任東根,龔婷,王麗娟,關(guān)濤

1(河南科技學(xué)院 體育學(xué)院,河南 新鄉(xiāng),453000)2(河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,河南 鄭州,450046)

運(yùn)動對機(jī)體的影響是雙向的,適宜的運(yùn)動能夠提高機(jī)體的代謝能力、改善心肺功能,同時還能提高免疫調(diào)節(jié)能力,然而當(dāng)運(yùn)動強(qiáng)度或運(yùn)動量超出了機(jī)體的承受范圍,出現(xiàn)過度運(yùn)動時,易誘發(fā)機(jī)體出現(xiàn)運(yùn)動疲勞癥狀[1]。此時,機(jī)體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),使細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化平衡被打破,導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激,對機(jī)體的代謝功能和組織細(xì)胞造成一定程度損傷,進(jìn)而產(chǎn)生繼發(fā)性疾病。肝臟作為人體最大的新陳代謝器官,也是最主要的排毒器官,研究表明,肝臟易受外源刺激,同時在自身的排毒過程中易受到副代謝產(chǎn)物的氧化應(yīng)激作用[2],另外,較多學(xué)者研究認(rèn)為,機(jī)體在受到外源刺激后,體內(nèi)積累的ROS是導(dǎo)致肝臟功能紊亂和肝臟組織細(xì)胞受損的主要原因[3-4]。因此,通過添加外源活性物質(zhì)降低肝臟組織的氧化應(yīng)激水平是緩解因過度運(yùn)動導(dǎo)致肝損傷的有效方法之一。

肝臟組織內(nèi)有著較復(fù)雜的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng),以平衡細(xì)胞內(nèi)的氧化和抗氧化,這些抗氧化應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)里起著關(guān)鍵作用的是一些抗氧化蛋白和各種反應(yīng)酶類。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)是機(jī)體內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)中的樞紐,其主導(dǎo)的氧化應(yīng)激信號通路是較多學(xué)者研究的主要通路[5]。研究表明,在降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平作用上,Nrf2介導(dǎo)的信號通路起著關(guān)鍵作用,該信號通路是保護(hù)肝臟免受外源刺激損害的重要靶點(diǎn)[6-7]。腺苷酸活化蛋白激酶(adenylate-activated protein kinase,AMPK)是機(jī)體能量代謝中的一種關(guān)鍵酶,研究表明,AMPK可被外源物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS激活,進(jìn)而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化蛋白、氧化應(yīng)激酶水平,在氧化應(yīng)激系統(tǒng)中同樣起著重要作用[8]。AMPK被激活后可以誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1解偶聯(lián),Nrf2則進(jìn)入細(xì)胞核中與抗氧化應(yīng)答元件(antioxidant response element,ARE)結(jié)合,進(jìn)而啟動該應(yīng)答元件調(diào)控下游抗氧化蛋白和反應(yīng)酶基因mRNA的高表達(dá)[9],從而降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平,緩解外源物質(zhì)誘導(dǎo)的損傷。

麥冬(Ophiopogonjaponicus),百合科(Liliaceae),沿階草屬(Ophiopogon)植物,其干燥塊根入藥,為我國傳統(tǒng)中藥。目前,麥冬的主要產(chǎn)區(qū)為四川和浙江,而以四川三臺縣的川麥冬產(chǎn)量最大[10]?，F(xiàn)代藥理研究表明,麥冬含有多糖、多酚、皂苷、氨基酸等活性成分,具有保肝護(hù)肝[11]、免疫調(diào)節(jié)[12]、抑制炎癥[13]、改善心肺功能[14]、抗氧化[15]、抑制細(xì)胞凋亡[16]等作用。目前,已有研究表明,麥冬多糖可以通過提高體內(nèi)抗氧化酶活性來緩解外源物質(zhì)對機(jī)體組織的損傷作用[17],然而關(guān)于川麥冬多糖對過度運(yùn)動誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用還未見文獻(xiàn)報道,且對其具體的作用機(jī)制還不清晰,因此,本研究以AMPK/Nrf2/HO-1信號通路及氧化應(yīng)激作用為切入點(diǎn),通過建立小鼠的過度運(yùn)動疲勞模型,觀察肝臟組織的病理變化,并檢測相關(guān)生化指標(biāo)和AMPK/Nrf2/HO-1信號通路上的相關(guān)抗氧化蛋白和反應(yīng)酶mRNA的表達(dá)量,探討川麥冬多糖對過度運(yùn)動引起小鼠肝損傷的改善作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川麥冬:四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)作所提供,采集自四川省綿陽市三臺縣花園鎮(zhèn),采集塊根清洗干凈后,室內(nèi)晾干,切片,厚度在0.5 mm～1 cm,然后在50 ℃烘箱中烘干,烘干至恒重,經(jīng)中藥材粉碎機(jī)粉碎,過0.15 mm篩后,4 ℃冷藏備用。樣地環(huán)境概述如下:年均溫度為16.4 ℃,樣地海拔486 m,年無霜期為283 d,年降雨量為882.2 mm,年日照時間共計1 290 h。

