袁翠，林曉駿，陳俊宇，何寶儀，安立龍，吳江

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

高溫環(huán)境是制約家禽生產(chǎn)的一個(gè)重要因素，高溫可引起家禽的熱應(yīng)激，導(dǎo)致生長(zhǎng)和代謝紊亂、免疫抑制及肉蛋品質(zhì)下降、死淘率增加、飼料轉(zhuǎn)化率降低等，嚴(yán)重影響家禽的生產(chǎn)性能，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。而如今伴隨全球溫度升高和高密度集約化養(yǎng)殖而來(lái)的家禽熱應(yīng)激問(wèn)題日趨嚴(yán)峻，尤其是熱帶和亞熱帶地區(qū)，家禽熱應(yīng)激事件愈加頻繁。熱應(yīng)激（Heat stress，HS）是指機(jī)體對(duì)高溫環(huán)境做出的一系列非特異性生理反應(yīng)的總和[3]。目前，關(guān)于熱應(yīng)激對(duì)家禽生理功能的影響機(jī)理以及如何有效緩解熱應(yīng)激等問(wèn)題，己經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者們的高度重視。

姜黃素（Curcumin，Cur）是一種天然的低分子量植物酸性多酚類化合物，具有廣泛生物活性以及醫(yī)用價(jià)值，同時(shí)可作為色素或食品添加劑用于食品加工，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)血脂、保護(hù)神經(jīng)等多種功效[4]。Sirtuins 是一類功能多樣的去乙?；福钴S程度與NAD＋的水平呈正相關(guān)，是代謝過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子。Sirtuins 基因家族在調(diào)控線粒體的生物生成和代謝調(diào)控過(guò)程中具有重要作用[5]。有關(guān)研究表明，在熱應(yīng)激下，Sirtuins 基因家族出現(xiàn)氧化損傷。Sirt1 和Sirt2 位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，Sirt3、Sirt4 和Sirt5 位于線粒體中，而Sirt6 和Sirt7 只在細(xì)胞核中被發(fā)現(xiàn)，其成員的生物學(xué)功能不盡相同[6]。對(duì)其進(jìn)一步深入研究，不僅提供更多有關(guān)細(xì)胞生命過(guò)程調(diào)控的信息，還可為臨床疾病的診斷及治療提供依據(jù)。前期研究表明，姜黃素能夠改變13 月齡羅曼粉蛋雞卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，并顯著上調(diào)Sirt1、Sirt2、Sirt3 基因的表達(dá)[7]。而當(dāng)前姜黃素對(duì)熱應(yīng)激條件下雞性腺中Sirtuins 家族其他成員的表達(dá)和調(diào)控鮮有研究。

因此，試驗(yàn)以30 周齡羅曼粉雞為研究對(duì)象，研究了姜黃素對(duì)熱應(yīng)激條件下雞卵巢和睪丸器官中Sirtuins 基因家族表達(dá)量的影響，為姜黃素和熱應(yīng)激對(duì)Sirtuins 基因家族在性腺的表達(dá)和功能的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑有：姜黃素（購(gòu)自西安金綠生物工程有限公司，≥95%）； Trizol 試劑（購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司）；100 bp DNA Marker[購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司]；PCR mix（康為世紀(jì)公司產(chǎn)品）；瓊脂糖（購(gòu)自北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司）；EB 替代品（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品）；Trizol 總RNA 提取試劑盒【天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品】。

主要儀器有：PCR 儀（T100 型，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Tanon1220 型，廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司）、三恒電泳儀（DYCP-31DN+DYY-6C 型，北京市六一儀器廠）、實(shí)驗(yàn)室專用超純凈水機(jī)（LM-75G-D 型，重慶科迪實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、光學(xué)顯微鏡（CX31 型，上海山漢光電科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

選擇42 只30 周齡、健康、體重相近的羅曼粉蛋雞（購(gòu)自廣州喜迎珍禽養(yǎng)殖有限公司），公母各半，隨機(jī)分為常溫對(duì)照組（CK 組）、高溫對(duì)照組（HC 組）、高溫處理組（HT 組），每組公雞和母雞各7 只雞。常溫組和高溫組飼喂基礎(chǔ)飼糧，飼糧配方與實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)表文章相同[8]。高溫處理組參照實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果[9]，即在基礎(chǔ)飼糧中添加200 mg/kg 姜黃素。試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1，營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)參考羅曼粉蛋雞管理手冊(cè)（https://lohmann-breeders.com）。試驗(yàn)在2019 年5～6 月進(jìn)行。常溫組保持溫度在（25±3）℃，高溫組和高溫處理組在常溫的基礎(chǔ)上采用循環(huán)高溫，保持每天10:00～16:00 溫度在（32±3）℃，使用除濕機(jī)等嚴(yán)格控制各組濕度處于65%～80%。試驗(yàn)第21 天屠宰42 只羅曼粉蛋雞，取出各組卵巢和睪丸組織，存放于-80 ℃冰箱。

