陳 璟 ，楊小藝 陳 靜 單 鑫 汪 潔 許惠琴 ，呂志陽 （.南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院藥學(xué)院，江蘇泰州 5300；.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 003）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者常見且難治的慢性微血管并發(fā)癥，是終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）的主要病因[1]。研究顯示，DN與炎癥反應(yīng)和巨噬細(xì)胞極化密切相關(guān)，其中糖代謝異常是其炎癥發(fā)病機(jī)制之一；持續(xù)高血糖可導(dǎo)致晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）形成，而AGEs是DN發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵物質(zhì)[2]。巨噬細(xì)胞與DM 模型動(dòng)物高血糖水平、腎小球免疫復(fù)合物沉積及進(jìn)行性纖維化、趨化因子增加密切相關(guān)：一方面，M1型巨噬細(xì)胞可通過分泌促炎因子[白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等]而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，引起腎固有細(xì)胞損傷[3]；另一方面，M2型巨噬細(xì)胞則可通過分泌大量抗炎因子[IL-10、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）等]來抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮促進(jìn)損傷組織修復(fù)重建的作用[4]。

銀杏葉提取物（Ginkgobilobaextract，GBE）是從銀杏葉中提取的活性物質(zhì)，以銀杏黃酮類、銀杏內(nèi)酯類為主要活性成分，具有抗氧化、抗血小板聚集、抗血栓、改善血液循環(huán)等活性。研究指出，GBE能降低DM模型大鼠的血糖，減少炎癥因子的分泌和細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，改善腎損傷[5]；可通過蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路來預(yù)防腎纖維化，從而延緩DN 的發(fā)生發(fā)展[6]；能減少DN模型小鼠的蛋白尿，減輕腎小管損傷，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而改善其腎功能[7]?？梢?，GBE有一定的腎臟保護(hù)活性。

據(jù)國內(nèi)外研究報(bào)道，AGEs-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（the receptor of advanced glycation end products，RAGE）軸參與了巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控過程，可上調(diào)M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子IL-6、IL-1β、腫瘤細(xì)胞壞死因子α、iNOS、CD11c、CD86的表達(dá)，下調(diào)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子IL-10、Arg-1、CD206 的表達(dá)，從而介導(dǎo)DM 血管病變[8]。此外，Ras同源基因家族成員A（Ras homolog gene family member A，RhoA）/Rho 相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK）信號(hào)通路是促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M2型向M1型轉(zhuǎn)化的核心環(huán)節(jié)[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通過干預(yù)巨噬細(xì)胞極化而抑制炎癥可能是延緩DN 進(jìn)展的有效途徑[10―11]?？紤]到AGEs-RAGE/RhoA/ROCK 信號(hào)通路與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]，故本研究擬通過建立DN小鼠模型，觀察GBE 對(duì)其巨噬細(xì)胞極化和腎臟炎癥的影響，并分析其機(jī)制是否與抑制AGEs-RAGE/RhoA/ROCK信號(hào)通路有關(guān)，以期為DN的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Synergy HT型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）、Contour TS型血糖儀（德國Bayer Vital GmbH）、Ti 型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）、CKX31型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

GBE 片[批號(hào)4380420，規(guī)格為每片含GBE 40 mg（總黃酮醇苷9.6 mg、萜類內(nèi)酯2.4 mg）]購自德國Dr. Willimar Schwabe GmbH & Co. KG；鹽酸二甲雙胍片（批號(hào)ABV0983，規(guī)格0.5 g）購自中美上海施貴寶制藥有限公司；血糖試紙（批號(hào)201807）購自拜耳醫(yī)藥（上海）有限公司；血肌酐（serum creatinine，Scr）檢測試劑盒（批號(hào)20191008）購自南京建成生物工程研究所；小鼠單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、IL-10、IL-12、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為202002、202009、202005、202010）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；AGEs ELISA 試劑盒（批號(hào)202008）購自南京翼飛雪生物科技有限公司；兔β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號(hào)AP0060）購自美國Bioworld 公司；兔iNOS 多克隆抗體、山羊Arg-1 多克隆抗體、兔RAGE 多克隆抗體、兔RhoA單克隆抗體、兔重組ROCK1+ROCK2單克隆抗體（批號(hào)分別為ab15323、ab60176、ab3611、ab187027、ab45171）均購自英國Abcam 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗山羊免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)SE238）購自北京索萊寶科技有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)7074P2）購自美國CST公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