SPF級昆明小鼠:65只[雄性,4周齡,體重14～16 g,許可證:SCXK(豫)2019-0002]:鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場,小鼠運(yùn)動疲勞試驗(yàn)在河南中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院開展,倫理委員會批準(zhǔn)文號:syzx202112-012;小鼠普通飼料(D12450B):成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

葡萄糖(glucose,Glc)、甘露糖(mannose,Man)、半乳糖(galactose,Gal)、木糖(xylose,Xyl)、阿拉伯糖(arabinose,Ara)、巖藻糖(fucose,Fuc)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcUA)、鼠李糖(rhamnose,Rha)等單糖標(biāo)準(zhǔn)品,Sigma公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartic transaminase,AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、蛋白質(zhì)羰基化(protein carbonylation,PCO)測定試劑盒,南京建成生物工程研究所;Invitrogen TRIzol試劑,賽默飛公司;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WF-20中藥材粉碎機(jī),中國佛山麥可酷;Delta 1-24 LCS真空冷凍干燥機(jī),德國Christ公司;MS-TS分析天平,瑞士METTLER TOLEDO公司;MCO-15AC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,日本SANYO公司;N-1210BS-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,日本Eyela公司;CKX53倒置顯微鏡,日本Olympus公司;Forma 3111 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,美國Thermo公司;SpectraMax L酶標(biāo)儀,美國Molecular Devices公司;傅立葉紅外光譜儀,美國Nicolet公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 川麥冬多糖提取與純化

采用傳統(tǒng)水提醇沉法獲得川麥冬粗多糖[18]。準(zhǔn)確稱取100 g川麥冬粉末,加入1 L體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇過夜脫脂,后離心(5 000 r/min)去除乙醇,樣品置于37 ℃烘箱中烘干。干燥后的川麥冬粉末加入900 mL的蒸餾水,95 ℃水浴2 h,5 000 r/min離心5 min,分離濾液,重復(fù)操作2次,合并濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮濾液后加入9倍體積的95%乙醇,4 ℃靜置12 h。離心收集沉淀,風(fēng)干后加入37 ℃蒸餾水,使沉淀全部溶解。采用Sevag法除去溶液中的蛋白,獲得的溶液經(jīng)7 500 Da分子質(zhì)量透析袋流水透析3 d,截留透析液,后用真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥得到川麥冬粗多糖。

準(zhǔn)確稱取2 g川麥冬粗多糖,加入20 mL蒸餾水,振蕩溶解。0.45 μm的濾膜過濾,濾液上樣于DE-52纖維素柱(4.5 cm×80.0 cm),洗脫分離,洗脫條件設(shè)定為:洗脫液為氯化鈉溶液,濃度0.5 mol/L,洗脫速度設(shè)定為1.0 mL/min,每管收集洗脫液5 mL。采用苯酚硫酸法檢測監(jiān)測多糖含量,合并洗脫峰濃縮透析,冷凍干燥,得到川麥冬多糖的半純品。準(zhǔn)確稱取半純品100 mg并用蒸餾水溶解,溶液上樣于Sephadex G-100凝膠柱(2.6 cm×100 cm)洗脫分離,洗脫檢測條件同粗多糖的分離,收集洗脫峰,濃縮并冷凍干燥,得到川麥冬多糖(Ophiopogonjaponicuspolysaccharides,POJ)。

