問榮榮 蘇鈺 高澤芳 徐夢(mèng)宇 何雯雯 王步勇

摘要 [目的]了解牡丹非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因LTP的基因特征及其編碼蛋白的生物學(xué)特性，探索其生物功能。[方法]運(yùn)用Blast、ORF-Finder、ProtParam、SignalP 4.1、ProtScale和TMHMM 2.0 Server等生物信息學(xué)軟件，分析牡丹nsLTP基因序列及其編碼蛋白的基本理化性質(zhì)、信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)、保守結(jié)構(gòu)域等，并運(yùn)用DANMAN、MEGA軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。[結(jié)果]牡丹nsLTP基因（NCBI登錄號(hào)為：JZ840269.1）序列全長為685 bp，開放閱讀框長為354 bp，編碼蛋白包含117個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為8.93，為不穩(wěn)定性蛋白。牡丹nsLTP蛋白為疏水性蛋白，含有信號(hào)肽但不含跨膜結(jié)構(gòu)域，NetPho Server預(yù)測(cè)其含有8個(gè)絲氨酸和3個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)及5個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。PsnsLTP蛋白具有植物L(fēng)TP蛋白典型結(jié)構(gòu)，即4個(gè)α-螺旋，4對(duì)二硫鍵，1個(gè)可結(jié)合和容納脂質(zhì)分子的疏水結(jié)構(gòu)。多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，PsLTP蛋白與絨毛煙草LTP蛋白（XP_009608993.1）的相識(shí)度62.7%，且進(jìn)化樹聚為同一小分支，遺傳距離較近。[結(jié)論]通過對(duì)牡丹nsLTP基因特性及蛋白結(jié)構(gòu)研究，系統(tǒng)性研究了牡丹nsLTP基因的生物信息學(xué)特性，為牡丹抗病抗逆功能基因的研究提供了依據(jù)，也為其他植物nsLTP基因研究提供了參考。

關(guān)鍵詞 牡丹；非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因LTP；蛋白結(jié)構(gòu)；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào) Q781;S685.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2024）02-0087-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.018

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Bioinformatics Analysis of Peony Non-specific Lipid Transfer Protein Gene PsLTP

WEN Rong-rong，SU Yu，GAO Ze-fang et al

（College of Agricultural and Biological Engineering，Heze University，Heze，Shandong 274015）

Abstract [Objective]In order to understand the genetic characteristics of peony non-specific lipid transfer protein gene LTP and the biological characteristics of its encoding protein，and further explore its biological functions.[Method]Bioinformatics software such as Blast，ORF-Finder，ProtParam，SignalP 4.1，ProtScale，and TMHMM 2.0 Server，were used to analyze the basic physicochemical properties，signal peptides，phosphorylation sites and conserved domains of the nsLTP gene sequence. Moreover，DANMAN and MEGA software were used for the multiple sequence alignment and phylogenetic tree construction of nLTP.[Result]The results showed that the total length of peony nsLTP gene （JZ840269.1） was 685 bp，the open reading frame length was 354 bp，the encoded protein contained 117 amino acids，and the theoretical isoelectric point was 8.93，which was an unstable protein. nsLTP protein is a hydrophobic protein with signal peptide but no transmembrane domain. NetPho Server predicted that nsLTP protein contains 8 serine and 3 tyrosine phosphorylation sites and 5 threonine phosphorylation sites. The nsLTP protein has the typical structure of plant LTP proteins including four α-helix，four pairs of disulfide bonds，and a hydrophobic structure that can bind and hold lipid molecules. Multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that PsLTP protein and LTP protein （XP_009608993-1） were 62.7% familiar，and the phylogenetic tree was clustered into the same small branch.[Conclusion]By studying the nsLTP gene characteristics and protein structure of peony，the bioinformatics characteristics of nsLTP gene of peony were systematically studied，which provided a basis for the study of disease resistance and stress resistance gene of peony，and also provided a reference for the study of nsLTP gene of other plants.

