王瑞玲,王雪妍,王菲菲,孔維怡,毛永霞,劉 欣,丁 輝,許立華,郭延生

(寧夏大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,銀川 750021)

奶牛圍產(chǎn)期(產(chǎn)前21 d～產(chǎn)后21 d)代謝機(jī)能會(huì)發(fā)生顯著改變,大約50%產(chǎn)后奶牛在圍產(chǎn)期會(huì)經(jīng)歷一種或多種生殖道系統(tǒng)炎癥或代謝病,如奶牛胎衣不下、子宮內(nèi)膜炎和酮病等[1]。奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛圍產(chǎn)期常見的生殖系統(tǒng)疾病,也是奶牛飼養(yǎng)管理中常見的疾病,可導(dǎo)致奶牛不孕,產(chǎn)奶量降低,繁殖力和生產(chǎn)效益下降[2],對(duì)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。奶牛子宮內(nèi)膜炎在病程上分為急性和慢性子宮內(nèi)膜炎,而大多數(shù)產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎都是急性子宮內(nèi)膜炎[3]。造成奶牛產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的病因復(fù)雜,至今尚無有效的預(yù)防手段,其發(fā)生機(jī)制也有待于進(jìn)一步深入研究。Putman等[4]研究發(fā)現(xiàn)氧化脂質(zhì)與產(chǎn)后奶牛炎性疾病的高發(fā)密切相關(guān)。氧化脂質(zhì)是多不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物,是有效的可溶性炎癥介質(zhì),在炎癥反應(yīng)、免疫防御和代謝應(yīng)激等生命活動(dòng)中起著非常重要的調(diào)控作用[5],衍生自ω-6(n-6系列)不飽和脂肪酸(PUFA)的氧化脂質(zhì),如花生四烯酸可促進(jìn)炎性反應(yīng)。相反,來源于ω-3(n-3系列)PUFA的氧化脂質(zhì),包括二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸,與抗炎作用有關(guān)[6]。Luo等[7]采用廣靶代謝組技術(shù)對(duì)奶牛血液代謝物的變化規(guī)律進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)與氧化脂質(zhì)相關(guān)的亞油酸、花生四烯酸和γ-亞麻酸等代謝產(chǎn)物在產(chǎn)后明顯上調(diào),但氧化脂質(zhì)的變化是否與產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生密切相關(guān),還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。脂質(zhì)組學(xué)是基于分析化學(xué)和質(zhì)譜聯(lián)用的方法,尋找與代謝調(diào)控密切相關(guān)的脂質(zhì)標(biāo)志物,可以通過研究生物體脂代謝物的變化,揭示機(jī)體內(nèi)不同脂質(zhì)與疾病的關(guān)系,進(jìn)而探討其可能的作用機(jī)制[8]。目前尚未見到采用脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎奶牛血漿氧化脂質(zhì)水平變化的相關(guān)報(bào)道。因此本試驗(yàn)采用UPLC-MS/MS脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎奶牛血漿氧化脂質(zhì)的變化規(guī)律,并通過通路富集分析探討了氧化脂質(zhì)參與產(chǎn)后急性奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的可能機(jī)制,以期從氧化脂質(zhì)角度揭示產(chǎn)后奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

甲醇(Merck,色譜純,濟(jì)南澤盛化工有限公司)、乙腈(Merck,色譜純,南京鑫旭生物科技有限公司)、乙酸(Merck,色譜純,南京鑫旭生物科技有限公司)、異丙醇(Merck,色譜純,南京鑫旭生物科技有限公司)、LC-MS/MS(QTRAP 6500+,SCIEX)、離心機(jī)(5424R,Eppendorf)、超聲清洗儀(KQ5200E,昆山舒美)、ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與分組

奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的痊愈標(biāo)準(zhǔn):奶牛子宮角大小對(duì)稱,無病理性子宮分泌物、陰道中有少量透明黏液[9]。診斷標(biāo)準(zhǔn):陰道黏液中含有50%左右黏膿性物質(zhì);細(xì)胞學(xué)檢查時(shí)陰道黏液中的中性粒細(xì)胞比例大于18%。排除標(biāo)準(zhǔn):試驗(yàn)開始前一個(gè)月有用藥記錄;患有其他產(chǎn)后疾病,例如胎衣不下、產(chǎn)后陰門炎與陰道炎、子宮內(nèi)翻及脫出、乳房炎、酮病等。依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)選取7頭產(chǎn)后7 d患有子宮內(nèi)膜炎的奶牛,治療前視為試驗(yàn)組(E),治療痊愈后視為對(duì)照組(C)。