1.3.2 POJ分子質(zhì)量測定

準(zhǔn)確稱取純化后凍干的POJ粉末0.5 g,加入帶刻度的5 mL樣品瓶中,加入用無菌蒸餾水配制的0.1 mol/L的NaNO3溶液,至5 mL刻度線,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。樣品溶液在超聲波分散器下處理3 min,待測。參考標(biāo)準(zhǔn)SH/T 1759—2007用凝膠滲透色譜法測定POJ樣品分子質(zhì)量。

1.3.3 POJ單糖組成測定

采用PMP-柱前衍生法測定POJ的單糖組成[19]。通過2 mol/L的硫酸酸解POJ,得到POJ的單糖水解溶液。POJ的單糖水解溶液中加入PMP試劑,進(jìn)行柱前衍生,0.45 μm的濾膜過濾,獲得上機(jī)液。HPLC的色譜條件設(shè)定為:流動相A為0.1 mol/L磷酸鹽(KH2PO4-NaOH,pH 7.4)緩沖液,流動線B為色譜純乙腈,體積比為A∶B=80∶20,柱溫設(shè)定為35 ℃,檢測波長250 nm,單針進(jìn)樣量為20 μL,反應(yīng)過程中流速設(shè)定為1 mL/min。

1.3.4 POJ紅外光譜檢測

通過傅立葉紅外光譜儀測定POJ的紅外光譜并比對分析其所含有的功能基團(tuán)。精確稱取POJ凍干粉末5 mg,置于干燥的研缽中,稱取1 g溴化鉀加入研缽,充分研磨后進(jìn)行壓片,最后上機(jī)掃描。掃描參數(shù)設(shè)定為:共掃描32次,分辨率設(shè)定為4 cm-1,掃描范圍限定為4 000～400 cm-1。

1.3.5 POJ電鏡掃描

取上述凍干的POJ粉末1 g,在60 ℃烘箱進(jìn)行干燥1 h,然后在真空鍍膜儀中對樣品進(jìn)行噴金鍍上一層導(dǎo)電層,固定在樣品臺上,掃描電子顯微鏡在5 000倍下自動觀察。

1.3.6 POJ抗氧化活性測定

通過測定POJ對超氧陰離子自由基、羥自由基以及DPPH自由基的清除率來評價其抗氧化能力。依據(jù)OKTAY等[20]的方法完成上述測定,準(zhǔn)確稱取10 mg POJ置于試管,加入2 mL無菌水,振蕩溶解,獲得并稀釋成0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mg/mL的工作液備用。采用質(zhì)量濃度為1 mg/mL的維生素C作為陽性對照,同一質(zhì)量濃度重復(fù)測定3次,計算清除率。

1.3.7 小鼠分組與建模

65只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,通過不負(fù)重游泳訓(xùn)練,淘汰不合格的小鼠,將剩余小鼠60只,隨機(jī)分為5組,每組12只。依次設(shè)定為安靜對照組(control group,CG)、運(yùn)動模型組(model group,MG)、川麥冬多糖運(yùn)動組(POJ,低、中、高劑量依次對應(yīng)50、100、200 mg/kg,記作POJ-L、POJ-M和POJ-H)。灌胃體積5 mL/kg,安靜對照組和運(yùn)動模型組灌胃等量的無菌生理鹽水。

CG組不進(jìn)行游泳干預(yù),MG、POJ-H,POJ-M和POJ-L組每天進(jìn)行游泳訓(xùn)練,實(shí)驗(yàn)期間,小鼠游泳訓(xùn)練之前分別進(jìn)行稱重,具體的訓(xùn)練方案為第1周每天進(jìn)行不負(fù)重游泳30 min;第2周開始每天進(jìn)行負(fù)重游泳,負(fù)重3%小鼠體質(zhì)量的鉛塊,游泳訓(xùn)練30 min;第3周每天負(fù)重3%小鼠體質(zhì)量的鉛塊,游泳40 min;第4周每天負(fù)重5%小鼠體質(zhì)量的鉛塊,全部游泳至力竭。在4周游泳期間如有小鼠無法訓(xùn)練達(dá)到規(guī)定時間,則訓(xùn)練至力竭即可。在過度運(yùn)動游泳時間期間,MG組小鼠死亡2只,POJ-M和POJ-L組各死亡1只,剩余小鼠滿足實(shí)驗(yàn)要求。

