楊 雯, 屈 瑋

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

地西泮(diazepam,DZP)又稱安定、苯甲二氮卓,是苯二氮卓類的一種藥物,具有抗焦慮、抗驚厥、肌肉放松、鎮(zhèn)靜和催眠等作用,臨床易于獲得使用[1-2]。DZP的作用機(jī)制一直被認(rèn)為是通過(guò)與γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)結(jié)合,增強(qiáng)GABA 對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用[3]。睡眠是健康之本,隨著社會(huì)的發(fā)展,人們生活節(jié)奏加快,工作壓力增大,越來(lái)越多的人受失眠、焦慮的困擾,但考慮到藥物長(zhǎng)期累積的不安全性,對(duì)純植物、 純中藥高度信任,因此選擇食用一些具有改善睡眠效果的特膳食品和保健食品。特膳食品是近年食品工業(yè)領(lǐng)域的一個(gè)新興產(chǎn)業(yè)[4],將改善睡眠的中藥材和食物組合在一起以實(shí)現(xiàn)保健作用,不改變傳統(tǒng)的飲食習(xí)慣,消費(fèi)者可接受性好[5]。我國(guó)《食品安全法》已明確指出：“不得向食品中非法添加任何化學(xué)藥品”[6]。由于苯二氮卓類藥物獨(dú)具的鎮(zhèn)靜催眠的特點(diǎn),常被不法商家非法添加到聲稱有改善睡眠效果的特膳食品中,尤其是網(wǎng)絡(luò)出售的睡眠類食品,以達(dá)到快速有效的目的,在失眠領(lǐng)域已經(jīng)逐漸成為應(yīng)用最廣泛的藥物。DZP用于催眠的成人每天用量是5～10 mg,但長(zhǎng)期食用可能會(huì)產(chǎn)生藥物依賴。由于特膳食品是基于功能性的產(chǎn)品,為達(dá)到其有效性,添加量一般會(huì)在微量至常量的水平[7]。 保健食品中75種非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)(BJS 201710)中規(guī)定：口服液類、硬膠囊類、軟膠囊類、片劑保健食品中非法添加DZP的檢出限分別是27、400、120、400 μg/L。

目前傳統(tǒng)檢測(cè)非法添加DZP及其類似物的方法大多是高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)[10]、液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)[11-12]、酶聯(lián)免疫吸附法[13-14]、放射免疫分析法[15]、拉曼光譜法[16-17]和毛細(xì)管電泳法[18-19]等,這些方法雖然靈敏度高、準(zhǔn)確性好,但是需要漫長(zhǎng)的前處理過(guò)程,設(shè)備操作繁瑣,對(duì)操作人員要求高,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,難以滿足市場(chǎng)監(jiān)管對(duì)大規(guī)模樣品現(xiàn)場(chǎng)篩查的需求。

免疫側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)是近幾年發(fā)展較為迅速的固相免疫層析快速檢測(cè)技術(shù),能對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性分析,由于其簡(jiǎn)便性而越來(lái)越多地被應(yīng)用于即時(shí)檢測(cè)[20-21]。免疫側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)以抗體-抗原(Ab-Ag)特異性反應(yīng)為基礎(chǔ),在毛細(xì)管作用下,樣品在層析材料上移動(dòng),液體樣品中的待測(cè)分析物與層析材料上提前標(biāo)記好的標(biāo)記物發(fā)生特異性結(jié)合,通過(guò)膠體金、熒光化合物等可目測(cè)信號(hào)標(biāo)記物的顯色而快速得到檢測(cè)結(jié)果,已被廣泛應(yīng)用于臨床和食品檢測(cè)等領(lǐng)域[22-24]。膠體金免疫層析利用膠體金標(biāo)記抗體,結(jié)合膠體金標(biāo)記、免疫分析和色譜分析等多種方法,不需要昂貴的儀器,操作簡(jiǎn)單,易于使用,可在幾分鐘內(nèi)得到結(jié)果,主要作為定性或半定量檢測(cè)手段來(lái)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[25-26]。本文將膠體金免疫側(cè)向?qū)游鰬?yīng)用于檢測(cè)非法添加在特膳食品中的DZP,樣品無(wú)需復(fù)雜前處理,易于使用,成本低,結(jié)果分析速度快,適用于大批量樣品的快速篩選。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸、檸檬酸三鈉(百靈威科技有限公司);蔗糖、碳酸鉀、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、卵清蛋白(ovalbumin,OVA)、人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);硝西泮標(biāo)準(zhǔn)品、氯硝西泮標(biāo)準(zhǔn)品、DZP標(biāo)準(zhǔn)品、奧沙西泮標(biāo)準(zhǔn)品、勞拉西泮標(biāo)準(zhǔn)品(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);地西泮抗體和包被原(中科安體生物科技有限公司);聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)底板、玻璃纖維素膜、吸水墊、硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter,NC膜)和羊抗鼠二抗(上海捷寧生物有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