表1 基礎(chǔ)飼糧的組成和營(yíng)養(yǎng)成分 單位：%

1.3 卵巢和睪丸組織切片的制作及HE 染色

將每組的卵巢和睪丸修整為1 cm×1 cm×0.5 cm的組織塊，置于Bouin 氏固定液中固定24 h。組織塊固定后以流水沖洗12 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μ m，展片及攤片，37 ℃溫箱烤干，制得切片；切片脫蠟至蒸餾水浸泡2min；蘇木精染核10 min，1% 鹽酸酒精分化20 s，流動(dòng)自來(lái)水藍(lán)化15 min；1%伊紅染細(xì)胞質(zhì)2 min；梯度乙醇脫、切片透明；中性樹(shù)膠封固。

1.4 產(chǎn)蛋率及采精量的測(cè)定

試驗(yàn)期間以每組重復(fù)為單位，統(tǒng)計(jì)3 周各重復(fù)的平均產(chǎn)蛋率和采精量。

1.5 總RNA 提取及cDNA 合成

使用Trizol 法提總RNA， 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR 擴(kuò)增目的條帶。PCR 體系：PCRMix 1μ L、ddH2O 8.4 μL、引物F 0.3 μL、引物R 0.3 μL、模板1.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、52 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸30 s、72 ℃延伸10 min、4 ℃保存。引物信息見(jiàn)表2，由生工生物工程有限公司合成。

表2 PCR引物序列

1.6 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓為100 V。電泳完畢后，取出凝膠在紫外燈下觀察，目的基因存在處顯示出肉眼可辨的熒光條帶。使用凝膠呈像系統(tǒng)拍下凝膠圖片并觀察電泳結(jié)果。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用ImageJ 軟件對(duì)各DNA 熒光條帶進(jìn)行灰度分析，數(shù)據(jù)整合至Excel2019 軟件，SPSS 26.0軟件采用Duncan 方法進(jìn)行多重比較顯著性差異，結(jié)果以（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)熱應(yīng)激蛋雞繁殖性能的影響

結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 可知，與常溫對(duì)照組（CK組）相比，高溫組（HC 組）雞的產(chǎn)蛋率和采精量明顯下降，差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明高溫環(huán)境會(huì)導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)生熱應(yīng)激，進(jìn)而對(duì)雞的卵巢和睪丸產(chǎn)生不良影響；從高溫組（HC 組）和高溫處理組（HT 組）對(duì)比可知，添加姜黃素后，雞的產(chǎn)蛋率和采精量均顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明姜黃素能在一定程度上緩解高溫?zé)釕?yīng)激對(duì)雞卵巢和睪丸產(chǎn)生的不良影響。

圖1 姜黃素對(duì)33周齡熱應(yīng)激蛋雞繁殖性能的影響

2.2 姜黃素對(duì)熱應(yīng)激蛋雞卵巢和睪丸組織形態(tài)的影響

結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2 可知，在光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢和睪丸切片，高溫組（HC 組）和常溫組（CK組）相比，高溫組中（HC 組）卵巢組織結(jié)構(gòu)松散，卵泡細(xì)胞明顯減少，形成大量的空白，睪丸組織中曲細(xì)精管出現(xiàn)空泡化，細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，且分布紊亂，但高溫處理組（HT 組）與高溫組（HC組）相比，可看出卵泡內(nèi)容物明顯增多和著色點(diǎn)也有增加。睪丸組織中曲細(xì)精管未出現(xiàn)空泡化，且細(xì)胞數(shù)量明顯增多，但仍少于常溫組中的細(xì)胞。

圖2 蛋雞卵巢和睪丸組織切片HE染色圖。標(biāo)尺=50μm（詳見(jiàn)附錄彩圖）

2.3 姜黃素對(duì)熱應(yīng)激蛋雞卵巢中Sirtuins 基因家族表達(dá)

