朱清麗,譚艷萍,李 寧,涂蓉榮

安康市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，安康 725000

維生素C 片是非處方藥，主要成分為維生素C（L-抗壞血酸），分子式為C6H8O6，用于預(yù)防壞血病，也可用于各種急、慢性傳染病及紫癜等的輔助治療。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020年版二部［1］用滴定法測(cè)定其含量，標(biāo)準(zhǔn)中有崩解時(shí)限檢查項(xiàng)目，但未對(duì)溶出度進(jìn)行控制。用滴定法測(cè)定含量雖成本低廉，但靈敏度低，受人為因素影響較大。

溶出度是指活性藥物在規(guī)定條件下從片劑、膠囊劑或顆粒劑等普通制劑中溶出的速率和程度［2］，藥物在體內(nèi)的吸收和利用效率與藥物的溶出度具有直接的關(guān)系。體外溶出實(shí)驗(yàn)通常被認(rèn)為可預(yù)測(cè)藥物的體內(nèi)行為和生物利用度情況［3］，是固體制劑體外工藝控制的重要指標(biāo)，對(duì)評(píng)價(jià)固體制劑的內(nèi)在質(zhì)量尤為重要。目前關(guān)于維生素C 片含量測(cè)定及溶出度方法研究的報(bào)道極少，為了進(jìn)一步提高檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定相關(guān)規(guī)范要求［4］，參照普通口服固體制劑溶出度實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則［5］，通過(guò)查閱文獻(xiàn)［6-20］，建立了測(cè)定維生素C 片含量的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）及測(cè)定其溶出度的方法，為控制維生素C 片的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-2030 型高效液相色譜儀、島津色譜工作站、紫外檢測(cè)器、UV-2600 紫外分光光度計(jì)均購(gòu)自日本島津公司；Milli-Q Integral 5 純水/超純水一體機(jī)（默克密理博公司）；SECURA225D-1CEU 電子分析天平［精度十萬(wàn)分之一，賽多利斯儀器（北京）有限公司］；ADFC12AD 全自動(dòng)溶出取樣收集系統(tǒng)（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；KQ-250DE 超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器廠）。

1.2 試藥

維生素C 對(duì)照品（批號(hào)100425-202105，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；維生素C 片（批號(hào)220801，四川依科制藥有限公司）；維生素C 片（批號(hào)220601，山西太原藥業(yè)有限公司）；維生素C 片（批號(hào)2209178010，西安利君制藥有限責(zé)任公司）；維生素C 片（批號(hào)12208291，上海全宇生物科技確山制藥有限公司）；維生素C 片（批號(hào)22062101，陜西頤生堂藥業(yè)有限公司）；甲醇（批號(hào)WXBD7557V，色譜純，Sigma-Aldrich 公司）；磷酸二氫鉀（批號(hào)20201203，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（批號(hào)20160914，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

對(duì)照品儲(chǔ)備液：取維生素C 對(duì)照品20 mg，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液10 mL，置于20 mL 量瓶中，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液稀釋至刻度，制成每1 mL 約含0.1 mg 的維生素C 對(duì)照品溶液，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取供試品20 片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于維生素C 100 mg），置于100 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液適量，超聲使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)；再精密量取續(xù)濾液5 mL，置于50 mL 量瓶中，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液稀釋至刻度，制成每1 mL 約含0.1 mg 的供試品溶液，搖勻，作為供試品溶液。

陰性對(duì)照溶液：取維生素C 片樣品的空白輔料，按處方比例混勻，稱取適量按照供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備，作為陰性對(duì)照溶液。

2.2 含量測(cè)定方法的建立與考察

2.2.1 色譜條件 色譜柱為菲羅門(mén)C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.5）-甲醇（92∶8）；流速為0.8 ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為243 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 專屬性考察 分別精密量取2.1 項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，按照2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，維生素C 的保留時(shí)間為5 min，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 專屬性實(shí)驗(yàn)色譜圖Fig.1 Chromatograms of specific test

2.2.3 精密度考察 取對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣6 次，測(cè)得峰面積為3 780 805、3 773 593、3 775 101、3 769 007、3 762 395、3 753 851，計(jì)算RSD 值為0.26%，表明精密度良好。