Heraeus Fresco 17高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾公司);JA2003電子分析天平(上海力辰科技有限公司);A6100L單反相機(jī)(索尼有限公司);JB-3A磁力加熱攪拌器(上海雷磁有限公司);各量程移液器(芬蘭雷勃公司);101-1B恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (鑫熊發(fā)儀器有限公司);XYZ試紙條噴膜儀、CM4000試紙條切條機(jī)(美國(guó)伯樂(lè)公司);SI-0246微型旋渦混合儀(美國(guó)SI科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 膠體金的制備

膠體金的制備方法是檸檬酸三鈉還原法。將250 mL錐形瓶放置于磁力加熱攪拌器上煮沸清洗4次,然后向瓶中倒入60 mL雙蒸水,在攪拌狀態(tài)下加入850 μL、 5 g/L的氯金酸溶液,加熱至微沸后,保持1 600 r/min的攪拌轉(zhuǎn)速不變,迅速向錐形瓶中加入一定體積5 g/L的檸檬酸三鈉溶液。觀察到瓶中溶液的顏色迅速改變,呈透明-黑-酒紅色,當(dāng)錐形瓶中液體的顏色不再改變,關(guān)閉加熱開(kāi)關(guān),繼續(xù)攪拌5 min,冷卻至室溫,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備

取500 μL膠體金溶液于1.5 mL離心管中,用0.1 mol/L的碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為弱堿性,再加入1.5 μL DZP抗體振蕩反應(yīng)1 h后,加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的BSA溶液封閉多余的位點(diǎn),繼續(xù)振蕩反應(yīng)1 h,10 000 r/min離心10 min,產(chǎn)生紅色沉淀;去上清后用10% BSA 50 μL重懸即可得到地西泮的金標(biāo)抗體溶液,制備金標(biāo)墊。

1.3.3 膠體金試紙條的組裝

一個(gè)完整的試紙條由支撐底板、樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水墊5個(gè)部分組成。首先將玻璃纖維素膜切成寬度為17 mm的條狀,放置在樣品墊處理液中浸泡2 h, 26 ℃烘干備用;然后將DZP包被原、羊抗鼠二抗用10 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)分別稀釋至0.4、1.0 g/L,依次吸入噴膜儀后噴至NC膜上,作為檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線),26 ℃烘2 h至干燥;最后依次將吸水墊、NC膜和樣品墊粘貼在底板上,用切條機(jī)切割成3 mm寬的條狀。

1.3.4 試紙條的檢測(cè)

1) 可行性驗(yàn)證。對(duì)組裝好的試紙條進(jìn)行可行性驗(yàn)證,分別上樣PBS緩沖液的陰性樣品和用PBS緩沖液稀釋的100 μg/L的陽(yáng)性樣品,觀察試紙條的顯色情況。

2) 偶聯(lián)過(guò)程關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)化。在膠體金與抗體偶聯(lián)過(guò)程中,優(yōu)化抗體添加量、偶聯(lián)時(shí)調(diào)節(jié)pH值的碳酸鉀用量、重懸液的種類3個(gè)關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)參數(shù),確定最合適的抗體偶聯(lián)量、偶聯(lián)pH值條件、重懸條件。

1.3.5 靈敏度檢測(cè)

將DZP標(biāo)準(zhǔn)品溶液用PBS緩沖液稀釋到不同質(zhì)量濃度,使DZP質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L,分別滴加到試紙條上進(jìn)行測(cè)試,反應(yīng) 10 min后觀察試紙條顯線結(jié)果。

1.3.6 特異性檢測(cè)

為了驗(yàn)證該試紙條的特異性,用PBS緩沖液與DZP結(jié)構(gòu)類似的硝西泮、氯硝西泮、勞拉西泮、奧沙西泮4種苯二氮卓類藥物稀釋后,用制備好的試紙條進(jìn)行測(cè)試,判斷試紙條的特異性。

1.3.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

向某市售睡眠類特膳飲料中添加DZP標(biāo)準(zhǔn)品溶液,使樣品中DZP質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L,分別滴加到試紙條上進(jìn)行測(cè)試,反應(yīng)10 min后觀察試紙條顯線結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)原理

膠體金試紙條檢測(cè)DZP的原理如圖1所示。

圖1 用于地西泮檢測(cè)的試紙條原理

其原理基于小分子目標(biāo)物與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體的三元體系。當(dāng)溶液中不存在目標(biāo)物時(shí),金標(biāo)抗體與T線的抗原結(jié)合,T線顯線,多余的金標(biāo)抗體在毛細(xì)管力的作用下繼續(xù)向前移動(dòng),與C線的二抗結(jié)合,C線顯線;當(dāng)溶液中存在目標(biāo)物,游離的DZP與T線上包被原競(jìng)爭(zhēng)金標(biāo)抗體,隨著溶液中DZP質(zhì)量濃度的增加,T線顯色逐漸變淺直至完全消線。當(dāng)C線、T線均顯色時(shí),無(wú)論顏色深淺,保健食品中地西泮的質(zhì)量濃度都低于檢測(cè)限;當(dāng)C線顯色,而T線沒(méi)有顏色,地西泮的質(zhì)量濃度高于或等于檢測(cè)限。