患有子宮內(nèi)膜炎的奶牛臨床癥狀表現(xiàn)為體溫升高,食欲減退,精神萎靡,反芻減弱,常做排尿姿勢(shì),陰門流出灰白色黏液,并帶有臭味,臥地時(shí)排出量增多,子宮頸黏膜充血,子宮角增大。廣譜土霉素靜脈注射治療子宮內(nèi)膜炎,劑量3 g,隔日一次,連用2～3次。經(jīng)治療14 d后奶牛體溫恢復(fù)正常,食欲和精神狀況良好,子宮分泌物透明無異味。

1.3 血漿樣本采集與預(yù)處理

在產(chǎn)后7 d晨飼前用含肝素鈉的一次性真空采血管對(duì)奶牛尾根靜脈采血10 mL,4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min,吸取上清;在奶牛痊愈后的第7天,用同樣方法采集健康奶牛的血液,將收集到的兩組血液用干冰低溫送到武漢邁特維爾生物科技有限公司進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析。首先將100 μL的血漿樣品(均勻的旋渦)加入200 μL的甲醇進(jìn)行萃取;樣品渦旋5 min之后低溫放置沉淀蛋白;在每個(gè)樣品中添加1 μmol·L-1的內(nèi)標(biāo)混合溶液20 μL,渦旋10 min;在4 ℃條件下5 000 r·min-1離心10 min;用相同條件提取兩次,收集上清液混合;將固相萃取柱活化平衡后、進(jìn)行上樣、淋洗、洗脫、再進(jìn)行收集洗脫液;最后將洗脫液濃縮干燥,再將其與100 μL的甲醇/水(1∶1)溶液混合,并在渦旋30 s后,將上清液提取出來,進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.4 炎性因子的測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血漿中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10的水平,所有試驗(yàn)步驟分別按TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 色譜質(zhì)譜條件

1.5.1 超高效液相(UPLC)色譜條件 色譜柱采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(1.8 μm,100 mm×2.1 mm),柱溫設(shè)為40 ℃,進(jìn)樣量為10 μL;流動(dòng)相A:乙腈/水(60/40),含0.002%乙酸;流動(dòng)相B:乙腈/異丙醇(50/50);梯度洗脫條件見表1。

表1 UPLC洗脫梯度Table 1 UPLC elution gradient

1.5.2 串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)采集條件 電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)溫度設(shè)為550 ℃,質(zhì)譜電壓為-4 500 V,簾氣(curtain gas, CUR)為35 psi,根據(jù)去簇電壓和碰撞能掃描檢測(cè)每個(gè)離子對(duì)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

1.6.2 氧化脂質(zhì)的定性和樣本質(zhì)控分析 購買標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建氧化脂質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,對(duì)血漿樣品中的氧化脂質(zhì)進(jìn)行定性分析。質(zhì)控樣本(quality control,QC)由樣本提取物混合制備而成,在分析過程中,每隔10個(gè)檢測(cè)分析樣本插入一個(gè)質(zhì)控樣本,分析QC樣本的離子流(TIC)重疊圖,以監(jiān)測(cè)分析過程的重復(fù)性。

1.6.3 氧化脂質(zhì)的定量分析 通過三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)控模式(multiple reaction monitoring,MRM)對(duì)樣品中氧化脂質(zhì)進(jìn)行定量分析。配制0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1、2、4、10、20、40、100、200、400 nmol·L-1氧化脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液,獲取各個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)應(yīng)定量信號(hào)的質(zhì)譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù);以外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)濃度比(concentration ratio)為橫坐標(biāo),外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)峰面積比(area ratio)為縱坐標(biāo),繪制各氧化脂質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將檢測(cè)到的所有樣本的積分峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程進(jìn)行計(jì)算,獲得積分峰面積比值濃度值,將該濃度值代入氧化脂質(zhì)含量計(jì)算公式,最終得到實(shí)際樣本中各氧化脂質(zhì)的絕對(duì)含量。氧化脂質(zhì)含量計(jì)算:X=c*V/V0,其中X為樣本中氧化脂質(zhì)的含量(nmol·L-1),c為樣本中積分峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的濃度值(nmol·L-1),V為復(fù)溶時(shí)所用溶液的體積(μL),V0為稱取的樣本體積(μL)。

