劉 磊 劉珊珊 胡菲菲 王洪華 王 瑩

內(nèi)分泌失調(diào)可引起糖尿病,而糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥,據(jù)統(tǒng)計,50%的病程超過7年的糖尿病患者患有糖尿病視網(wǎng)膜病變[1-3]。此外,神經(jīng)節(jié)細胞凋亡、炎癥和氧化應激是糖尿病視網(wǎng)膜病變的三大主要病理特征[4-6]。目前,眼內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長因子、類固醇等治療視網(wǎng)膜血管功能障礙的藥物發(fā)展迅速,但一些不良反應仍時有發(fā)生[7]。因此,開發(fā)新的改善視網(wǎng)膜損傷的藥物對于糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療具有重要意義。吳茱萸堿(EVO)是一種從吳茱萸(蕓香科)未成熟的干燥果實中提取的生物堿,其可以降低糖尿病大鼠的血糖,改善氧化應激和炎癥反應[8]。但EVO能否改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜損傷尚未完全明確。相關研究顯示,激活環(huán)磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)信號通路改善了高糖誘導的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞炎癥反應和凋亡損傷[9];且EVO可調(diào)控異丙腎上腺素損傷的β1-AR/CHO-S細胞中cAMP、PKA表達[10]。然而EVO能否調(diào)控cAMP/PKA信號通路改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜損傷尚未完全明確。因此,本研究主要探究EVO對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的改善作用以及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

96只(192眼)6周齡的雄性SD大鼠,體重為200～210 g,購自導科醫(yī)藥技術(廣東)有限公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2022-0060]。所有動物實驗均經(jīng)本院動物保護與使用委員會批準進行,符合實驗動物使用條例,獲山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會審批(批號:2022-111)。

1.1.2 主要試劑

EVO(規(guī)格:20 mg)購自滁州仕諾達生物科技有限公司;鏈脲佐菌素購自上海寶曼生物科技有限公司;羥苯磺酸鈣(CD)購自上海源葉生物科技有限公司;cAMP抑制劑SQ22536購自上海西格生物科技有限公司;大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自深圳海思安生物技術有限公司;大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素 (IL)-6、cAMP ELISA試劑盒均購自上海富雨生物科技有限公司;TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自北京伊塔生物科技有限公司;兔源一抗Bcl-2相關X蛋白(Bax)、P53、磷酸化的PKA(p-PKA)、PKA、GAPDH及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型的構建

將大鼠按照55 mg·kg-1的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素,72 h后若尾靜脈血糖>16.7 mmol·L-1則認為糖尿病大鼠模型構建成功[11];繼續(xù)喂養(yǎng)8周后,處死大鼠,收集大鼠視網(wǎng)膜組織,根據(jù)視網(wǎng)膜病理變化判斷糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型是否構建成功[12]。

1.2.2 實驗分組

按照隨機數(shù)字表法將96只SD大鼠隨機分為對照組(NC組)12只(24眼)、糖尿病視網(wǎng)膜病變組84只(168眼)。NC組除以腹腔注射生理鹽水代替鏈脲佐菌素外,其他操作同造模過程,糖尿病視網(wǎng)膜病變組大鼠按照1.2.1所述方法構建糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型后,若大鼠的視網(wǎng)膜病理變化符合糖尿病視網(wǎng)膜病變的特點則為模型構建成功,經(jīng)鑒定,糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型構建成功率為100%。將84只糖尿病視網(wǎng)膜病變組大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為模型組(Model組)、EVO低劑量組(EVO-L組)、EVO中劑量組(EVO-M組)、EVO高劑量組(EVO-H組)、CD組、SQ22536組、EVO-H+SQ22536組,每組12只。EVO-L組、EVO-M組、EVO-H組大鼠分別灌胃10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、40 mg·kg-1EVO[13],且均同時行腹腔注射等體積的生理鹽水;CD組大鼠灌胃135 mg·kg-1CD[12],且還同時行腹腔注射等體積的生理鹽水;SQ22536組大鼠腹腔注射 2.13 mg·kg-1SQ22536[14],且還同時灌胃等體積的生理鹽水;EVO-H+SQ22536組大鼠灌胃40 mg·kg-1EVO,且還同時行腹腔注射2.13 mg·kg-1SQ22536;NC組、Model組大鼠灌胃等體積的生理鹽水,且還同時行腹腔注射等體積的生理鹽水。每天給藥一次,持續(xù)4周。

1.2.3 標本收集

末次處理24 h后,收集每組全部大鼠(12只)的尾靜脈血用于血糖的檢測;尾靜脈血收集后,處死大鼠,收集大鼠的視網(wǎng)膜組織,分為兩部分,每部分包含6只大鼠的視網(wǎng)膜組織(雙眼),一部分(6只12眼)固定于40 g·L-1多聚甲醛溶液中用于HE和TUNEL染色,另一部分(6只12眼)儲存在-80 ℃中用于ELISA、Western blot及氧化應激指標的檢測。