Key words Peony;Non-specific lipid transfer protein gene LTP;Protein structure;Bioinformatics

作者簡介 問榮榮（1987—），女，山西大同人，講師，博士，從事植物病理分子研究。*通信作者，副教授，博士，從事林木病理學(xué)及分子生物學(xué)研究。

收稿日期 2023-02-12

脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（lipid transfer protein，LTP）是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中的堿性小分子脂質(zhì)結(jié)合蛋白，因被認(rèn)為在體外膜間進(jìn)行脂質(zhì)轉(zhuǎn)移而命名。動(dòng)物體內(nèi)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白有特異性與非特異性之分，而植物體內(nèi)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白，因其脂轉(zhuǎn)移活性具有廣泛性和不確定性，被稱為非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（non-specific lipid transfer protein，nsLTP）。植物nsLTP是一類在高等植物中普遍存在的涉及多種脅迫相應(yīng)的可溶性蛋白，其含量非常豐富，占植物體內(nèi)總可溶性蛋白的4%左右。自1975首次在馬鈴薯塊莖中被發(fā)現(xiàn)以來，至今已發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于大麥、水稻、玉米、高粱、小麥、黑麥、綠豆、蘿卜等60余種植物中，以本本科植物居多。nsLTPs蛋白含有8個(gè)半胱氨酸殘（8CM;C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C）、2個(gè)保守的五肽基序。由4個(gè)二硫鍵連接α-螺旋、連接環(huán)和C末端區(qū)域等構(gòu)成穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)，有熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，具有一個(gè)疏水性的空腔，可以轉(zhuǎn)移多種類型的脂質(zhì)小分子。

nsLTPs是一種多功能蛋白，參與植物多種生理過程，主要涉及植物生物膜間的磷脂運(yùn)輸、信號(hào)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)和角質(zhì)的形成、表皮蠟質(zhì)的生成、生殖與發(fā)育（細(xì)胞擴(kuò)增、花粉形成、果實(shí)發(fā)育、種子萌發(fā)、根瘤形成）等。此外，越來越多研究發(fā)現(xiàn)，nsLTPs蛋白在植物免疫防御中也發(fā)揮著重要作用，包括響應(yīng)植物生物脅迫防御和非生物脅迫防御。Fan等研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)LTPs可增強(qiáng)歐洲油菜ROS清除酶活性，提高對(duì)核盤菌的抗性。Sarowar等研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因LTP的過表達(dá)增強(qiáng)了煙草對(duì)植物病原菌的抗性，并在煙草系統(tǒng)的遠(yuǎn)距離信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用。Zou等研究發(fā)現(xiàn)，玉米LTPs轉(zhuǎn)導(dǎo)擬南芥，可以提高擬南芥的鹽堿脅迫抗性。植物nsLTPs蛋白通過誘導(dǎo)免疫抑制病原菌生長，參與植物對(duì)各類病原菌的生物脅迫防御；通過信號(hào)傳導(dǎo)、植物激素協(xié)作等方式，參與植物對(duì)ABA、干旱、鹽堿、低溫等非生物脅迫防御。因此，系統(tǒng)地分析植物nsLTPs蛋白結(jié)構(gòu)、特性等生物特性，明確其在植物抗逆方面的作用，對(duì)于植物抗病抗逆研究及應(yīng)用具有重要意義。

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）屬芍藥科芍藥屬，為多年生木本落葉灌木。原產(chǎn)中國，有著有數(shù)千年的自然生長和1 600余年的人工栽培歷史，是我國特有的觀賞植物和藥用植物物種，現(xiàn)引種遍布世界各地。近年來，隨著牡丹籽油價(jià)值發(fā)掘，牡丹的用途又得到了進(jìn)一步擴(kuò)展，現(xiàn)已成為一種集觀賞、藥用、油用、食用、保健、工業(yè)用于一身的重要植物。近年來，國內(nèi)外從種質(zhì)資源調(diào)查、標(biāo)準(zhǔn)化栽培、組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、生理生化、丹皮酚提取、功能產(chǎn)品研發(fā)等方面對(duì)牡丹進(jìn)行了系統(tǒng)性研究，但關(guān)于牡丹抗逆脅迫（抗寒、抗旱、抗鹽堿、抗病蟲等）方面的系統(tǒng)性研究較少，制約了牡丹抗逆育種方面的發(fā)展。筆者從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫得到牡丹nsLTP基因cDNA序列，利用生物信息學(xué)在線軟件對(duì)牡丹nsLTP基因及其他植物nsLTPs基因進(jìn)行序列分析和功能預(yù)測(cè)，旨在為牡丹nsLTP家族基因系統(tǒng)性研究奠定基礎(chǔ)，為牡丹抗逆方面功能基因研究提供新思路，也為其他植物nsLTPs基因的功能研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