1.6.4 血漿差異氧化脂質(zhì)的篩選與通路富集分析 獲得各氧化脂質(zhì)在每個(gè)樣品中的含量數(shù)據(jù)后,采用主成分分析(principal component analysis, PCA)法判斷兩組血漿氧化脂質(zhì)的代謝輪廓的差異,在此基礎(chǔ)上,采用正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)法篩選差異氧化脂質(zhì),根據(jù)OPLS-DA模型中變量重要性投影(variable importance in projection, VIP)值,選取VIP≥1的代謝物,同時(shí)結(jié)合單變量分析的差異倍數(shù)值(fold change, FC),進(jìn)一步篩選FC≥2或FC≤0.5且P<0.05的氧化脂質(zhì)視為兩組差異氧化脂質(zhì),將差異氧化脂質(zhì)導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0軟件進(jìn)行聚類分析以驗(yàn)證所篩選的差異氧化脂質(zhì)的可靠性,并通過脂質(zhì)代謝數(shù)據(jù)庫(https://lipea.biotec.tu-dresden.de/analyze)進(jìn)行通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 血漿中炎性細(xì)胞因子測(cè)定

如圖1所示,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組奶牛血漿中TNF-α、IL-1、IL-8、IL-10的含量極顯著升高(P<0.01),IL-6水平顯著升高(P<0.05)。

2.2 血漿樣本定性及質(zhì)控分析

血漿樣品MRM多峰圖見圖2,展示了樣本中能夠檢測(cè)到的物質(zhì),不同顏色的色譜峰代表檢測(cè)到的不同氧化脂質(zhì)。通過與氧化脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫比對(duì),兩組奶牛血漿中共鑒定出43種脂質(zhì)代謝物,其中花生四烯酸及其代謝物23個(gè),亞油酸及其衍生物5個(gè),亞麻酸及其衍生物6個(gè),二十碳五烯酸及其代謝物6個(gè),二十二碳六烯酸有3個(gè)(表3)。由血漿樣本質(zhì)譜檢測(cè)TIC重疊圖(圖3)可知,氧化脂質(zhì)檢測(cè)總離子流的曲線重疊性高,表明檢測(cè)期間儀器分析系統(tǒng)穩(wěn)定可靠,可為后續(xù)的分析提供保證。

*. P<0.05,**. P<0.01圖1 炎性細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果Fig.1 Measurement results of inflammatory cytokines

圖2 血漿MRM代謝物檢測(cè)多峰圖Fig.2 Multimodal diagram of plasma MRM metabolite detection

圖3 奶牛血漿樣本質(zhì)譜檢測(cè)TIC重疊圖Fig.3 Overlay of TIC detected by mass spectrometry in dairy cow plasma samples

表2 43種血漿代謝物標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves of 43 plasma metabolites

(續(xù)表2 Continued)

(續(xù)表2 Continued)

2.3 子宮內(nèi)膜炎奶牛血漿氧化脂質(zhì)代謝輪廓和差異氧化脂質(zhì)的篩選

采用PCA法對(duì)C、E兩組奶牛血漿樣本進(jìn)行氧化脂質(zhì)代謝輪廓分析,如圖4所示,C組與E組代謝輪廓存在明顯差異,這說明產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎奶牛血漿氧化脂質(zhì)水平發(fā)生了顯著變化。為了進(jìn)一步篩選兩組差異氧化脂質(zhì),建立了OPLS-DA模型,模型評(píng)價(jià)參數(shù)Q2=0.538,R2Y=0.722(Q2≥0.4且R2Y≤1,表明模型具有可靠性),表明模型可靠,可用于篩選差異代謝物。如圖5所示,OPLS-DA模型能明顯將C,E兩組區(qū)分開。將OPLS-DA模型中VIP≥1的氧化脂質(zhì),視為候選差異氧化脂質(zhì),通過差異倍數(shù)(fold change, FC)進(jìn)一步篩選FC≥2或FC≤0.5且P<0.05的氧化脂質(zhì),視為兩組最終的血漿差異氧化脂質(zhì)。共篩選出了10個(gè)差異氧化脂質(zhì),其中4種含量上調(diào),6種含量下調(diào)。差異氧化脂質(zhì)的名稱、含量、平均含量、VIP值、P值、FC值及變化趨勢(shì)見表3和圖6。各氧化脂質(zhì)在兩組中的變化趨勢(shì)見圖7。