2.2.4 線性考察 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、3、4、5、6、7 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，分別制成每1 mL 中約含維生素C 20、40、60、80、100、120、140 μg 的溶液，作為線性考察溶液。分別取上述線性考察溶液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程y=37 487.239x-6 860.622（r=0.999 96），結(jié)果顯示，維生素C 在20～140 μg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.5 重復(fù)性考察 取批號(hào)為220801 的樣品，按照供試品溶液制備方法平行制備6 份溶液，進(jìn)行測(cè)定。6 份供試品含量測(cè)定結(jié)果為98.72%、98.19%、98.62%、96.96%、97.67%、98.98%，計(jì)算得RSD 值為0.77%，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取批號(hào)為220801 的樣品，按照2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在室溫條件下分別放置0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h 后進(jìn)行測(cè)定，峰面積依次為3 767 112、3 744 892、3 761 589、3 690 364、3 658 509、3 571 162、3 400 033、3 091 082、2 674 056、2 295 303，計(jì)算得8、10、12 h 的RSD 值分別為1.28%、2.04%、3.62%，表明維生素C 供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 回收率考察 精密稱定已知含量的樣品（批號(hào)為220801）共9 份，分別精密加入已知樣品含量80%、100%、120%限度的對(duì)照品各3 份，用0.1 mol·L-1鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1 mL約含維生素C 0.1 mg的回收率考察溶液，進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算。9 組樣品平均回收率為100.16%，RSD 值為0.48%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery test

2.2.8 檢測(cè)限與定量限 取對(duì)照品溶液逐級(jí)定量稀釋并測(cè)定。當(dāng)S/N 約為10 時(shí)測(cè)得定量限為0.120 μg·mL-1，當(dāng)S/N 約為3 時(shí)測(cè)得檢測(cè)限為0.034 μg·mL-1。

2.2.9 耐用性實(shí)驗(yàn) 用4 種不同品牌色譜柱進(jìn)行測(cè)試，調(diào)整柱溫（30、35、40 ℃）、流速（0.7、0.8、1.0 mL·min-1），用磷酸調(diào)節(jié)0.1 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液pH 值分別為2.45、2.50、2.55，在規(guī)定范圍內(nèi)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，經(jīng)過(guò)考察發(fā)現(xiàn)上述調(diào)整并不影響含量測(cè)定結(jié)果，表明此方法的耐用性良好。

2.2.10 HPLC 與滴定法測(cè)定結(jié)果的對(duì)比 按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)滴定法，取5 個(gè)企業(yè)的樣品測(cè)定含量，與建立的HPLC 法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)滴定法與HPLC 法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明可以用HPLC 法代替滴定法。見(jiàn)表2。

表2 2 種方法測(cè)定樣品含量結(jié)果的比較Tab.2 Comparison of the content determination between the 2 methods

3 溶出度方法的建立與考察

3.1 色譜條件與測(cè)定方法的驗(yàn)證

同2.2 項(xiàng)下條件和方法。

3.2 溶出度方法的建立

3.2.1 溶出方法的選擇 籃法和槳法是檢測(cè)口服固體制劑溶出度最常用的2 種方法。取批號(hào)220801的樣品以1 000 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r·min-1，于5、10、15、20、30、45、60 min分別取樣進(jìn)行測(cè)定，將籃法、槳法2 種方法的溶出結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果2 種方法測(cè)得的結(jié)果基本一致，最終選用籃法作為本品的溶出方法。溶出曲線見(jiàn)圖2。

圖2 籃法與槳法溶出曲線的比較Fig.2 Comparison of dissolution curves between basket method and paddle method

3.2.2 溶出介質(zhì)的選擇 取批號(hào)220801 的樣品，用籃法，轉(zhuǎn)速為50 r·min-1，分別以水、0.1 mol·L-1鹽酸溶液、pH 4.0 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液各1 000 mL 作為溶出介質(zhì)，于5、10、15、20、30、45 min 分別取樣、測(cè)定。通過(guò)對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維生素C 在水、pH 4.0 醋酸鹽緩沖液中易水解且穩(wěn)定性較差，測(cè)得溶出度結(jié)果下降較快；在pH 6.8 磷酸鹽緩沖液中溶解不理想且不穩(wěn)定，測(cè)得結(jié)果低；在記錄的色譜圖中未出現(xiàn)降解的雜質(zhì)峰，表明降解產(chǎn)物在檢測(cè)波長(zhǎng)處無(wú)吸收；維生素C 在0.1 mol·L-1鹽酸溶液中穩(wěn)定性最好，該介質(zhì)與人體胃液環(huán)境接近，故選擇0.1 mol·L-1鹽酸溶液作為溶出介質(zhì)。溶出曲線見(jiàn)圖3。

圖3 不同溶出介質(zhì)中溶出曲線的比較Fig.3 Comparison of dissolution curves in different dissolution media

3.2.3 溶出轉(zhuǎn)速及取樣時(shí)間的選擇 取批號(hào)220801 的樣品，用籃法以0.1 mol·L-1鹽酸溶液1 000 mL 為溶出介質(zhì)，分別選擇轉(zhuǎn)速50、75、100 r·min-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，于5、10、15、20、30、45 min 分別取樣、測(cè)定，通過(guò)結(jié)果對(duì)比選擇轉(zhuǎn)速為50 r·min-1。樣品在10 min 后全部溶出并進(jìn)入平臺(tái)，按照連續(xù)2 個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的溶出度之差均≤5%的原則，最終選定取樣時(shí)間點(diǎn)為20 min。溶出曲線見(jiàn)圖4。