2.2 可行性驗(yàn)證

可行性驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示,從圖2可以看出,僅含有加載PBS緩沖液的陰性樣品在10 min內(nèi)顯示出紅色的T線和C線,而在PBS緩沖液中含有100 μg/L DZP的陽(yáng)性樣品只能觀察到C線,而T線完全消失。顏色對(duì)比有力地證實(shí)了該試紙條可用于DZP檢測(cè)。

圖2 地西泮試紙條的陰陽(yáng)性對(duì)照

2.3 關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

對(duì)側(cè)流試紙(lateral flow strips,LFS)檢測(cè)結(jié)果至關(guān)重要的幾個(gè)參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果如圖3所示。從圖3a可以看出,向相同體積的金納米粒子(gold nanoparticles,GNPs)溶液中添加不同體積1.0 mg/mL的DZP抗體,隨著抗體量的增加,陰性T線強(qiáng)度明顯提高,C線變化不明顯,1.0 μL抗體量時(shí)的陰性T線與1.5 μL時(shí)深淺相似,抗體量繼續(xù)增加顏色不再發(fā)生明顯變化,考慮到節(jié)約原料,最終選擇偶聯(lián)抗體量為1.0 μL。免疫層析試紙條制備過(guò)程中偶聯(lián)時(shí)碳酸鉀添加量的選擇對(duì)檢測(cè)靈敏度極為重要。從圖3b可以看出,隨著碳酸鉀添加量的增加,陰性T線越來(lái)越淺,C線也逐漸變淺,最終選擇偶聯(lián)時(shí)添加的碳酸鉀量為4 μL。從圖3c可以看出,重懸液為OVA的試紙條金標(biāo)墊上的金標(biāo)偶聯(lián)物未完全釋放,重懸液為HSA的試紙條C線顏色均一,T線較其他組強(qiáng),靈敏度高,最終選擇HSA溶液作為偶聯(lián)時(shí)的重懸液。

圖3 偶聯(lián)參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果

2.4 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

制備好的膠體金試紙條可以在10 min內(nèi)肉眼觀察到結(jié)果,DZP的靈敏度檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出,隨著DZP質(zhì)量濃度的增大,T線的顯線強(qiáng)度不斷減弱,直至10.0 μg/L時(shí)T線完全消失,靈敏度可達(dá)10.0 μg/L;T線信號(hào)強(qiáng)度峰值隨著地西泮質(zhì)量濃度的增加不斷降低,直至平緩,線性良好。

圖4 DZP靈敏度檢測(cè)結(jié)果

2.5 特異性檢測(cè)結(jié)果

將硝西泮、氯硝西泮、勞拉西泮和奧沙西泮4種結(jié)構(gòu)與DZP相似的苯二氮卓類藥物用PBS緩沖液稀釋成100 μg/L的溶液,用制備的試紙條進(jìn)行檢測(cè),試紙條的特異性檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出,C線均顯線,說(shuō)明試紙條的有效性,而只有質(zhì)量濃度為10 μg/L的DZP溶液的T線消線,其他4種均有明顯的T線出現(xiàn),該結(jié)果說(shuō)明制備的試紙條有良好的選擇性。

圖5 DZP特異性檢測(cè)結(jié)果

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

考慮到實(shí)際樣品中蛋白、多肽等基質(zhì)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響,在上樣前6 300 r/min進(jìn)行7 min離心處理,添加DZP標(biāo)品使飲料中DZP質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L,分別滴加到試紙條上進(jìn)行測(cè)試,反應(yīng)10 min后靈敏度檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出,隨著地西泮質(zhì)量濃度的增大,T線的顯線強(qiáng)度不斷減弱,直至10.0 μg/L時(shí)檢測(cè)線完全消失,質(zhì)控線顯色均勻,與靈敏度檢測(cè)結(jié)果一致;T線信號(hào)強(qiáng)度峰值隨DZP質(zhì)量濃度的增加不斷降低,直至平緩,表明該試紙條可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

圖6 實(shí)際樣品的靈敏度檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié) 論

膠體金免疫側(cè)向?qū)游龇ㄊ且环N新的免疫標(biāo)記技術(shù)方法,以膠體金作為示蹤標(biāo)記物,以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ),是現(xiàn)場(chǎng)篩查的有力工具,因其簡(jiǎn)單、便攜、長(zhǎng)期穩(wěn)定性和成本低而在實(shí)際應(yīng)用中越來(lái)越受到關(guān)注[27]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了國(guó)產(chǎn)蛋白標(biāo)記的試紙條快速檢測(cè)睡眠類特殊膳食食品中違禁添加的DZP,樣品無(wú)需任何復(fù)雜的前處理,結(jié)果可在10 min內(nèi)讀出。與已報(bào)道的代表性方法相比,LFS法操作簡(jiǎn)單,易于制備,通過(guò)目視觀察,實(shí)現(xiàn)了低至10.0 μg/L的視覺(jué)檢測(cè)限,制備的試紙條特異性好,靈敏性高,可用于實(shí)際樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè),為市場(chǎng)監(jiān)管時(shí)大批量檢測(cè)提供便利。