圖4 對(duì)照組(C組)對(duì)試驗(yàn)組(E組)血漿總體樣本PCA得分圖Fig.4 The control group (C group) versus the experimental group (E group) plasma total sample PCA score chart

圖5 血漿總體樣本OPLS-DA得分圖(a)和驗(yàn)證圖(b)Fig.5 Plasma total sample OPLS-DA score chart (a) and verification plot (b)

圖中每一個(gè)點(diǎn)表示一種脂質(zhì)代謝物,藍(lán)點(diǎn)代表下調(diào)的差異脂質(zhì)代謝物,紅點(diǎn)代表上調(diào)的差異脂質(zhì)代謝物,灰色的點(diǎn)則代表差異不顯著的脂質(zhì)代謝物 Each point in the figure represents a type of oxidized lipid, blue dots represent down-regulated differential lipid metabolites, red dots represent upregulated differential lipid metabolites, and the gray dots represent lipid metabolites that are not significantly different圖6 血漿氧化脂質(zhì)代謝物火山圖Fig.6 Volcanic chart of plasma oxidized lipid metabolites

圖7 血漿差異脂質(zhì)代謝物小提琴圖Fig.7 Violin diagram of plasma differential lipid metabolites

2.4 差異氧化脂質(zhì)的聚類驗(yàn)證與通路富集

將篩選出的10種差異氧化脂質(zhì)進(jìn)行聚類分析,繪制熱圖(圖8),結(jié)果顯示篩選出的10種差異氧化脂質(zhì)能明顯區(qū)分C組和E組,說明篩選出的差異氧化脂質(zhì)有較強(qiáng)的可靠性。將10種差異氧化脂質(zhì)通過脂質(zhì)代謝庫進(jìn)行通路富集分析(圖9),結(jié)果顯示這10中差異氧化脂質(zhì)參與了花生四烯酸代謝通路、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)通路、PPAR信號(hào)通路、血管平滑肌收縮通路、醛固酮的合成與分泌通路和血清素能突觸通路。雖然花生四烯酸代謝通路和TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)通路為顯著富集通路[-lg(P)>0.5且pathway impact>0.05],但通過文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)PPAR信號(hào)通路和血管平滑肌收縮通路也都參與了炎癥的發(fā)生。

3 討 論

3.1 產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎奶牛炎性因子的變化

細(xì)菌感染是導(dǎo)致奶牛發(fā)生子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的主要原因。研究表明大多數(shù)炎性細(xì)胞因子在子宮內(nèi)膜炎奶牛血清中表達(dá)水平明顯升高[10-11]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎奶牛血漿中IL-1、IL-6、IL-8含量顯著升高,這與Sakai等[12]研究結(jié)果一致。TNF-α可用作奶牛子宮內(nèi)膜炎診斷標(biāo)志物[13],當(dāng)TNF-α的表達(dá)量升高時(shí),會(huì)對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生直接的影響,造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,引起子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生[14]。同時(shí),高水平的TNF-α可促進(jìn)IL-1、IL-6和IL-8的釋放[14]。IL-1具有較強(qiáng)的促炎活性,可誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子等促炎介質(zhì),導(dǎo)致炎癥事件的發(fā)生。在局部,IL-1信號(hào)的結(jié)果可導(dǎo)致粘附分子上調(diào),促進(jìn)淋巴細(xì)胞募集,隨后免疫細(xì)胞被激活,炎癥進(jìn)一步放大[15],另外,增多的IL-1還可間接增強(qiáng)子宮的收縮能力,促進(jìn)子宮內(nèi)分泌物的排出。子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6,將巨噬細(xì)胞聚集到感染部位,誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生。而IL-8是中性粒細(xì)胞的重要趨化劑,與多種炎癥性疾病(如子宮內(nèi)膜炎)相關(guān)[16]。