10～12 周齡的SPF 級(jí)雄性KK/Ay 小鼠（24 只）和10～12 周齡的SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠（6 只）均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2020-0004。高脂高糖飼料（含脂肪17.9%、蛋白17.5%、碳水化合物48.5%）購自北京華阜康生物科技股份有限公司，普通飼料購自南京青龍山動(dòng)物繁殖場。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)SPF 動(dòng)物中心（溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度55%），自由攝食、飲水。本研究方案遵循南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定（動(dòng)物倫理申請(qǐng)?zhí)?01903A019）。

2 方法

2.1 模型建立

檢測KK/Ay 小鼠的血糖，將血糖水平≥10 mmol/L者作為DM小鼠；高脂高糖飼料喂養(yǎng)2周后，將24 h尿蛋白升高10倍以上的DM小鼠作為DN模型小鼠[13]。

2.2 分組與給藥

將DN模型小鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對(duì)照組[二甲雙胍，200 mg/（kg·d）]以及GBE 低、高劑量組[100、200 mg/（kg·d）]，每組6只；另取以普通飼料喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠6只，作為對(duì)照組。各藥物組劑量根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)[6，14]設(shè)定，并按10 mL/kg 灌胃相應(yīng)藥液（以水為溶劑），對(duì)照組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)8周。

2.3 取樣及處理

分別于灌胃0、4、8周時(shí)，稱定各組小鼠體重，檢測并記錄其空腹血糖和24 h 攝食量、尿量。末次給藥后，于各組小鼠眼眶取血，至少靜置0.5 h 后，以3 000 r/min 離心15 min，吸取上層血清于0.5 mL EP管中，備用；同時(shí)，處死各組小鼠，分離其兩側(cè)腎臟并稱重，計(jì)算其雙側(cè)腎臟質(zhì)量與體重的比值。

2.4 小鼠血清生化指標(biāo)檢測

取“2.3”項(xiàng)下各組小鼠的血清樣品，參照相關(guān)試劑盒說明書方法操作，以酶標(biāo)儀檢測其血清中趨化因子（MCP-1）、炎癥因子（IL-12、IL-10）、腎功能相關(guān)指標(biāo)（BUN、Scr）、AGEs水平。

2.5 小鼠腎臟病理損傷和纖維化改變觀察

采用HE、Masson染色法分別進(jìn)行觀察。取“2.3”項(xiàng)下各組小鼠左側(cè)腎臟適量，分離皮質(zhì)層，橫切后置于10%甲醛固定液中固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋后切片，分別進(jìn)行HE、Masson染色，使用顯微鏡觀察其腎臟病理損傷和纖維化改變。按病變嚴(yán)重程度進(jìn)行腎損傷評(píng)分：無病變記0分，輕微病變記0.5分，輕度病變記1分，中度病變記2分，重度病變記3分；同時(shí)，使用Image J軟件對(duì)腎間質(zhì)纖維化（藍(lán)色為纖維化區(qū)域）比例進(jìn)行半定量分析[15]。

2.6 小鼠腎皮質(zhì)中巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白及AGEs-RAGE/RhoA/ROCK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測

采用Western blot法檢測。取“2.3”項(xiàng)下各組小鼠左側(cè)腎臟適量，分離皮質(zhì)層，經(jīng)裂解后，取裂解液分裝于1.5 mL EP管中，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min；收集上清液，以BCA 法測定蛋白濃度后，于95 ℃下作變性處理。取變性蛋白適量，經(jīng)電泳分離后濕法轉(zhuǎn)膜，用5% 牛血清白蛋白封閉；加入Arg-1、iNOS、RAGE、RhoA、ROCK1、β-actin一抗（稀釋比例分別為1∶15 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000、1∶5 000、1∶5 000），于4 ℃下孵育過夜；以PBST 緩沖液洗膜15 min×4 次后，加入兔抗山羊IgG 二抗、山羊抗兔IgG 二抗（稀釋比例分別為1∶10 000、1∶5 000），于室溫下孵育2 h；以PBST 緩沖液洗膜15 min×4次，以化學(xué)發(fā)光液避光顯影，并置于凝膠成像系統(tǒng)下成像。利用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度值比值作為目的蛋白的表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Graphpad Prism 9軟件作圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 GBE 對(duì)DN 模型小鼠體重、空腹血糖、攝食量及尿量的影響

