覃東玉 任睿 孫美娣 李敏 潘麗娜

摘要 鑒定一個編碼周氏嚙小蜂谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶序列的全長基因CcGSTS1，系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，該基因與麗蠅蛹集金小蜂NvGSTS6基因具有高同源性。體外表達、純化的重組CcGSTS1可催化CDNB與GSH結(jié)合，最適反應(yīng)pH為7.0。該試驗為進一步研究周氏嚙小蜂CcGSTS1基因功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 周氏嚙小蜂；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶；系統(tǒng)發(fā)育分析；酶活

中圖分類號 Q965.9 文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）02-0093-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.019

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Cloning，Expression，Purification and Enzyme Activity of CcGSTS1 from Chouioia cunea Yang

QIN Dong-yu，REN Rui，SUN Mei-di et al

（Tianjin Normal University/Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Utilization and Protection，Tianjin 300387）

Abstract In this study，we characterized a full-length gene encoding GST sequences CcGSTS1 from C.cunea.Phylogenetic analysis showed that CcGSTS1 shared the highest identity with NvGSTS6 of Nasonia vitripennis.The recombinant CcGSTS1 showed glutathione-conjugating activity toward CDNB （1-chloro-2，4-dinitrobenzene） and GSH （Glutathione）.The optimal reaction pH value is 7.0.This study provides a foundation for further study on the function of CcGSTS1 gene in C.cunea.

Key words Chouioia cunea Yang;Glutathione S-transferases;Phylogenetic analysis;Enzyme activity

基金項目 天津市教委科研計劃項目（2019KJ089）。

作者簡介 覃東玉（1997—），女，廣西來賓人，碩士研究生，研究方向：昆蟲學(xué)。*通信作者，副教授，博士，從事昆蟲學(xué)研究。

收稿日期 2023-02-06

昆蟲的宿主適應(yīng)性及殺蟲劑抗性與解毒代謝相關(guān)蛋白密切相關(guān)，主要包括ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC）、細(xì)胞色素p450（cytochrome P450s，P450s）、羧酸酯酶（carboxylesterases，CarEs）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione s-transferases，GSTs）。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶催化谷胱甘肽（glutathione，GSH）與底物結(jié)合，增加代謝產(chǎn)物的水溶性，促進其排出體外。根據(jù)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞內(nèi)的位置，GSTs可分為3類：胞質(zhì)GSTs、微粒體GSTs和線粒體GSTs。迄今為止，在昆蟲中只發(fā)現(xiàn)了胞質(zhì)GSTs與微粒體GSTs，胞質(zhì)GSTs通常被分為至少6類：Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta和Zeta。普遍存在于原核生物和真核生物中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，除對內(nèi)源性和外源性化合物的解毒作用以外，還參與多種細(xì)胞生理生化反應(yīng)，如胞內(nèi)物質(zhì)運輸、激素的生物合成和抗氧化應(yīng)激等。此外，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶可作為氣味降解酶，在昆蟲嗅覺感受系統(tǒng)中降解氣味分子，如玉米象（Sitophilus zeamais）的SzeaGSTd1可能通過降解宿主揮發(fā)物中的辛醇，從而輔助定位宿主，煙草天蛾（Manduca sexta）觸角的性信息素敏感感受器中具有觸角特異性表達GST，可能通過滅活醛類氣味分子來保護嗅覺系統(tǒng)。

蛹寄生蜂周氏嚙小蜂（Chouioia cunea Yang）是楊忠岐等在我國篩選出的一種對美國白蛾具有高寄生率的天敵昆蟲，在美國白蛾的生物防治中起著關(guān)鍵作用。有關(guān)周氏嚙小蜂的室內(nèi)繁育，蜂種復(fù)壯，不同溫濕度對小蜂寄生率、發(fā)育歷期、成蜂壽命的影響等方面均已有詳盡研究，但有關(guān)其對殺蟲劑的解毒代謝分子機制尚缺乏研究。Li等在周氏嚙小蜂嗅覺分子機制研究中發(fā)現(xiàn)，美國白蛾蛹揮發(fā)物1-十二烯對小蜂已交配雌性具有較強的引誘性，但其誘發(fā)周氏嚙小蜂嗅覺反應(yīng)的分子機制尤其是降解機制尚不明確。筆者從周氏嚙小蜂的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因，分析該基因的序列保守性及系統(tǒng)進化關(guān)系，并克隆CcGSTS1基因，體外誘導(dǎo)、表達并純化CcGSTS1蛋白，分析該蛋白的活性，旨在為進一步分析CcGSTS1在周氏嚙小蜂解毒代謝中的作用或氣味降解中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)ハx：周氏嚙小蜂，由河南省漯河市豫中南林業(yè)有害生物天敵繁育研究中心惠贈，在實驗室接種于柞蠶蛹（Antheraea pernyi）上進行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度（25±0.5）℃，相對濕度（70±10）%，光周期14 L∶10 D。