IL-10是最重要的抗炎細(xì)胞因子,由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的各種亞群產(chǎn)生[17]。IL-10的主要生物學(xué)功能是抑制單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞來源的腫瘤壞死因子TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8[18]。Justyna等[19]研究報(bào)道子宮內(nèi)膜炎患者的血清中IL-10水平升高,Islam等[20]證明圍產(chǎn)期胎衣不下、子宮炎、子宮內(nèi)膜炎奶牛血清中IL-10濃度明顯高于健康奶牛,可作為上述疾病早期診斷的指標(biāo)。本試驗(yàn)研究結(jié)果也顯示產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎奶牛血漿中IL-10的表達(dá)水平顯著增高,與Islam等研究報(bào)道一致。

3.2 產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎奶?；ㄉ南┧岽x通路的變化

在許多疾病中,氧化脂質(zhì)被證明可以通過影響氧化應(yīng)激的發(fā)展而調(diào)節(jié)炎癥的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸[21]。研究表明奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病率隨抗氧化能力的減弱而增加,患子宮內(nèi)膜炎的奶牛,子宮分泌物中有大量自由基產(chǎn)生,會(huì)造成機(jī)體的氧化損傷[22-23]。圍產(chǎn)期奶牛體內(nèi)氧化應(yīng)激的逐步發(fā)展是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)功能障礙的重要潛在因素,因此圍產(chǎn)期奶牛由于能量負(fù)平衡而導(dǎo)致的脂質(zhì)大量動(dòng)員參與了氧化應(yīng)激的發(fā)展[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示試驗(yàn)組奶牛血漿中氧化脂質(zhì)8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET的含量均顯著低于對(duì)照組。8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET是環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)的三種同分異構(gòu)體,而EETs是花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代謝產(chǎn)生的主要活性物質(zhì),AA和它的衍生物參與了機(jī)體的營養(yǎng)代謝、免疫、炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激[24-25]。Mavangira和Sordillo[21]發(fā)現(xiàn)11,12-EET可阻斷TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)氧化應(yīng)激和凋亡,這主要?dú)w因于EETs可介導(dǎo)抗氧化調(diào)節(jié)劑核因子相關(guān)紅細(xì)胞因子2(NrF2)來減少TNFα誘導(dǎo)的活性氧(ROS)產(chǎn)生。Yu等[26]研究報(bào)道,14,15-EET也通過抑制血紅素加氧酶抗氧化劑蛋白(HO-1)的轉(zhuǎn)錄抑制物的表達(dá)來降低氧化應(yīng)激。此外,Sacerdoti等[27]研究表明,8,9-EET、11,12-EET和14,15-EET增加胰高血糖素釋放,而患子宮內(nèi)膜炎的奶牛血漿中胰島素含量較健康奶牛低[28]。Li等[29]報(bào)道EETs可以通過阻斷核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)介導(dǎo)的鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT2)轉(zhuǎn)錄改善葡萄糖穩(wěn)態(tài),充分說明葡萄糖穩(wěn)態(tài)與氧化脂質(zhì)代謝紊亂密切相關(guān)。因此本試驗(yàn)中試驗(yàn)組奶牛血中8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET水平的降低提示奶牛產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生可能與圍產(chǎn)期奶牛氧化應(yīng)激的增強(qiáng)密切相關(guān),同時(shí)氧化應(yīng)激的增強(qiáng)還影響到了圍產(chǎn)期奶牛葡萄糖的穩(wěn)態(tài)。

表3 兩組血漿差異脂質(zhì)代謝物及相關(guān)參數(shù)Table 3 Differential lipid metabolites and related parameters between two groups of plasma

圖8 血漿差異脂質(zhì)代謝物聚類熱圖Fig.8 Clustering hat map of plasma differential lipid metabolites

圖9 差異脂質(zhì)代謝物通路富集圖Fig.9 Enrichment map of differential lipid metabolite pathways

3.3 產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎奶牛TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)的變化