利用的牡丹nsLTP基因數(shù)據(jù)來源于美國國家生物技術(shù)信息中心（ NCBI） 數(shù)據(jù)庫，GenBank登錄號(hào)為JZ840269.1。試驗(yàn)中所涉及的其他物種nsLTPs蛋白氨基酸序列均來源于NCBI數(shù)據(jù)庫（表1）。

1.2 分析方法

利用NCBI-BLAST和NCBI-BLASTP從核苷酸及氨基酸水平分析牡丹nsLTP基因及其編碼蛋白氨基酸序列特性。利用NCBI-ORF-Finder在線軟件進(jìn)行牡丹nsLTP開放閱讀框ORF查找。EXpasy-ProtParam及SMS在線軟件預(yù)測(cè)牡丹nsLTP蛋白的氨基酸組成、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)、穩(wěn)定系數(shù)等基本理化特性。利用ProtScale在線軟件進(jìn)行nsLTP蛋白親疏水性分析。

用NetPhos 3.1 Server在線工具分析編碼蛋白的潛在磷酸化位點(diǎn)。利用TargetP-2.0 Server及WOLF PSORT在線軟件預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位信。利用SignalP-5.0 Server在線工具進(jìn)行編碼蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析。利用TMHMM Server v.2.0進(jìn)行編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析。NCBI BLASTP在線篩選同源蛋白序列，利用Bioedit軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析，用MEGA 6.0 軟件N-J鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

利用SOPMA軟件對(duì)PsLTP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。利用NCBI CDD在線預(yù)測(cè)編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。采用Swiss-model在線軟件對(duì)牡丹nsLTP蛋白進(jìn)行3D結(jié)構(gòu)同源建模預(yù)測(cè)，Swiss-pdb viewer構(gòu)建拉式構(gòu)象圖評(píng)估建模準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹PsLTP基因序列及蛋白氨基酸序列

NCBI登陸的牡丹nsLTP基因序列cDNA長度為685 bp，SMS堿基分析顯示，A有 191個(gè)（占比27.88%），T有172個(gè)（占比25.11%），G有163個(gè)（占比23.80%），C有159個(gè)（占比23.21%），GC含量占比為47.01%。ORF-Finder軟件分析顯示，牡丹nsLTP基因序列包含一段258 bp的3′-UTR，一段354 bp的開放閱讀框（ORF）和一段77 bp的5′-UTR。開放閱讀框（ORF）序列在第259～608個(gè)核苷酸區(qū)域蛋白編碼117個(gè)氨基酸。EXpasy-ProtParam軟件顯示，該蛋白分子式C510H838N138O158S12，總原子數(shù)1 656個(gè)，相對(duì)分子量為11.815 kD，理論等電點(diǎn)為8.93。此外，該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為42.67（大于40.00），屬于不穩(wěn)定性蛋白。由其氨基酸種類組分（圖1）可知，天冬氨酸（Asp）、谷氨酰胺（Gln）、谷氨酸（Glu）及苯丙氨酸（Phe）數(shù)量最少，均為2個(gè)，組分占比1.71%；絲氨酸（Ser）數(shù)量最多15個(gè)，占比12.82%。