灌胃0、4、8 周時(shí)，模型組小鼠的體重均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；灌胃8 周時(shí)，各藥物組小鼠的體重均顯著高于模型組（P＜0.01）。灌胃0、4、8周時(shí)，模型組小鼠的空腹血糖和24 h攝食量、尿量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；灌胃4、8 周時(shí)，各藥物組小鼠上述指標(biāo)均顯著低于模型組（P＜0.01）。結(jié)果見圖1。

圖1 GBE對(duì)DN模型小鼠體重、空腹血糖、攝食量及尿量的影響（±s，n＝6）

3.2 GBE 對(duì)DN 模型小鼠血清趨化因子和炎癥因子水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清MCP-1、IL-12水平顯著升高，IL-10 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組小鼠血清MCP-1、IL-12 水平均顯著降低，IL-10水平均顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 GBE對(duì)DN模型小鼠MCP-1、IL-12、IL-10水平的影響（±s，n＝6，pg/mL）

表1 GBE對(duì)DN模型小鼠MCP-1、IL-12、IL-10水平的影響（±s，n＝6，pg/mL）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別對(duì)照組模型組陽性對(duì)照組GBE低劑量組GBE高劑量組IL-10 297.01±25.28 194.38±20.39a 274.49±23.17b 274.63±21.61b 296.25±22.57b MCP-1 14.39±1.63 21.02±2.82a 15.48±2.37b 15.01±2.84b 13.98±2.39b IL-12 41.85±3.19 66.69±6.90a 45.88±5.43b 52.72±2.93b 45.19±5.33b

3.3 GBE對(duì)DN模型小鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清BUN、Scr水平和雙側(cè)腎臟質(zhì)量與體重的比值均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各藥物組小鼠上述指標(biāo)均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 GBE對(duì)DN模型小鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)的影響（±s，n＝6）

表2 GBE對(duì)DN模型小鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)的影響（±s，n＝6）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別對(duì)照組模型組陽性對(duì)照組GBE低劑量組GBE高劑量組雙側(cè)腎臟質(zhì)量與體重的比值/%5.32±0.04 8.99±0.07a 5.83±0.11b 5.45±0.09b 4.19±0.06b BUN/（mmol/L）17.63±2.73 34.29±4.35a 22.46±3.34b 23.53±4.29b 21.69±3.06b Scr/（μmol/L）15.35±6.32 57.15±9.82a 35.98±12.29b 35.10±6.26b 28.43±7.38b

3.4 GBE 對(duì)DN 模型小鼠腎臟病理損傷和纖維化改變的影響

對(duì)照組小鼠腎皮質(zhì)未見明顯病變，腎小球結(jié)構(gòu)完整無缺損；模型組小鼠腎皮質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)增生、肥大，并可見空泡，部分間質(zhì)區(qū)可見炎癥細(xì)胞浸潤，其腎損傷評(píng)分和腎間質(zhì)纖維化比例均較對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各藥物組小鼠腎臟損傷和纖維化均有所減輕，其腎損傷評(píng)分和腎間質(zhì)纖維化比例均較模型組顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 各組小鼠腎臟病理損傷顯微圖及腎損傷評(píng)分柱形圖（HE染色）

圖3 各組小鼠腎間質(zhì)纖維化改變顯微圖及纖維化比例柱形圖（Masson染色）

3.5 GBE 對(duì)DN 模型小鼠腎皮質(zhì)中巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎皮質(zhì)中iNOS 蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，而Arg-1 蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組小鼠腎皮質(zhì)中iNOS蛋白的表達(dá)均顯著下調(diào)，而Arg-1 蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果見圖4A、圖5。

圖4 各組小鼠腎皮質(zhì)中巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白和AGEs-RAGE/RhoA/ROCK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