本試驗(yàn)富集結(jié)果進(jìn)一步顯示,在產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎奶牛下調(diào)的8,9-EET和11,12-EET還參與了TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)通路,瞬時(shí)受體電位(TRP)通道已被證明是參與脂質(zhì)代謝和能量穩(wěn)態(tài)過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白,參與疾病的調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[30]。TRP通道可介導(dǎo)氧化應(yīng)激參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程,通過氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)TRP通道激活的治療方法可以顯著減少許多疾病過程中的組織損傷[31]。脂類物質(zhì)既可與靶向TRP通道直接作用,又可與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合,從而間接調(diào)控TRP通道的功能,因此,TRP通道是一種重要的脂類感受器,可以將輸入到各種脂類代謝通路中的信號(hào)進(jìn)行整合并解讀[32]。脂質(zhì)信號(hào)、花生四烯酸以及其他類似的多不飽和脂肪酸通過酶促或非酶促氧化反應(yīng),產(chǎn)生的類花生酸信號(hào)分子,激活瞬時(shí)受體電位香草酸亞型通道(TRPV),TRPV的激活可減輕炎癥反應(yīng)[33-34]。Thomson等[35]發(fā)現(xiàn)11,12-EET可以激活大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的TRPV4通道,8,9-EET可以激活人內(nèi)皮細(xì)胞中的TRPV4通道。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,試驗(yàn)組奶牛血漿中8,9-EET和11,12-EET的含量均顯著低于對(duì)照組,提示奶牛產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生可能與產(chǎn)后脂質(zhì)代謝紊亂,間接調(diào)控TRP通道有關(guān)。

3.4 產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎奶牛PPAR信號(hào)通路的變化

富集結(jié)果顯示,在產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎奶牛下調(diào)的14,15-EET還參與了PPAR信號(hào)通路。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)是作為配體激活轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的核受體,有PPAR-α、PPAR-β/δ和PPAR-γ三種亞型。PPAR與葡萄糖和脂質(zhì)代謝以及炎癥密切相關(guān),并且在能量穩(wěn)態(tài)中起到調(diào)節(jié)作用[36]。PPAR還在免疫細(xì)胞中表達(dá),對(duì)免疫細(xì)胞的分化具有關(guān)鍵作用。如PPAR-γ通過調(diào)控T淋巴細(xì)胞的分化,參與機(jī)體的免疫應(yīng)答[37-38]。另有研究報(bào)道指出,PPAR-γ可作為抗氧化劑,通過逆轉(zhuǎn)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激的啟動(dòng)[39-40]。PPAR配體包括多種脂肪酸,環(huán)氧合酶途徑的代謝物可以激活PPAR受體。Zhang等[41]已證明PPAR的所有亞型通過抑制促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6的基因表達(dá)發(fā)揮抗炎作用,從而改善炎癥介導(dǎo)的疾病。大量研究還表明PPAR介導(dǎo)的EETs的作用,在炎癥相關(guān)疾病中至關(guān)重要[42-44]。因此本試驗(yàn)結(jié)果提示產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生還可能與氧化脂質(zhì)介導(dǎo)的PPAR信號(hào)通路的變化相關(guān)。

3.5 產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎血管平滑肌收縮的變化

富集結(jié)果顯示,在產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎奶牛下調(diào)的14,15-EET還參與了血管平滑肌收縮通路。血管平滑肌細(xì)胞具有顯著的可塑性,可在復(fù)雜的炎癥過程中與內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的細(xì)胞間串?dāng)_中發(fā)揮作用,并且血管平滑肌細(xì)胞的收縮能力在維持血管張力方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,其收縮能力的減弱、異常的增殖和遷移參與了多種疾病發(fā)生與發(fā)展的病理過程[45-46]。EETs被假設(shè)為內(nèi)皮衍生的超極化因子,因?yàn)樗鼈兺ㄟ^Ca2+依賴性K+通道的激活來超極化和松弛血管平滑肌細(xì)胞,而且EETs可增加血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度,14,15-EET在一定條件下誘導(dǎo)的細(xì)胞外Ca2+流入與血管收縮有關(guān)[47]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示試驗(yàn)組奶牛血漿中14,15-EET的含量均顯著低于對(duì)照組,提示產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎奶牛血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度較健康牛低。因此產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生還可能與氧化脂質(zhì)介導(dǎo)的血管平滑肌收縮的變化相關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析產(chǎn)后7 d 急性子宮內(nèi)膜炎奶牛血漿氧化脂質(zhì)的變化特征,結(jié)果表明產(chǎn)后7 d 急性子宮內(nèi)膜炎奶牛血漿氧化脂質(zhì)代謝輪廓發(fā)生了顯著變化,10種氧化脂質(zhì)發(fā)生了顯著變化,其中6種上調(diào),4種下調(diào)。研究結(jié)果提示氧化脂質(zhì)可以通過調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝通路、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、PPAR信號(hào)通路、血管平滑肌收縮等代謝通路參與產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生與發(fā)展。