主要試劑和工具酶：總RNA 提取試劑（RNA isolater Total RNA Extraction Reagent）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、DNA凝膠回收試劑盒（FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit）、質(zhì)粒提取試劑盒（FastPure Plasmid Mini Kit）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性內(nèi)切酶、PCR 所需 ExTaq primix 酶購自寶生物工程（大連）有限公司；引物合成及測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；其他如氯仿、異丙醇等試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

菌種及質(zhì)粒：大腸桿菌Transetta （DE3） Chemically Competent Cell、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent cell 購自北京全式金生物有限公司；原核表達載體pGEXKG1為實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

周氏嚙小蜂谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶1（CcGSTS1）堿基序列由筆者所在課題組早期全長轉(zhuǎn)錄組測序獲得。氨基酸序列由BioEdit軟件（Isis Pharmaceuticals，Carlsbad，CA）生成。應(yīng)用在線服務(wù)器（http：//www.detaibio.com/sms2/protein_iep.html）計算成熟蛋白質(zhì)的分子量及等電點。采用Signalp-5.0服務(wù)器（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）對信號肽進行預(yù)測。通過SMART服務(wù)器（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對CcGSTS1的保守結(jié)構(gòu)域進行分析。應(yīng)用MEGA 7.0軟件align by clustalW程序，選擇默認(rèn)參數(shù)進行序列對齊，采用p-distance模型對間隙進行刪除，phylogency程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 總RNA提取與cDNA合成。

取周氏嚙小蜂成蟲稱重100 mg，用液氮研磨后，按照 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent說明書提取總 RNA，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得單鏈 cDNA。

1.2.3 重組表達質(zhì)粒構(gòu)建。

根據(jù)CcGSTS1的基因序列，利用 Primer 5.0設(shè)計特異性引物（sense：CGCGGATCCATGCCTATGGAGCAGATGC，antisense： CCGCTCGAGAAATTGGGTTTTGGGTCGT）。以周氏嚙小蜂單鏈 cDNA 為模板，進行 PCR 擴增，將回收的DNA片段連接在克隆載體pMD 19-T，陽性克隆送測序驗證。用BamH Ⅰ/Xho Ⅰ 雙酶切并連接表達載體pGEX-KG，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli 菌株（Trans1-T1）感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落，擴大培養(yǎng)后利用質(zhì)粒提取試劑盒進行質(zhì)粒提取。對抽提出的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定和測序驗證。

1.2.4 重組蛋白原核表達與純化。

應(yīng)用重組質(zhì)粒pGEX-KG-GSTS1轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta（DE3） 表達菌株感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進行擴大培養(yǎng)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD為0.8～1.0，加入IPTG 至終濃度為0.4 mmol/L 進行誘導(dǎo)表達，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h。收集誘導(dǎo)表達菌體，用PBS緩沖液重懸菌體，超聲波破碎后于4 ℃下10 000 r/min 離心15 min。收集上清，與谷胱甘肽樹脂，于4 ℃層析柜結(jié)合，隨后將結(jié)合液于4 ℃下 1 200 rcf離心5 min，棄掉上清液，用PBS緩沖液進行洗滌3次，然后加入Thronbim酶，于4 ℃酶切除GST標(biāo)簽，最后加入PBS緩沖液洗脫，收集上清即為純化的蛋白，在4 ℃ 用透析袋透析去鹽（透析液 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4） 2次，每次4 h。純化后采用 BCA 法對蛋白質(zhì)進行定量。然后將10 μL純化蛋白用 SDS-PAGE 檢測，最后存至冰上放至4 ℃冰箱保存，用于酶活性檢測分析。

1.2.5 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力測定。

CcGSTS1活性測定：反應(yīng)體系包括100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.5） ，1 μg CcGSTS1蛋白，GSH 終濃度為 1 mmol/L，CDNB 終濃度為2 mmol/L，在25 ℃條件下檢測 340 nm 處的吸光值，以PBS 緩沖液作為對照。每處理重復(fù)3次，每1 min 測定1次，共測定 9 min。將所得數(shù)值經(jīng)過整理帶入公式求出酶活力。CcGSTS1活力計算公式如下：

