(dāng)ATB 濃度高于10 μmol·L-1和ATH 高于5 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活力在72 h 內(nèi)以劑量依賴性方式逐漸降低（P＞0.05）。因此，本研究采用5 μmol·L-1ATB和20 μmol·L-1ATH 組合，10 μmol·L-1ATB、40 μmol·L-1ATH 的非細(xì)胞毒性濃度進(jìn)行后續(xù)研究（圖8）。

圖8 ATB 和ATH 組合模式對MDA-MB-231 細(xì)胞毒性的影響

2.5 Antcin 類化合物對細(xì)胞遷移的影響

如圖9 所示，ATB+ATH 組在48 h 時(shí)的閉合面積與0 h 時(shí)的相比僅減小13.30%，而與陰性對照組（Neg）相比減小了48.2%（P＜0.05），表明2 種化合物共同作用可對MDA-MB-231 細(xì)胞遷移起到協(xié)同作用。

圖9 Antcin 類化合物對MDA-MB-231 細(xì)胞遷移作用的影響

2.6 Antcin 類化合物對細(xì)胞侵襲的影響

與陰性對照組（Neg） 相比，ATB、ATH 和ATB+ATH 均能顯著抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的侵襲能力（圖10-a），且ATB+ATH 組與陽性對照組（TAM）無顯著性差異（P＞0.05）（圖10-b）。

圖10 ATB 和ATH 化合物對MDA-MB-231 侵襲的抑制作用（24 h）

2.7 Antcin 類化合物對細(xì)胞成球作用的影響

如圖11 所示，乳腺癌細(xì)胞在無任何干預(yù)的情況下經(jīng)培養(yǎng)15 d 后具有顯著的成球現(xiàn)象，而通過添加ATB、ATH 和ATB+ATH 均能顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的成球，從而抑制癌細(xì)胞在體內(nèi)成瘤。

圖11 ATB 和ATH 化合物對乳腺癌細(xì)胞成球的抑制作用

3 討論

采用ITS-RFLP、ISSR 和BOX-PCR 技術(shù)對收集到的牛樟芝菌株進(jìn)行分類，其中BOX-PCR 和ISSR 技術(shù)能通過特定的引物區(qū)分不同菌株間的差異，且研究結(jié)果不受生長階段和形態(tài)限制，大大增加了鑒定的準(zhǔn)確性和科學(xué)性，從分子水平為牛樟芝的準(zhǔn)確分類、鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。ITS-RFLP 分子標(biāo)記技術(shù)一般用于鑒定真菌物種及屬內(nèi)物種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，ITS 序列上的5.8 S、18 S 和28 S rRNA 基因具有極大保守性，且絕大多數(shù)真核生物在此區(qū)域都表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性[12]，然而限制性內(nèi)切酶的篩選是該技術(shù)的重點(diǎn)，筆者篩選EcoR I、Dra I、BspD I、Apal I、MspA1 I 等常見限制性內(nèi)切酶對ITS 片段進(jìn)行處理，由于供試牛樟芝菌株之間相似度較高，所選限制性內(nèi)切酶難以分辨出明顯差異，因此進(jìn)一步篩選更高效的內(nèi)切酶用于區(qū)分該菌株片段是今后研究重點(diǎn)。Antcin類化合物是牛樟芝中的主要活性物質(zhì)，對癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等均有顯著作用[13]。目前，已有研究表明，單一Antcin 類化合物（Antcin A，Antcin C，Antcin K 和Antcin H）對治療小鼠風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肥胖、腦出血、抗炎癥等病癥具有顯著療效[14]。然而對于ATB 和ATH 疊加后的協(xié)同作用卻少有研究，文章對MDAMB-231 中細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞侵襲的影響研究表明，ATB+ATH 組在48 h 時(shí)的閉合面積與0 h時(shí)相比僅減小13.30%，而與陰性處理組相比減小了48.2%（P＜0.05）；且ATB+ATH、ATB 和ATH 均能顯著抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的侵襲（P＜0.05），ATB+ATH與陽性對照組（TAM）無顯著性差異（P＞0.05），能顯著抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的成球，從而抑制癌細(xì)胞在體內(nèi)成瘤，因此，ATB+ATH 協(xié)同作用能有效抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。生物活性化合物通過對免疫系統(tǒng)的有益作用以及對癌細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性作用，對癌癥治療產(chǎn)生間接影響，從而有效抑制癌細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲[15]。

4 結(jié)論

通過多種DNA 分子標(biāo)記技術(shù)開展牛樟芝種質(zhì)資源研究，規(guī)范菌種市場顯得尤其重要。本研究收集了6株牛樟芝菌株并對其進(jìn)行親緣分析；從中分離出的牛樟芝Antcin 類化合物ATB 和ATH 對乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲等具有顯著抑制作用，能為其在動(dòng)物試驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

致謝：感謝中國臺(tái)灣中興大學(xué)樹木代謝組學(xué)和天然藥物開發(fā)實(shí)驗(yàn)室王升陽教授、Kumar 博士和王雅昀博士對本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行指導(dǎo)。