姜黃素對(duì)熱應(yīng)激蛋雞卵巢中Sirtuins 基因家族表達(dá)的影響見(jiàn)圖3。由圖3 可知，與常溫對(duì)照組（CK組）相比，高溫條件下Sirtuins 基因家族各基因在雞卵巢器官中表達(dá)量明顯都比常溫的表達(dá)量少，差異顯著（P＜0.05)，說(shuō)明在高溫條件下，雞發(fā)生熱應(yīng)激會(huì)產(chǎn)生不良影響。從高溫對(duì)照組（HC 組）和高溫處理組（HT 組）對(duì)比可知，Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt5 基因在熱應(yīng)激條件下使用姜黃素后，在雞卵巢器官中表達(dá)量明顯上升，且差異顯著（P＜0.05）；Sirt4、Sirt6、Sirt7 基因在熱應(yīng)激下使用姜黃素后，在30 周齡雞卵巢器官中表達(dá)量與HC 組相比差別不大。說(shuō)明姜黃素能在一定程度上緩解高溫?zé)釕?yīng)激對(duì)雞卵巢產(chǎn)生的不良影響。

圖3 姜黃素對(duì)Sirtuins基因家族在33周齡熱應(yīng)激蛋雞卵巢部表達(dá)量的影響

2.4 姜黃素對(duì)熱應(yīng)激蛋雞睪丸中Sirtuins 基因家族表達(dá)的影響

姜黃素對(duì)熱應(yīng)激蛋雞睪丸中Sirtuins 基因家族條件下表達(dá)的影響見(jiàn)圖4。由圖4 可知，高溫組（HC組）中的Sirtuins 基因家族表達(dá)水平相對(duì)于常溫組（CK 組）來(lái)說(shuō)都有所下降，其中以Sirt4、Sirt5和Sirt7 下降幅度較大，與CK 組相比差異顯著（P＜0.05）。說(shuō)明熱應(yīng)激會(huì)影響雞睪丸中Sirtuin基因家族的表達(dá)量，但對(duì)于Sirt1 基因表達(dá)影響是最小的。從高溫處理組（HT）和高溫組（HC）對(duì)比可知，添加了姜黃素的高溫處理組（HT 組），Sirtuins 基因表達(dá)量均有上調(diào)，且Sirt1、Sirt2、Sirt3 基因的表達(dá)量比常溫組（CK）的表達(dá)量還要高。與高溫組（HC 組）相比，高溫處理組（HT 組）的Sirt4和Sirt5差異顯著（P＜0.05）。由此可以表明，姜黃素能有效地緩解熱應(yīng)激對(duì)睪丸中Sirtuins 基因家族表達(dá)量的影響，尤其是對(duì)Sirt4 和Sirt5 的影響更大。

圖4 姜黃素對(duì)Sirtuins基因家族在33周齡熱應(yīng)激蛋雞睪丸部表達(dá)量的影響

3 討論

3.1 姜黃素對(duì)熱應(yīng)激蛋雞卵巢及卵巢中Sirtuins基因家族的調(diào)節(jié)作用

卵巢是雌性動(dòng)物生產(chǎn)的重要器官，卵巢的重量及卵泡數(shù)量反映卵巢發(fā)育的情況。熱應(yīng)激條件下蛋雞卵巢組織卵泡的內(nèi)容物增多,著色加深,卵泡壁增厚[8]。高文[10]研究發(fā)現(xiàn)在高溫環(huán)境中蛋雞的產(chǎn)蛋率、采食量和破損蛋率顯著降低，姜黃素能有效緩解蛋雞產(chǎn)蛋率和促進(jìn)卵泡的發(fā)育。趙壯志等[11]的研究表明，飼糧中添加姜黃素可以改善羅曼粉殼蛋雞的卵泡發(fā)育。相關(guān)研究也表明了姜黃素顯著上調(diào)卵巢組織細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)和黏著連接、Nod 樣受體信號(hào)通路、ErbB 和FoxO 信號(hào)通路的相關(guān)circRNA 表達(dá)譜[12]。Sirtuins 在維持卵巢儲(chǔ)備、調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、改善胚胎發(fā)育等方面具有重要功能[13]。相關(guān)研究表明，Sirt1 基因可緩解卵巢組織中細(xì)胞的衰老和凋亡，且抑制氧化凋亡情況下卵巢細(xì)胞自噬[14,15]。Sirt2 作為一種高度保守的組蛋白去乙?；?，可調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)過(guò)程[16]；Sirt2 的表達(dá)可增強(qiáng)顆粒細(xì)胞糖酵解速率以改善大鼠卵泡發(fā)育[17,18]。Sirt3 在線粒體的適應(yīng)性反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用，包括對(duì)代謝程序的重排、提高抗氧化劑的保護(hù)作用等[19]。Sirt5 可通過(guò)調(diào)控Nrf2/HO-1 通路抑制ROS 依賴的DNA 損傷導(dǎo)致卵巢癌順鉑耐藥[20]。