1.3.8 生理生化指標(biāo)檢測

末次游泳訓(xùn)練結(jié)束12 h后,引頸法處死小鼠,摘取小鼠眼球并取血,6 000 r/min離心8 min收集血清。完整剝離肝臟并稱重,將小鼠肝臟組織部分制成100 g/L的勻漿。按照試劑盒給出的方法測定小鼠血清中ALT、AST的含量,測定勻漿組織中SOD、CAT和GSH-Px的活性,同時測定肝臟組織中MDA和PCO的含量。參考曹智[21]的方法進(jìn)行肝臟組織染色制片,配制蘇木精染液、伊紅染液及體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸乙醇分化液,選定肝臟組織,在同一位置上切取組織塊,修整成合適大小,流水沖洗12 h,依次進(jìn)行脫水透明,包埋修塊,脫蠟復(fù)水、染色封片后,于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.9 肝臟組織AMPK/Nrf2/HO-1信號通路上相關(guān)基因mRNA的表達(dá)分析

采用Invitrogen TRIzol試劑,按照說明書方法提取小鼠肝臟組織RNA,按照TaKaRa試劑反轉(zhuǎn)錄成cDNA,參考文獻(xiàn)王僮[22]進(jìn)行三步法RT-PCR檢測AMPKα、Nrf2、HO-1、SOD、GSH-Px、CAT的mRNA表達(dá)水平,以β-actin為內(nèi)參,采用2-△△Ct法對目的基因進(jìn)行定量分析。具體的引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 POJ的分離純化和分子質(zhì)量測定

通過水提醇沉法從100 g的川麥冬粉末中,提取出川麥冬粗多糖14.48 g,得率為14.48%。2 g川麥冬粗多糖通過DE-52纖維素柱以及Sephadex G-100凝膠柱的分離洗脫,最終凍干獲得POJ干粉108 mg,計算出從川麥冬粗多糖粉末中提取到純多糖的得率為5.4%。

通過GPC軟件分析得到POJ的相對分子質(zhì)量,結(jié)果見圖1,其Z均分子質(zhì)量(Mz)為21 755 Da,z+1均分子質(zhì)量(Mz+1)為24 138 Da,重均分子質(zhì)量(Mw)為19 315 Da,最高峰值處的分子質(zhì)量(Mp)為18 140 Da,數(shù)均分子質(zhì)量(Mn)為17 005 Da。分散度D(Mw/Mn)為1.14。研究表明,不同的提取方法所得的多糖分子質(zhì)量會有較大的差異,王小梅等[23]通過不同超聲波功率提取麥冬多糖,發(fā)現(xiàn)提取的麥冬多糖分子質(zhì)量分布在幾千到幾十萬間,這與本研究通過熱水浸提的多糖分子質(zhì)量差距較大,可能原因是超聲波的能量較大,能將大分子多糖全部提取出來,而通過熱水浸提時難以提出大分子多糖,還可能是熱水可以使大分子多糖鏈斷裂變成較多的短鏈分子多糖。另外,周彬等[24]通過不同溫度浸提麥冬多糖時,發(fā)現(xiàn)隨著浸提溫度的提高,麥冬多糖的浸出率顯著升高,多糖的分子質(zhì)量隨著浸提溫度的升高而變小,通過熱水浸提的麥冬多糖分子質(zhì)量分布為4 000～19 000 Da,這與本研究提取的多糖分子質(zhì)量分布差異較小。

圖1 POJ分子質(zhì)量Fig.1 Molecular weight of POJ

2.2 POJ單糖組分分析

準(zhǔn)確稱取Glc、Man、Gal、Xyl、Ara、Fuc、GlcUA、Rha各100 mg,分別配制質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/mL的8種單糖標(biāo)準(zhǔn)液,各上樣品20 μL,以各單糖濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸,回歸方程見表2。