圖4 不同轉(zhuǎn)速溶出曲線的比較Fig.4 Comparison of dissolution curves among different rotational speeds

3.2.4 溶出度的測(cè)定結(jié)果 取5 個(gè)企業(yè)的樣品，以0.1 mol·L-1鹽酸溶液1 000 mL 為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r·min-1，于5、10、15、20、30、45 min 分別取樣、測(cè)定，比較溶出曲線。溶出曲線見(jiàn)圖5。

圖5 不同企業(yè)樣品溶出曲線的比較Fig.5 Comparison of dissolution curves of samples from different enterprises

3.2.5 濾膜吸附的影響 取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 mL，平行2 份，分別用離心法和濾膜過(guò)濾（濾液取棄除2 mL 初濾液的續(xù)濾液）法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果變化不大，表明用濾膜過(guò)濾對(duì)溶出度結(jié)果無(wú)影響。

4 討論

4.1 檢測(cè)方法的建立

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)用滴定法測(cè)定含量，雖成本低廉，但靈敏度低，受人為因素影響較大，如滴定時(shí)對(duì)終點(diǎn)的判斷、要求指示劑臨用現(xiàn)配、供試溶液中存在的還原劑對(duì)碘液消耗造成的誤差等，此方法對(duì)結(jié)構(gòu)相近的有關(guān)物質(zhì)或其他干擾測(cè)定的雜質(zhì)缺乏選擇性，專屬性不強(qiáng)。HPLC 法是通過(guò)色譜柱進(jìn)行分離的分析方法，具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，建立測(cè)定維生素C 的HPLC 法，簡(jiǎn)化了操作程序、大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取2.1 項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，用紫外分光光度法，分別在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，圖譜顯示對(duì)照品溶液與供試品溶液在243 nm 波長(zhǎng)處均有最大吸收，輔料溶液在243 nm 波長(zhǎng)處無(wú)吸收。故選擇243 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。

4.3 溶劑的選擇

維生素C 在水中易溶解，但其易水解、具有強(qiáng)還原性，而其在酸性介質(zhì)中由于受空氣中氧的氧化速度減慢、生成單鈉鹽而不發(fā)生水解，用酸性溶劑制備溶液以維持其穩(wěn)定性。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定項(xiàng)下以新沸過(guò)的冷水100 mL 與稀醋酸10 mL 的混合液為溶劑，考慮到與新建立溶出度測(cè)定方法中的溶出介質(zhì)保持一致，選擇溶劑為0.1 mol·L-1鹽酸溶液。

4.4 流動(dòng)相的選擇

先后用0.2 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液-甲醇（85∶15）、0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液-甲醇（40∶60）、0.1 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液-乙腈（85∶15）為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均不理想。用0.1 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液-甲醇（92∶8）分離效果較好。測(cè)定結(jié)果顯示，維生素C 保留時(shí)間、理論塔板數(shù)、分離度、重復(fù)性、拖尾因子結(jié)果均滿意。

4.5 溶出度測(cè)定方法的確定

通過(guò)對(duì)溶出方法、溶出介質(zhì)、溶出轉(zhuǎn)速、取樣時(shí)間及濾膜吸附影響等方面進(jìn)行考察，確定維生素C 片溶出度測(cè)定方法如下：取本品，按照溶出度測(cè)定法（《中國(guó)藥典》2020年版四部附錄0931第一法），以0.1 mol·L-1鹽酸溶液1 000 mL 為溶劑，轉(zhuǎn)速為50 r·min-1，依法操作，在20 min 時(shí)取樣。取溶液10 mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為溶出度供試品溶液。按照2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算溶出度。

4.6 溶液穩(wěn)定性的討論

考慮維生素C 在光下不穩(wěn)定的特性，同時(shí)平行進(jìn)行1 組遮光實(shí)驗(yàn)操作并進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果無(wú)明顯變化，故可不用遮光操作。通過(guò)穩(wěn)定性測(cè)定，結(jié)果顯示在8 h 內(nèi)溶液穩(wěn)定，10 h 后其峰面積逐漸變小，故在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意控制時(shí)間，制備的溶液需在8 h 內(nèi)完成測(cè)定。

通過(guò)建立高效液相測(cè)定維生素C 含量的HPLC法及新建維生素C 的溶出度方法使其檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性更高、專屬性更強(qiáng)、重復(fù)性更好，具有可信、精準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì)，能更有效地對(duì)維生素C 片進(jìn)行質(zhì)量控制。