在試驗(yàn)中，Sirtuins 基因家族各基因在高溫條件下在30 周齡雞卵巢器官中表達(dá)水平顯著低于常溫組（CK 組）。添加姜黃素高溫處理組的Sirtuins 基因家族表達(dá)水平均高于高溫組，且Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt5 基因表達(dá)差異顯著?？梢?jiàn)高溫條件能夠抑制蛋雞機(jī)體抗氧化和凋亡相關(guān)基因表達(dá)，對(duì)雞機(jī)體產(chǎn)生不良反應(yīng)。而姜黃素能在蛋雞熱應(yīng)激條件下顯著上調(diào)部分基因的表達(dá)水平來(lái)達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的效果，從而減少高溫對(duì)卵巢產(chǎn)生的不良影響。

3.2 姜黃素對(duì)熱應(yīng)激蛋雞睪丸及睪丸中Sirtuins基因家族的調(diào)節(jié)作用

精液量和睪丸的組織形態(tài)學(xué)是反映雄性動(dòng)物繁殖力的重要指標(biāo)。大量研究表明熱應(yīng)激會(huì)引起小鼠精子密度和質(zhì)量損傷[21]。秦芹等[22]人研究發(fā)現(xiàn)高溫使雄性大鼠睪丸的生殖腺組織萎縮，生精環(huán)境發(fā)生改變，阻礙了精子的發(fā)生和發(fā)育。姜志洋[23]發(fā)現(xiàn)添加姜黃素，高溫下睪丸組織曲細(xì)精管的空腔狀有所緩解，生精細(xì)胞增多，排列地更加密集有序，曲細(xì)精管間的間質(zhì)細(xì)胞也明顯增多。李佳濱[24]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)甲醛誘導(dǎo)的小鼠睪丸組織損傷具有保護(hù)作用。楊金鳳[25]研究表明姜黃素可改善環(huán)磷酰胺所致生殖損傷，保護(hù)小鼠生殖功能。王志和牛艷峰[26]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加200 mg/kg 姜黃素能夠顯著提高熱應(yīng)激蛋雞的抗氧化性能，提高生產(chǎn)性能。相關(guān)研究表明，Sirtuins家族在睪丸組織中有高表達(dá)，在調(diào)控精子發(fā)生過(guò)程中起重要作用[27]。其中，Sirt4 具有ADP 核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，是一種高度保守的蛋白，且被認(rèn)為與脂代謝密切相關(guān)[28]。Sirt5 被認(rèn)為能夠有效去除賴氨酸羧基修飾[29]，王利紅等[30]的試驗(yàn)結(jié)果也表明Sirt5 在同為哺乳動(dòng)物的蘇姜豬各部位廣泛表達(dá)。Sirt7 基因的功能主要與各臟器功能細(xì)胞的物質(zhì)能量代謝和分泌功能有關(guān)，表達(dá)也呈現(xiàn)廣泛性[30-31]。

在試驗(yàn)中，高溫組的Sirt4、Sirt5、Sirt7 表達(dá)水平顯著低于常溫組。添加姜黃素高溫處理組的Sirtuins 基因家族表達(dá)水平均高于高溫組，其中處理組的Sirt4 和Sirt5 表達(dá)水平與高溫組差異顯著。本試驗(yàn)結(jié)果表明，熱應(yīng)激條件下睪丸條件損傷可能與代謝及去除賴氨酸羧基修飾相關(guān)，結(jié)合相關(guān)研究成果，姜黃素通過(guò)上調(diào)Sirt4、Sirt5 的表達(dá)水平提高動(dòng)物在熱應(yīng)激條件下的代謝效率來(lái)降低熱應(yīng)激對(duì)睪丸的損傷。

4 結(jié)論

高溫下產(chǎn)生的熱應(yīng)激反應(yīng)會(huì)不同程度地影響到雞卵巢和睪丸及Sirtuins 基因家族的表達(dá)，姜黃素能在一定程度上緩解在熱應(yīng)激條件下30 周齡雞性腺器官中Sirtuins 基因家族表達(dá)量的影響。