1.2.4 HE染色檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理變化

取出固定在40 g·L-1多聚甲醛溶液中的每組6只大鼠雙眼的視網(wǎng)膜組織,將固定的組織包埋在石蠟中,然后切片。HE染色后,顯微鏡下觀察切片,分析各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理損傷情況。

1.2.5 TUNEL染色檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中神經(jīng)節(jié)細胞凋亡

取1.2.4中的視網(wǎng)膜組織切片,用二甲苯脫蠟,并用梯度乙醇水化,用磷酸鹽緩沖溶液洗3次后,將組織切片置于蛋白酶K溶液中,并在室溫下孵育 20 min。切片用無菌水洗滌2次,加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸反應液,4 ℃孵育過夜。加入約50 μL封閉溶液并在37 ℃的潮濕箱中孵育30 min。磷酸鹽緩沖溶液洗3次后加入DAPI,甘油緩沖液封片。使用熒光顯微鏡觀察大鼠視網(wǎng)膜組織中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡情況。

1.2.6 ELISA檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA、TNF-α、IL-6、cAMP水平

嚴格按照試劑盒說明書步驟檢測每組另外6只大鼠雙眼視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA、TNF-α、IL-6、cAMP水平。SOD、MDA、TNF-α、IL-6、cAMP水平通過雙抗體夾心法測定。

1.2.7 Western blot檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、P53、p-PKA蛋白表達

取1.2.6中的視網(wǎng)膜組織,使用RIPA裂解緩沖液提取每組另外6只大鼠雙眼的視網(wǎng)膜組織勻漿總蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)進行定量、電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入一抗Bax(1：2 000)、P53(1：2 000)、p-PKA(1：2 000)、PKA(1：2 000)、GAPDH(1：2 000)在4 ℃孵育過夜,加入HRP標記山羊抗兔二抗(1：1 000)孵育1 h,ECL試劑顯影后,使用ImageJ軟件對目的蛋白條帶進行定量分析,以GAPDH為內(nèi)參對照標準化Bax、P53蛋白表達,以PKA為內(nèi)參對照標準化p-PKA蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析,各組大鼠血糖、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率、SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平及Bax、P53、cAMP、p-PKA蛋白表達水平均以均數(shù)±標準差表示。單因素方差分析用于分析多組數(shù)據(jù)間的差異,方差齊時,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗,檢驗水準:α=0.05。

2 結果

2.1 EVO對各組大鼠血糖的影響

各組大鼠血糖比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與NC組比較,Model組大鼠血糖升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與Model組比較,EVO-L組、EVO-M組、EVO-H組、CD組大鼠血糖均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);與Model組比較,SQ22536組大鼠血糖升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與EVO-H組比較,EVO-H+SQ22536組大鼠血糖升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血糖及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率比較

2.2 EVO對各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理的影響

NC組大鼠視網(wǎng)膜細胞形態(tài)正常;與NC組比較,Model組大鼠視網(wǎng)膜細胞紊亂,視網(wǎng)膜厚度變薄,毛細血管內(nèi)膜增生,基底膜增厚,神經(jīng)節(jié)細胞減少,神經(jīng)纖維層空泡變性。與Model組比較,EVO-L組、EVO-M組、EVO-H組、CD組大鼠視網(wǎng)膜組織病理損傷減輕;與Model組比較,SQ22536組大鼠視網(wǎng)膜組織病理損傷嚴重;與EVO-H組比較,EVO-H+SQ22536組大鼠視網(wǎng)膜組織病理損傷加劇(圖1)。

圖1 HE染色檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理變化

2.3 EVO對各組大鼠視網(wǎng)膜組織中神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的影響

各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與NC組比較,Model組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與Model組比較,EVO-L組、EVO-M組、EVO-H組、CD組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);與Model組比較,SQ22536組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與EVO-H組比較,EVO-H+SQ22536組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2、表1)。

圖2 TUNEL染色檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中神經(jīng)節(jié)細胞凋亡情況

2.4 EVO對各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平的影響

各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。與NC組比較,Model組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD水平降低,MDA、TNF-α、IL-6水平均升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);與Model組比較,EVO-L組、EVO-M組、EVO-H組、CD組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD水平均升高,MDA、TNF-α、IL-6水平均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);與Model組比較,SQ22536組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD水平降低,MDA、TNF-α、IL-6水平均升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);與EVO-H組比較,EVO-H+SQ22536組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD水平降低,MDA、TNF-α、IL-6 水平均升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平比較

