王海波, 吳貞瑩, 郭俊云

小桐子植物特異性酪蛋白激酶基因的克隆及原核表達(dá)分析

王海波, 吳貞瑩, 郭俊云

(曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院, 云南 曲靖 655011)

酪蛋白激酶(casein kinase, CK)作為一類普遍存在的Ser/Thr蛋白激酶，通過調(diào)節(jié)靶標(biāo)蛋白的活性與穩(wěn)定性，在植物整個(gè)生理過程及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用?；谕葱蛄斜葘?duì)，該研究對(duì)小桐子()酪蛋白激酶基因家族進(jìn)行鑒定與表達(dá)分析。結(jié)果表明，小桐子基因組中共鑒定到7個(gè)酪蛋白激酶1基因()、5個(gè)植物特異性酪蛋白激酶1基因()、3個(gè)酪蛋白激酶2亞基基因(-)、2個(gè)酪蛋白激酶2亞基基因()，4個(gè)亞家族成員在氨基酸長度、等電點(diǎn)及外顯子數(shù)目等都有其家族特異性。蛋白的氨基酸序列比對(duì)表明，小桐子酪蛋白激酶1都包含N端保守激酶結(jié)構(gòu)域，同時(shí)其內(nèi)部都鑒定到典型的激酶活性環(huán)基序、ATP結(jié)合核心基序、核定位信號(hào)肽。qRT-PCR表達(dá)分析表明，小桐子基因在葉片與根中都屬于低溫誘導(dǎo)基因，可能參與小桐子抗冷性過程。構(gòu)建其原核表達(dá)載體pET-32a-，并在BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，得到81.6 kD的條帶，與理論融合蛋白的分子量一致。這可為小桐子基因的功能鑒定及逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究提供參考。

小桐子；基因家族；酪蛋白激酶；基因克隆；原核表達(dá)

可逆的蛋白質(zhì)磷酸化/去磷酸化共價(jià)修飾調(diào)節(jié)作為蛋白質(zhì)的翻譯后修飾方式，在參與植物生長發(fā)育、細(xì)胞周期、新陳代謝及逆境響應(yīng)等方面發(fā)揮核心作用[1]。該過程由蛋白激酶與蛋白磷酸酶負(fù)責(zé)完成[1–2]。蛋白激酶催化目標(biāo)蛋白的羥基基團(tuán)共價(jià)修飾結(jié)合磷酸基團(tuán)，根據(jù)磷酸化的氨基酸殘基的不同，蛋白激酶分為Ser/Thr蛋白激酶、Tyr蛋白激酶及雙特異性蛋白激酶[3]。酪蛋白激酶(casein kinase, CK)是一類在真核生物中高度保守的Ser/Thr類蛋白激酶。根據(jù)其理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)及在DEAE-纖維素柱的分離洗脫順序分為1型和2型，即CK1和CK2[4]。CK1以單體形式存在，僅以ATP作為磷酸供體，屬多基因家族。最初關(guān)于CK1的研究主要來自于酵母和動(dòng)物，目前，釀酒酵母()鑒定并克隆到、、、等4個(gè)基因，裂殖酵母()則包含、、、等4個(gè)基因，參與酵母形態(tài)建成、出芽等主要代謝過程[5]，而哺乳動(dòng)物至少鑒定到7個(gè)CK1同工酶(、、1、2、3、、)，其氨基酸長度為300～500 aa，都包含1個(gè)高度保守的激酶結(jié)構(gòu)域，參與哺乳動(dòng)物生物節(jié)律、細(xì)胞凋亡等重要生理過程[6]。目前對(duì)于植物基因家族的鑒定與功能機(jī)制研究還較少，但已經(jīng)明確植物基因家族較動(dòng)物多，且存在功能的冗余[7]，如擬南芥()包含13個(gè)成員[8]、水稻()包含15個(gè)成員[9]。另外, 在植物中還鑒定到一類植物特有的CK1 (PS-CK1)，氨基酸長度約為700 aa。第1個(gè)被報(bào)道的PS-CK1來自綠藻()的MUT9p[10], 而擬南芥中鑒定到4個(gè)同源PS-CK1蛋白MLK1～MLK4 (MUT9 like kinase, MLK)[11]。有研究表明，這些PS-CK1參與植物開花節(jié)律、脂肪酸代謝、下胚軸伸長、蛋白質(zhì)泛素化降解等重要生理生化過程。CK2全酶是由2個(gè)催化亞基和2個(gè)調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成的異源四聚體(22)，以ATP和GTP作為磷酸供體[12]。在酵母和哺乳動(dòng)物中，催化亞基有2種異形體、′，分別由不同的基因編碼，而植物CK2與動(dòng)物存在較大差異，且、亞基序列相似性較小，分別屬于不同的多基因家族[13]。擬南芥中鑒定到4個(gè)亞基基因(，包含1個(gè)葉綠體定位亞基)、4個(gè)亞基基因()[14]，玉米中也鑒定到4個(gè)亞基基因(包含2個(gè)葉綠體定位亞基)、4個(gè)亞基基因[15]。CK2的磷酸化底物多達(dá)300余種，參與植物細(xì)胞周期調(diào)控、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物鐘、逆境適應(yīng)等大部分生理過程。