表2 各單糖的線性回歸Table 2 Linear regression of monosaccharides

通過PMP柱前衍生法測定了POJ的單糖組成(圖2)。圖2-A為8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖,可以看出8種單糖能夠很好得被分開,圖2-B為POJ的HPLC圖,通過與標(biāo)準(zhǔn)單糖比較,結(jié)果表明,POJ主要由Glc、Man、Gal以及少量Xyl組成,通過標(biāo)準(zhǔn)單糖的線性回歸方程,計算得出POJ的水解產(chǎn)物中Glc∶Man∶Gal∶Xyl摩爾比為4.35∶5.21∶1.34∶1。王小梅等[25-26]在對產(chǎn)地為浙江的浙麥冬多糖單糖分析時發(fā)現(xiàn)浙多糖樣品只含有葡萄糖,然而其在2013年時對其他浙江麥冬多糖的單糖組成分析時發(fā)現(xiàn)主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成,這一結(jié)果與本研究的川麥冬多糖的單糖組成較相似,可見,不同產(chǎn)地麥冬多糖的單糖組成有一定差異。

2.3 POJ的紅外光譜

A-8種單糖-PMP衍生物色譜分離圖; B-POJ-PMP衍生物色譜分離圖圖2 樣品PMP衍生化產(chǎn)物色譜圖Fig.2 Chromatograms of PMP derivatization for the samples

圖3 POJ紅外光譜吸收圖譜Fig.3 Infrared absorption spectra of POJ

2.4 POJ掃描電鏡

POJ的掃描電鏡見圖4,POJ在2 000倍電鏡下,多糖呈現(xiàn)不規(guī)則顆粒狀,顆粒表面不平整且顆粒分散不粘連。在5 000倍電鏡下,多糖顆粒上有疊加層,凹凸不平,顆粒周圍部分呈現(xiàn)鋸齒狀,另外,表面有裂紋,呈交聯(lián)式的立體結(jié)構(gòu),說明,POJ顆粒并不只是多糖片層的疊加而是通過某種結(jié)構(gòu)連接成的立體形態(tài)。

2.5 POJ的抗氧化活性

A-2 000倍;B-5 000倍圖4 POJ電鏡圖Fig.4 Electron microscope image of POJ

2.6 POJ對小鼠肝組織氧化指標(biāo)的影響

如表3所示,MG組小鼠的內(nèi)源性抗氧化酶系(SOD、CAT、GSH-Px)的活性相較于CG組均出現(xiàn)極顯著的下降(P<0.01),而MDA和PCO的含量卻極顯著的升高(P<0.01)。與MG相比,POJ-L、POJ-M、POJ-H組SOD、CAT、GSH-Px的活性均逐漸顯著升高(P<0.05),MDA、PCO含量則逐漸顯著降低(P<0.05),可見,小鼠灌胃POJ后,提高了肝臟組織抗氧化酶活性,并降低了細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化,從而緩解了細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。與POJ-L相比,POJ-M的SOD、CAT、GSH-Px的酶活性均顯著升高(P<0.05),MDA、PCO的含量進(jìn)一步顯著降低(P<0.05),POJ-H組SOD、CAT、GSH-Px的酶活性均極顯著升高(P<0.01),MDA、PCO的含量極顯著降低(P<0.01),由此可見,在提高肝臟組織抗氧化酶活性上,POJ質(zhì)量的濃度越高,細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性越強(qiáng)。

A-POJ對DPPH自由基的清除能力;B-POJ對·OH的清除能力;C-POJ對的清除能力圖5 POJ對DPPH自由基的清除能力Fig.5 Scavenging capacity of POJ to DPPH, ·OH, and

表3 POJ對小鼠肝組織氧化損傷的影響Table 3 Effects of POJ on oxidative damage of liver tissue in mice

2.7 POJ對小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST的影響

血清中ALT、AST是臨床上常用于反映肝功能異常的指標(biāo),ALT、AST存在于肝臟組織中,當(dāng)肝臟受到損傷后,則會滲透到血液,血清中轉(zhuǎn)氨酶的活性越高說明肝臟受損程度越高[28]。表4統(tǒng)計了小鼠血清中ALT和AST的濃度。與CG相比,MG組血清ALT和AST的含量顯著升高,說明過度運(yùn)動造成了小鼠肝臟嚴(yán)重?fù)p傷。與MG相比,POJ-L,POJ-M、POJ-H組小鼠血清ALT分別顯著降低了47.90%、51.16%、66.17%(P<0.05),AST分別顯著降低了20.46%、32.38%、39.69%(P<0.05)。另外與POJ-L相比,POJ-H組ALT、AST分別極顯著降低了35.07%和24.18%(P<0.01)。結(jié)果表明,POJ緩解了過度運(yùn)動對小鼠肝臟造成的損傷,且隨著POJ質(zhì)量濃度的增加,其緩解損傷效果隨之增強(qiáng)。