2.2 PsLTP蛋白親/疏水性及磷酸化位點(diǎn)

利用在線軟件ProtScale對(duì)牡丹PsLTP蛋白進(jìn)行親/疏水性分析。負(fù)值表示親水，正值表示疏水，絕對(duì)值越大，表示親/疏水性越強(qiáng)。預(yù)測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，牡丹PsLTP蛋白含有親水性氨基酸30個(gè)，疏水性氨基酸79個(gè)。疏水性氨基酸數(shù)量占比高，總體平均親/疏水性值為0.354，屬于疏水性蛋白。牡丹PsLTP蛋白在Gly5～Tyr23氨基酸處具有1個(gè)明顯的疏水性峰，在Asn61～Lys75位氨基酸處具有一個(gè)明顯的親水性峰。其在第13位的丙氨酸Ala13處有最強(qiáng)疏水性峰值2.978，在第68位的脯氨酸Pro68處有最強(qiáng)的親水性峰值-1.922。

利用在線軟件NetPhos 3.1對(duì)牡丹PsLTP進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析。預(yù)測(cè)結(jié)果（表2）顯示，PsLTP氨基酸序列包含了16個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)（預(yù)測(cè)值大于0.5），其中8個(gè)位于絲氨酸（Ser，S），3個(gè)位于絡(luò)氨酸（Tyr，Y），5個(gè)位于蘇氨酸（Thr，T）。在整個(gè)氨基酸序列中，第82位氨基酸絲氨酸（Ser82）的磷酸化預(yù)測(cè)值最高為0.982，可能受磷酸化激酶激活。

2.3 PsLTP蛋白信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域

SignalP-5.0 Server在線軟件對(duì)PsLTP蛋白進(jìn)行信號(hào)肽分析，結(jié)果顯示（圖3）：牡丹PsLTP蛋白分值曲線明顯，有信號(hào)肽存在。信號(hào)肽位于第1～26位氨基酸殘基之間，預(yù)測(cè)得分為0.920。信號(hào)肽與成熟肽的剪切位點(diǎn)介于第22和第23位氨基酸殘基之間。TMHMM 2.0在線軟件分析顯示，PsLTP蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域存在。

2.4 多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹

NCBI BLAST篩選得到21個(gè)nsLTPs的同源蛋白序列（表2），利用bioedit進(jìn)行多序列比對(duì)分析（圖4）。結(jié)果顯示，多種植物nsLTPs蛋白序列的中間功能區(qū)域及Cys催化區(qū)域保守性高。牡丹nLTP蛋白（JZ840269.1）同荷花、棉花、胡楊、草棉、木棉等多種植物的nsLTPs蛋白具有同源性，與絨毛煙草XP_009608993.1同源性為62.7%。進(jìn)一步通過MEGA軟件進(jìn)行多序列比對(duì)數(shù)據(jù)，以N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4、5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，22個(gè)植物L(fēng)TPs蛋白氨基酸序列聚為2個(gè)大分支，棉花、草棉、木棉、木槿、向日葵等植物L(fēng)TPs蛋白聚為分支 Ⅰ，牡丹、絨毛煙草、肉桂、蠟梅聚為分支Ⅱ。分支Ⅱ中，牡丹LTP蛋白（JZ840269.1）與絨毛煙草LTP蛋白（XP_009608993.1）聚為一小分支，肉桂LTP蛋白（RWR92222.1）與蠟梅LTP蛋白（ACQ42222.1）聚為一小分支。

2.5 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

利用NCBI 的BLASTP 在蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫（conserved domain database）查找牡丹PsLTP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示：牡丹PsLTP蛋白存在AAI-LTSS典型結(jié)構(gòu)域（圖6），該結(jié)構(gòu)域具有α-淀粉酶抑制劑活性、脂類轉(zhuǎn)移活性以及儲(chǔ)藏蛋白功能，存在于諸多蛋白中，在植物抵御病蟲害、跨膜運(yùn)輸脂類分子及植物種子營養(yǎng)物質(zhì)貯藏等方面發(fā)揮了重要作用。