比活力[μmol/（min·mg）]=（ △OD×V）（ ε×T×L×E）

式中：△OD為單位時間內(nèi)吸光度的變化值，V為酶促反應(yīng)體積（200 μL） ，ε 為產(chǎn)物的消光系數(shù)（ 9.6 mmol/cm），T 為反應(yīng)時間（1 min） ，L 表示光程 （1 cm），E為加入酶量（1 μg）。

pH對CcGSTS1催化活性的影響：反應(yīng)體系包括終濃度分別為2 mmol/L CDNB 和1 mmol/L GSH，1 μg目的蛋白，100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，同時將反應(yīng)體系中的100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（ pH 7.5） 替換成不同pH 梯度緩沖鹽溶液（pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 8.5、9.0、10.0、11.0、12.0的100 mmol /L Tris-HCl 緩沖液），反應(yīng)在25 ℃下進行。每處理進行3次重復(fù)。檢測在340 nm 處的吸光值，分別于1 min 和6 min各測定1次，按照上述方法測定酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 CcGSTS1蛋白序列

試驗前期全長轉(zhuǎn)錄組測序獲得CcGSTS1基因，該基因全長474 bp，編碼157個氨基酸。應(yīng)用Signalp-5.0在線服務(wù)器分析發(fā)現(xiàn)，該基因N端無信號肽，說明CcGSTS1是一種非分泌性蛋白，其成熟多肽的計算分子量為18.27 kD，理論pI為6.55。CcGSTS1 蛋白由一個短鏈接序列 （Lys69-Thr70-Lys71-Leu72-Leu73-Glu74-Leu75-Ala76-Lys77-Glu78-Lys79-Thr80） 連接其N端與C端結(jié)構(gòu)域（圖1）。

2.2 CcGSTS1與其他昆蟲GST序列比對及系統(tǒng)發(fā)育

將CcGSTS1與23種近緣昆蟲的110條GST異構(gòu)體進行多重序列比對，結(jié)果表明，CcGSTS1具有較高的序列一致性。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，CcGSTS1在Neighbor-joining樹中聚為Sigma分支，bootstrap值較高，表明CcGSTS1屬于胞質(zhì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的Sigma亞家族（圖2）。CcGSTS1與麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）的NvGSTS6和多胚跳小蜂（Copidosoma floridanum）的CfGST同源性最高（分別為65%和66%），與斑痣懸繭蜂（Meteorus pulchricornis）的MpGST1和MpGST2，二化螟盤絨繭

蜂（Cotesia chilonis）的CchiGSTS2等煙蚜繭蜂（Aphidius gifuensis 的AgGST2和AgGST3，短翅蚜小蜂Aphelinus asychis的AaGST3等Sigma家族谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶均具有較高相似性。

注：Aa.Aphelinus asychis短翅蚜小蜂；Ag.Aphidius gifuensis煙蚜繭蜂；Bk.Belonocnema kinseyi癭蜂；Cs.Ceratosolen solmsi marchali 榕小蜂；Ci.Chelonus insularis 甲腹繭蜂；Cf.Copidosoma floridanum多胚跳小蜂；Cchi.Cotesia chilonis二化螟盤絨繭蜂；Cg.Cotesia glomerata 菜粉蝶盤絨繭蜂；Da.Diachasma alloeum胡蜂；Fa.Fopius arisanus 阿里山潛蠅繭蜂；Lb.Leptopilina boulardi布拉迪小環(huán)腹癭蜂；Lh.Leptopilina heterotoma 果蠅寄生蜂；Mp.Meteorus pulchricornis斑痣懸繭蜂；Md.Microplitis demolitor毀側(cè)溝繭蜂；Nv.Nasonia vitripennis麗蠅蛹集金小蜂；Pc.Polistes canadensis 紅紙黃蜂；Pd.Polistes dominula 造紙胡蜂；Pf.Polistes fuscatus 紙巢胡蜂；Tp.Trichogramma pretiosum短管赤眼蜂；Vc.Venturia canescens倉蛾姬蜂；Vcra.Vespa crabro 黃邊胡蜂；Vv.Vespa velutina黃腳胡蜂；Vp.Vespula pensylvanica 西方黃胡蜂；Vm.Vespa mandarinia 金環(huán)胡蜂。