表4 POJ對小鼠肝功能的影響Table 4 Effects of POJ on the liver function of mice

2.8 POJ對小鼠肝臟的影響

結(jié)果如圖6所示,CG組的小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)完整(圖6-A),細(xì)胞核清晰可見,細(xì)胞質(zhì)均勻。MG組小鼠肝細(xì)胞發(fā)生腫脹(圖6-B,箭頭1),細(xì)胞核偏移(圖6-B,箭頭2),細(xì)胞間隔模糊,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的脂肪變性空泡,有大量脂質(zhì)顆粒(圖6-B,箭頭3),可見,運(yùn)動模型組肝臟細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重。小鼠灌胃POJ后,POJ-L組小鼠肝細(xì)胞核移位明顯減少(圖6-C,箭頭1),胞核裂變減少(圖6-C,箭頭2),但細(xì)胞腫脹還是較多,空泡現(xiàn)象較嚴(yán)重;POJ-M組小鼠肝細(xì)胞核逐漸清晰(圖6-D,箭頭1),核移位進(jìn)一步減少(圖6-D,箭頭2),但仍然存在一定的空泡現(xiàn)象;POJ-H組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)逐步恢復(fù)正常,胞漿豐富,空泡和濁腫變性明顯減少(圖6-E,箭頭1、2)。

A-安靜對照組(CG);B-運(yùn)動模型組(MG); C-POJ低劑量運(yùn)動組(POJ-L);D-POJ中劑量 運(yùn)動組(POJ-M);E-POJ高劑量運(yùn)動組(POJ-H)圖6 小鼠肝臟組織病理學(xué)變化Fig.6 Pathology changes of liver in mice注:比例尺=50 μm。

2.9 POJ對肝臟組織AMPK/Nrf2/HO-1信號通路上相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

AMPK/Nrf2/HO-1信號通路是研究肝臟氧化損傷的重要通路,共檢測了該信號通路上AMPKα、Nrf2、HO-1、SOD、GSH-Px、CAT六種mRNA相對表達(dá)水平(圖7)。由圖7可知,與CG相比,過度運(yùn)動組(MG、POJ-L、POJ-M、POJ-H)組中AMPKα、Nrf2、HO-1的mRNA表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01),表明過度運(yùn)動使肝臟細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了較多的ROS,從而激活了該信號通路,使下游相關(guān)基因出現(xiàn)高表達(dá);與MG相比,POJ-L、POJ-M、POJ-H組中AMPKα、Nrf2、HO-1的mRNA表達(dá)量均極顯著升高,表明POJ可進(jìn)一步提高該信號通路上相關(guān)基因的表達(dá);與POJ-L相比,POJ-M、POJ-H組中AMPKα、Nrf2、HO-1的mRNA表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的提高,可見,POJ提高AMPK/Nrf2/HO-1信號通路上相關(guān)基因的表達(dá)與濃度成正比。

A-POJ對AMPKα的mRNA表達(dá)的影響;B-POJ對Nrf2的mRNA表達(dá)的影響;C-POJ對HO-1的mRNA表達(dá)的影響圖7 POJ對AMPKα、Nrf2、HO-1的mRNA表達(dá)的影響Fig.7 The effect of POJ on the mRNA expression of AMPKα, Nrf2 and HO-1注:與CG相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01;與MG相比,△表示P<0.05,△△表示P<0.01;與POJ-L相比,#表示P<0.05,##表示P<0.01;下同。

2.10 POJ對肝臟組織抗氧化酶基因mRNA表達(dá)的影響

SOD、GSH-Px、CAT為AMPK/Nrf2/HO-1信號通路的下游抗氧化酶基因,該信號通路的激活可以促進(jìn)下游抗氧化酶相關(guān)基因的高表達(dá),從而清除細(xì)胞內(nèi)過多的ROS,維持細(xì)胞的氧化抗氧化平衡。由圖8可知,與CG相比,MG組中SOD、GSH-Px、CAT的mRNA的表達(dá)水平均略低,但不存在顯著差異(P>0.05),可見,過度運(yùn)動產(chǎn)生的大量ROS抑制了抗氧化酶基因的表達(dá),從而使肝臟組織細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài),該結(jié)果與上述抗氧化酶活性結(jié)果相應(yīng)證;與MG相比,POJ-L、POJ-M、POJ-H組中3種抗氧化酶mRNA的表達(dá)水平均極顯著升高(P<0.01),且隨著POJ質(zhì)量濃度的升高,3種抗氧化酶mRNA的表達(dá)水平均隨之顯著升高,結(jié)果表明,POJ可提高AMPK/Nrf2/HO-1信號通路的下游抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)基因的表達(dá)。