2.6 PsLTP蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

利用ExPaSy-SOPMA軟件對(duì)PsLTP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖7），結(jié)果顯示，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由45.3%的α-螺旋、43.59%的無規(guī)則卷曲、8.55%的延伸鏈和2.56%的β-轉(zhuǎn)角組成。α-螺旋及無規(guī)則卷曲是該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要成分，這些結(jié)構(gòu)對(duì)其功能有重要作用。用SWISS-MODEL對(duì)PsLTP蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，PsLTP蛋白具有非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移酶蛋白的典型結(jié)構(gòu)，Ramachan plots顯示，牡丹PsLTP蛋白的三維結(jié)構(gòu)Φ角和Ψ角位于黃色核心區(qū)域，其空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，同源建模得到的三維結(jié)構(gòu)可信度高。

3 結(jié)論與討論

植物非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白是一類在高等植物中廣泛存在的小分子堿性脂質(zhì)結(jié)合蛋白，自從1975年首次在馬鈴薯塊莖中分離出nsLTP，現(xiàn)已在水稻、豇豆、大麥、玉米等50余種植物分離出來。nsLTPs蛋白具有不同的生物學(xué)功能，在植物的很多生物進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。如植物nsLTPs蛋白參與開花植物授粉、胚胎發(fā)育、脂質(zhì)代謝、角質(zhì)層合成、固氮作用、果實(shí)成熟、細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等。隨著研究深入，更多研究發(fā)現(xiàn)，nsLTPs在植物免疫防御及抗逆方面也發(fā)揮重要作用。如部分植物nsLTPs蛋白對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒及害蟲具有抗性，參與了植物防御機(jī)制，部分植物nsLTPs蛋白通過高表達(dá)響應(yīng)低溫、干旱等非生物脅迫，參與植物抗逆。生物信息學(xué)是當(dāng)今生命科學(xué)和自然科學(xué)的核心領(lǐng)域，是后基因組世代的重要研究方法。通過生物信息學(xué)系統(tǒng)分析牡丹nsLTP蛋白結(jié)構(gòu)、特性等生物特性，明確其在植物抗逆方面的作用，旨在為牡丹nsLTP家族基因系統(tǒng)性研究奠定基礎(chǔ)，為牡丹抗逆方面功能基因研究提供新思路。

該研究根據(jù)NCBI登陸的牡丹LTP基因序列，利用生物信息學(xué)分析該基因及編碼蛋白的特性?；蛐蛄蟹治鲲@示，NCBI登陸的牡丹nsLTP基因序列cDNA長度為685 bp，GC含量占比47.01%。ORF顯示，該蛋白編碼117個(gè)氨基酸。蛋白氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，分子式C510H838N138O158S12，蛋白中絲氨酸（Ser）數(shù)量最多15個(gè)，占比12.82%。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為42.67，屬于不穩(wěn)定性蛋白。ProtScale預(yù)測(cè)蛋白含有親水性氨基酸30個(gè)，疏水性氨基酸79個(gè)。疏水性氨基酸數(shù)量占比高，屬于疏水性蛋白。NetPhos蛋白PsLTP氨基酸序列包含16個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。SignalP分析顯示，牡丹PsLTP蛋白在第1～26位氨基酸殘基之間有信號(hào)肽存在。多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，牡丹LTP與絨毛煙草XP_009608993.1同源性為62.7%，聚在同一分支上，親緣關(guān)系相對(duì)較近。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析顯示，PsLTP蛋白具有非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移酶蛋白的典型結(jié)構(gòu)，α-螺旋及無規(guī)則卷曲是該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要成分。LTP蛋白的序列及保守區(qū)結(jié)構(gòu)的相對(duì)保守性為其他植物物種的LTP基因特性及結(jié)構(gòu)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

該研究結(jié)果為深入研究牡丹LTP蛋白功能及抗逆防御機(jī)制提供了重要的基礎(chǔ)信息，為牡丹抗逆方面功能基因研究提供新思路，也為其他植物nsLTPs基因的功能研究提供借鑒。通過對(duì)牡丹LTP的生物信息學(xué)分析，為今后植物L(fēng)TP蛋白功能、載體構(gòu)建、抗逆機(jī)制、抗病育種等工作的開展奠定了良好的研究與應(yīng)用基礎(chǔ)。

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