2.3 CcGSTS1的原核表達、純化

為進一步研究周氏嚙小蜂CcGSTS1基因功能，抽提1日齡周氏嚙小蜂總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作模板，應(yīng)用CcGSTS1基因特異性引物進行PCR擴增，采用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切，構(gòu)建pGEXKG-CcGSTS1重組質(zhì)粒。如圖3所示，隨機挑取6個單菌落，經(jīng)質(zhì)粒小量提取，雙酶切驗證，可切出471 bp外接片段，即上述質(zhì)粒構(gòu)建成功。挑選菌落1送蘇州金唯智生物科技有限公司測序正確，可用于后續(xù)蛋白表達純化。

將重組表達質(zhì)粒pGEXKG-GSTS1 轉(zhuǎn)化至 E.coli Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，加入終濃度為0.4 mmol/L 的 IPTG 后，在37 ℃ 條件下誘導(dǎo)表達4 h。收集菌體，如圖4泳道1和泳道2所示，pGEXKG空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在25 kD 處有特異條帶（載體GST蛋白標(biāo)簽），而pGEXKG-GST轉(zhuǎn)化菌在45 kD處有特異性條帶，說明融合蛋白成功表達（載體GST標(biāo)簽與周氏嚙小蜂GSTS1融合蛋白）。收集菌體經(jīng)超聲波破碎，高速離心15 min后，上清液顯示，45 kD處有特異性條帶，說明該融合蛋白是可溶性蛋白（圖4泳道3）。收集的上清液與瓊脂糖凝膠樹脂4B結(jié)合，應(yīng)用PBS 磷酸鹽緩沖液進行洗滌去雜蛋白，如圖4泳道4、5、6所示，誘導(dǎo)的融合蛋白過量，超出瓊脂糖凝膠樹脂4B的結(jié)合能力。進一步加入thrombin 凝血酶切除標(biāo)簽，利用PBS 磷酸鹽緩沖液進行洗脫可獲得不含標(biāo)簽的CcGSTS1蛋白（圖4泳道7）。進一步將純化的CCGSTS蛋白進行透析，并用于后續(xù)CcGSTS1活性分析試驗。

2.4 CcGSTS1 的酶學(xué)特性

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶催化谷胱甘肽（GSH）與底物（CDNB）結(jié)合，其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰為340 nm，酶標(biāo)儀于 25 ℃條件下，每1 min 測定一次340 nm 處的吸光值，以分析CcGSTS1酶促活性變化。如圖5所示， CcGSTS1蛋白活性較穩(wěn)定，隨時間推移，1 min反應(yīng)產(chǎn)物量與前1 min差異不大。為進一步研究該蛋白的最適反應(yīng)條件，設(shè)置一系列pH梯度，結(jié)果顯示，酸性pH和堿性pH環(huán)境均不利于CcGSTS1蛋白活性，在pH 7.0時，其酶活性達峰值（圖6）。說明該蛋白酶促反應(yīng)活性最適pH為7.0，應(yīng)用該蛋白進行體外氣味分子降解試驗時可采用該條件。

3 討論

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在昆蟲環(huán)境適應(yīng)性、解毒代謝及嗅覺感受系統(tǒng)中都起著重要作用，昆蟲的胞質(zhì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶可分成6個亞家族Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta和Zeta。筆者所在實驗室早期轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)32個周氏嚙小蜂GSTs基因轉(zhuǎn)錄本，其中5個具有全長CDS。筆者選擇具有全長CDS的一個Sigma亞家族蛋白CcGSTS1進行序列及系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，其與Sigma家族的麗蠅蛹集金小蜂NvGSTS6、斑痣懸繭蜂MpGSTS1/MpGSTS2、二化螟盤絨繭蜂CchiGSTS2等相似性較高。

為研究CcGSTS1是否能夠降解氣味，或發(fā)揮解毒作用，構(gòu)建pGEXKG-GSTS1表達質(zhì)粒，在體外表達、純化CcGSTS1蛋白，并以CDNB為底物對重組CcGSTS1酶活性進行檢測，結(jié)果表明，重組CcGSTS1可催化GSH與CDNB結(jié)合，其結(jié)合產(chǎn)物在340 nm有明顯光吸收。每隔1 min連續(xù)測量發(fā)現(xiàn)，9 min內(nèi)CcGSTS1酶活性無明顯衰減?？稍诿阜磻?yīng)體系中加入氣味分子或毒性物質(zhì)，檢測該氣味分子或毒性物質(zhì)是否對CDNB產(chǎn)生競爭性抑制作用，從而明確CcGSTS1是否對該氣味分子或毒性物質(zhì)具有結(jié)合降解作用。該研究建立了CcGSTs體外功能研究體系，為進一步研究周氏嚙小蜂谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶功能奠定基礎(chǔ)。

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