A-POJ對SOD的mRNA表達(dá)的影響;B-POJ對GSH-Px的mRNA表達(dá)的影響;C-POJ對CAT的mRNA表達(dá)的影響圖8 POJ對SOD、GSH-Px、CAT的mRNA表達(dá)的影響Fig.8 The effect of POJ on the mRNA expression of SOD, GSH-Px and CAT

3 討論

多糖是一類由一種或幾種單糖聚合而成的多聚物,明確其單糖組成及異頭碳的構(gòu)型對其生理活性的研究十分必要。ZHANG等[29]、金鑫等[30]研究認(rèn)為,多糖的單糖組成中含有少量木糖時,其抗氧化活性更強(qiáng)。本研究中分離純化后POJ的單糖組成包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖以及少量木糖,通過抗氧化活性分析表明POJ具有較高的清除自由基能力。結(jié)合紅外光譜中3 365 cm-1處的吸收峰論證出O—H的存在,可以推測POJ具有一定的還原性,具有抗氧化活性[31]。此外,相關(guān)研究證實(shí),強(qiáng)化免疫是多糖的一個重要的生理活性,而β-型異頭碳是保證此活性的重要條件之一,889 cm-1左右較小的特征吸收峰證明POJ具有β-構(gòu)型的異頭碳,說明POJ可能具有免疫強(qiáng)化的活性[32]。另有研究表明,多糖的抗氧化活性除了與多糖的單糖組成、分子構(gòu)象有關(guān),還與其分子質(zhì)量緊密相關(guān)。SU等[33]、YANG等[34]研究表明,純化后多糖的分子質(zhì)量與其生物活性之間存在密切關(guān)系,分子質(zhì)量越高,多糖的生物活性越強(qiáng),其清除自由基的能力越高,本研究提取純化后的POJ重均分子質(zhì)量為19 315 Da,數(shù)均分子質(zhì)量為17 005 Da,本研究提取純化后的POJ分子質(zhì)量相對較大,其可能具有較高的生物活性。

研究表明,過度運(yùn)動作為外應(yīng)激源,易誘發(fā)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激[7]。肝是人體最大的臟器,也是人體新陳代謝的中心,在過度運(yùn)動疲勞狀態(tài)下,肝細(xì)胞中會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物如ROS和一氧化氮(nitric oxide,NO),這些代謝產(chǎn)物被認(rèn)為是導(dǎo)致肝功能紊亂的主要元兇。細(xì)胞內(nèi)積累的ROS會攻擊體內(nèi)脂肪產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA,MDA則會使細(xì)胞膜發(fā)生氧化損傷,從而改變細(xì)胞膜的通透性,另外,ROS還會直接作用于肽鍵,使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷出現(xiàn)PCO,因此,MDA和PCO是機(jī)體氧化損傷的重要標(biāo)志[35]。SOD、GSH-Px、CAT作為機(jī)體重要的抗氧化酶系,可以清除體內(nèi)過多的ROS,降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平,保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果表明,過度運(yùn)動導(dǎo)致小鼠肝臟組織內(nèi)MDA和PCO含量顯著升高,而抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性顯著降低,在補(bǔ)充POJ后,肝臟組織內(nèi)MDA、PCO含量顯著降低,抗氧化酶活性則顯著升高,另外,還發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充的POJ劑量越高,細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性越強(qiáng),這一研究結(jié)果與李明[36]、SUN等[37]的研究結(jié)果相似。此外,FAN等[38]研究發(fā)現(xiàn)POJ能夠提高大鼠血清和心肌細(xì)胞中抗氧化酶活性,從而緩解心臟組織的氧化損傷,ZHANG等[39]研究發(fā)現(xiàn)POJ能夠提高糖尿病大鼠心臟組織抗氧化酶活性,降低MDA含量,維持機(jī)體內(nèi)抗氧化酶水平,從而改善心血管功能。這些研究和本研究結(jié)果均顯示,補(bǔ)充POJ后能明顯提高體內(nèi)抗氧化酶活性,保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷。