圖5 GBE 對(duì)DN 模型小鼠腎皮質(zhì)中iNOS、Arg-1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝6）

3.6 GBE 對(duì)DN 模型小鼠AGEs-RAGE/RhoA/ROCK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中AGEs 水平和腎皮質(zhì)中RAGE、RhoA、ROCK1蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組小鼠血清中AGEs水平和腎皮質(zhì)中RAGE、RhoA、ROCK1（GBE低劑量組除外）蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖4B、圖6。

圖6 GBE 對(duì)DN 模型小鼠血清中AGEs 水平和腎皮質(zhì)中RAGE、RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝6）

4 討論

巨噬細(xì)胞主要通過極化來參與炎癥反應(yīng)，包括2 種作用相反的表型，分別為M1和M2型：M1型巨噬細(xì)胞主要在抗原呈遞和免疫炎癥方面發(fā)揮作用，而M2 型巨噬細(xì)胞則是通過分泌抗炎因子而發(fā)揮促進(jìn)損傷修復(fù)和抗炎的作用[4]。有學(xué)者在DN動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，2種表型巨噬細(xì)胞的失衡會(huì)加重炎癥反應(yīng)及纖維化改變[6]?；诖?，本研究通過干預(yù)巨噬細(xì)胞極化來抑制炎癥反應(yīng)，從而延緩DN的發(fā)生發(fā)展。

AGEs 可作用于腎臟的RAGE，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，介導(dǎo)腎臟系膜細(xì)胞激活以及巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向腎組織浸潤。AGEs 和RAGE 相互作用，可通過釋放MCP、細(xì)胞黏附分子、生長因子等多種細(xì)胞因子，進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化和炎癥因子分泌，在腎臟固有細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及各種細(xì)胞因子間形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，最終引發(fā)“瀑布效應(yīng)”，加快DN 的進(jìn)程[16]。RhoA/ROCK信號(hào)通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、分泌、增殖和基因表達(dá)等生物學(xué)過程，在DN 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Rao 等[17]報(bào)道，該通路可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向腎組織遷移，而阻斷腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的RhoA/ROCK 信號(hào)通路可顯著抑制AGEs 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1、細(xì)胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）的分泌，進(jìn)而減少db/db 自發(fā)性DM 小鼠腎小球中MCP-1、ICAM-1的表達(dá)和巨噬細(xì)胞的浸潤。

基于現(xiàn)有研究和本課題組前期成果，本研究以KK/Ay 小鼠為對(duì)象，建立了DN 模型；以正常C57BL/6J 小鼠為對(duì)照，以二甲雙胍為陽性對(duì)照藥物，考察了低、高劑量GBE 對(duì)DN 模型小鼠的干預(yù)效果。結(jié)果顯示，經(jīng)低、高劑量GBE干預(yù)后，DN模型小鼠的空腹血糖和24 h攝食量、尿量均有不同程度改善，體重有所增加；同時(shí)，GBE能降低小鼠血清BUN、Scr 水平和雙側(cè)腎臟質(zhì)量與體重的比值，還能降低小鼠血清AGEs水平和促炎因子IL-12水平，升高血清抗炎因子IL-10水平并降低MCP-1水平，提示GBE可改善DN模型小鼠的腎功能，并可有效減輕其炎癥反應(yīng)。HE、Masson 染色結(jié)果顯示，DN 模型小鼠的腎小球結(jié)構(gòu)不完整，并可見空泡增多、系膜基質(zhì)增生、炎癥細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象，存在明顯的腎損傷和腎間質(zhì)纖維化；而GBE 可明顯改善DN 小鼠的上述病理改變，顯著降低其腎損傷評(píng)分和腎間質(zhì)纖維化比例。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GBE 可顯著下調(diào)模型小鼠腎皮質(zhì)中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白iNOS的表達(dá)，上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白Arg-1 的表達(dá)，并顯著降低通路相關(guān)蛋白R(shí)AGE、RhoA、ROCK1的表達(dá)水平。

綜上所述，GBE 可改善DN 模型小鼠的腎損傷，并減輕其炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制AGEs-RAGE/RhoA/ROCK信號(hào)通路、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化有關(guān)。