2.5 EVO對各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、P53蛋白及cAMP/PKA信號通路相關蛋白表達的影響

各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、P53、cAMP水平、p-PKA蛋白表達比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。與NC組比較,Model組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、P53蛋白表達升高,cAMP水平、p-PKA蛋白表達降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);與Model組比較,EVO-L組、EVO-M組、EVO-H組、CD組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、P53蛋白表達降低,cAMP水平、p-PKA蛋白表達升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);與Model組比較,SQ22536組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、P53蛋白表達升高,cAMP水平、p-PKA蛋白表達降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);與EVO-H組比較,EVO-H+SQ22536組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、P53蛋白表達升高,cAMP水平、p-PKA/PKA蛋白表達降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(圖3、表3)。

A:NC組;B:Model組;C:EVO-L組;D:EVO-M組;E:EVO-H組;F:CD組;G:SQ22536組;H:EVO-H+SQ22536組。圖3 Western blot檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、P53、p-PKA、PKA蛋白表達

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、P53、cAMP水平、p-PKA/PKA蛋白表達比較

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變作為糖尿病最嚴重的微血管病變并發(fā)癥之一,嚴重威脅著患者的視力,并可能導致失明[15]。據(jù)報道,糖尿病病程延長可導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞大量凋亡甚至死亡,神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量減少。神經(jīng)節(jié)細胞軸突形成視神經(jīng),神經(jīng)節(jié)細胞損傷會影響患者的視力[16];炎癥會引發(fā)一系列細胞異常,最終導致視網(wǎng)膜組織損傷,TNF-α、IL-6作為促炎介質(zhì),廣泛參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制[17];SOD、MDA作為常見的評估氧化應激的指標,已有研究顯示,在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD水平降低,MDA水平升高[18]。本研究以腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病視網(wǎng)膜病變模型,結果顯示,與NC組比較,Model組大鼠血糖升高,視網(wǎng)膜細胞紊亂,視網(wǎng)膜厚度變薄,毛細血管內(nèi)膜增生,基底膜增厚,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞減少,神經(jīng)纖維層空泡變性,表明糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型構建成功。此外,本研究結果表明,與NC組比較,Model組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率、MDA、TNF-α、IL-6水平、凋亡相關蛋白(Bax、P53蛋白)表達均升高,SOD水平降低,表明視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡、炎癥反應及氧化應激參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜損傷過程。提示抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡、炎癥反應及氧化應激可能是改善糖尿病視網(wǎng)膜病變的有效策略之一。

EVO是一種從吳茱萸中提取的生物堿,具有多種藥理活性,包括降血脂、降血糖、抗炎、抗感染和抗腫瘤等作用[19]。據(jù)報道,EVO對高葡萄糖引起血管內(nèi)皮細胞炎性損傷具有改善作用[20];EVO可減輕胃潰瘍模型大鼠胃黏膜組織損傷和炎癥浸潤,降低血清TNF-α、IL-6水平,減少胃黏膜上皮細胞凋亡數(shù)量,增加胃黏膜組織SOD水平,降低MDA水平[21]。以上研究表明,EVO具有抑制細胞凋亡、炎癥反應及氧化應激的作用。本研究結果與其一致,本研究結果顯示,EVO可抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡、炎癥反應及氧化應激,提示EVO可能是治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的潛在有效藥物。

cAMP/PKA信號通路是經(jīng)典的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路之一,cAMP通過將PKA磷酸化為p-PKA,從而引起細胞效應[22]。已有研究表明,糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展可能由高血糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜組織中cAMP含量降低所致[23];PKA可抑制高糖條件下培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞炎癥反應[24]。本研究結果與其一致,本研究結果表明,與Model組比較,SQ22536組大鼠視網(wǎng)膜組織中cAMP水平、p-PKA/PKA蛋白表達降低,糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡、炎癥反應及氧化應激增強,表明cAMP/PKA信號通路確實參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜損傷過程。此外,本研究結果還表明,低、中、高劑量EVO處理后,糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜組織中cAMP水平、p-PKA/PKA蛋白表達升高,且呈劑量依賴性,推測EVO可能通過激活cAMP/PKA信號通路改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜損傷。為了驗證該推測,本研究用高劑量EVO和cAMP抑制劑SQ22536同時處理糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠,結果顯示,SQ22536減弱了高劑量EVO對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜損傷的改善作用。證實了猜想的正確性,即EVO可能通過激活cAMP/PKA信號通路抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡、炎癥反應及氧化應激,進而發(fā)揮對大鼠的保護作用。

4 結論

EVO可能通過激活cAMP/PKA信號通路改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜損傷。該研究可能為糖尿病視網(wǎng)膜病變的臨床治療提供新的參考依據(jù)。然而,EVO改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜損傷涉及的機制較為復雜,具體通過cAMP/PKA信號通路下游的哪些蛋白來發(fā)揮作用有待后續(xù)實驗進一步深入探究。