AMPK/Nrf2/HO-1信號通路在抗氧化、抗炎、提高免疫、保護(hù)細(xì)胞免受損傷等作用上,均發(fā)揮著重要作用。研究表明,該信號通路是機(jī)體細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平的重要信號途徑[40-41]。在肝臟的氧化應(yīng)激作用上,已有較多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),該信號通路上的Nrf2轉(zhuǎn)錄因子不僅能被外源物質(zhì)激活還能被AMPK激活,激活后的Nrf2能從二聚體中解離進(jìn)入細(xì)胞核并出現(xiàn)高表達(dá),繼而與抗氧化應(yīng)答元件ARE結(jié)合,誘導(dǎo)下游抗氧化酶基因的高表達(dá),從而降低肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)[42-43],LEE等[44]研究表明,激活肝臟組中AMPK/Nrf2/HO-1信號通路有利于緩解細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用。本研究結(jié)果顯示,運(yùn)動模型組小鼠肝臟組織中AMPKα、Nrf2、HO-1的mRNA的均出現(xiàn)了高表達(dá),可見,過度運(yùn)動作為外源物質(zhì)激活了AMPK/Nrf2/HO-1信號通路,與運(yùn)動模型組相比,在補(bǔ)充POJ后,AMPKα、Nrf2、HO-1的mRNA的表達(dá)量進(jìn)一步顯著提高。此外,運(yùn)動模型組中AMPK/Nrf2/HO-1信號通路下游抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)基因的mRNA表達(dá)量出現(xiàn)了一定程度的下降,說明此時的肝臟組織處于較嚴(yán)重的氧化應(yīng)激中,推測大量激增的ROS導(dǎo)致肝臟抗氧化水平不足以應(yīng)對,抗氧化酶活性均低于正常水平。補(bǔ)充POJ后,肝臟中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)基因的mRNA表達(dá)量均出現(xiàn)了顯著提高,說明,POJ可大大的激活A(yù)MPK/Nrf2/HO-1信號通路,促進(jìn)下游SOD、GSH-Px、CAT的mRNA的高表達(dá)。近年來較多的研究表明,機(jī)體處于疲勞狀態(tài)時,不僅肝臟組織會受到一定程度損傷,還常常伴隨著腸道菌群紊亂,腸道和肝臟看上去是體內(nèi)2個作用完全不同的器官,然而當(dāng)腸道菌群紊亂時,會增加腸道的通透性,使腸道內(nèi)的一些毒素向外滲,其經(jīng)過血液循環(huán)流向肝臟,進(jìn)一步加劇了肝臟組織的損傷[45-46]。因此,下一步將會研究POJ是否會改善過度運(yùn)動疲勞狀態(tài)下小鼠的腸道菌群,以期進(jìn)一步解析POJ對運(yùn)動疲勞小鼠的具體作用機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究通過熱水浸提并純化得到POJ,凝膠滲透色譜分析顯示POJ重均分子質(zhì)量為19 315 Da,數(shù)均分子質(zhì)量為17 005 Da。經(jīng)單糖組成分析發(fā)現(xiàn),POJ是由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖組成,摩爾比為4.35∶5.21∶1.34∶1,紅外光譜顯示POJ的異頭碳為β構(gòu)型,體外抗氧化結(jié)果表明,在一定范圍內(nèi),POJ清除自由基的能力隨著質(zhì)量濃度的增加而顯著提高。肝臟損傷模型結(jié)果顯示,POJ能顯著提高肝臟組織抗氧化酶活性,同時還具有修復(fù)肝臟細(xì)胞損傷的作用;此外,還發(fā)現(xiàn)POJ能激活A(yù)MPK/Nrf2/HO-1信號通路,提高該信號通路上抗氧化蛋白和酶基因mRNA的表達(dá);結(jié)果表明,POJ具有改善過度運(yùn)動引起小鼠肝臟氧化損傷的作用。由此可見,川麥冬多糖可作為運(yùn)動添加劑應(yīng)用于功能食品上。