能源植物小桐子()為大戟科(Euphorbiaceae)麻瘋樹屬多年生落葉灌木或小喬木。作為木本油料植物，小桐子種子含油量高達(dá)35%～60%，是加工生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料[16]。小桐子是原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)的喜溫植物，低溫冷害是影響小桐子地域分布、限制小桐子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要環(huán)境因素。研究表明，脫落酸(abscisic acid, ABA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與蛋白激酶組成代謝網(wǎng)絡(luò)廣泛參與植物多種抗逆性如抗冷性等過程，而基因家族在小桐子中的鑒定及其與ABA共同參與小桐子抗冷性功能研究還未見報(bào)道。本研究基于同源序列比對(duì)的方法，在小桐子全基因組中共鑒定到基因7個(gè)、基因5個(gè)、基因3個(gè)、基因2個(gè)，在此基礎(chǔ)上，克隆了基因的全長cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行了ABA處理下的qRT-PCR低溫差異表達(dá)分析及原核細(xì)胞蛋白表達(dá)分析，為研究小桐子酪蛋白激酶的功能及參與的代謝途徑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試小桐子()種子采自云南省楚雄州元謀縣。選取飽滿的種子，用1.5% CuSO4消毒20 min，無菌水漂洗5次，于26 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中吸漲24 h。將吸漲的種子在無菌水中漂洗3次,置于墊有5層無菌水濕潤濾紙的白磁盤中，于26 ℃/ 20 ℃ (晝/夜)、相對(duì)濕度75%、16 h/8 h光周期的恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)5 d。將發(fā)芽的種子播種于1/2Hogland營養(yǎng)液的砂培白磁盤中, 在同上條件的恒溫培養(yǎng)箱中生長14 d，每天添加1/2Hogland營養(yǎng)液，得到第2片真葉展開且長勢一致的小桐子幼苗[17]。取幼苗(對(duì)照)葉片、根材料0.1 g置于1.5 mL離心管中,液氮速凍后置于–80 ℃超低溫冰箱中保存。將長勢一致的小桐子幼苗，移栽至添加100mol/L ABA的1/2Hogland營養(yǎng)液中，對(duì)照材料繼續(xù)添加1/2Hogland營養(yǎng)液，同時(shí)置于溫度12 ℃、相對(duì)濕度75%、16 h/ 8 h光周期的低溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫脅迫處理，分別于0.5、3、12、24、48 h后取葉片、根0.1 g置于1.5 mL離心管中，液氮速凍后保存于–80 ℃冰箱中用于RNA的提取。

1.2 CK基因家族的鑒定及序列分析

從GenBank下載小桐子注釋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(v101)。基于擬南芥已經(jīng)鑒定的13個(gè)基因、4個(gè)基因、4個(gè)CK2催化亞基基因()和4個(gè)CK2調(diào)節(jié)亞基基因()，從擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/)下載對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。通過ClustalX進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用Hmmer 3.0軟件的Hmmbuild程序?qū)⒈葘?duì)結(jié)果生成酪蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的隱馬可夫HMM模型，基于模型，利用Hmmer 3.0軟件的Hmmsearch程序?qū)π⊥┳拥鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索(閾值E<1e-10)，經(jīng)過去除重復(fù)序列，得到非冗余的小桐子酪蛋白激酶CK1、PS-CK1、CK2-、CK2-的氨基酸序列，同時(shí)，下載其對(duì)應(yīng)的基因序列、mRNA序列。利用ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的氨基酸長度、等電點(diǎn)(isoelectric point, pI)等參數(shù)。將鑒定到的小桐子酪蛋白激酶氨基酸序列利用ClustalX進(jìn)行序列相似性比對(duì)，然后用MEGA6.0軟件通過鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，同時(shí)，利用GenDOC軟件對(duì)ClustalX比對(duì)結(jié)果進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析。利用在線軟件GSDS (http:// gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行編碼框CDS與基因序列比對(duì)以確定基因內(nèi)含子與外顯子的結(jié)構(gòu)并繪制基因結(jié)構(gòu)圖。染色體定位以吳平治等[18]構(gòu)建的小桐子遺傳連鎖圖譜進(jìn)行錨定。

1.3 PS-CK1-5基因的熒光定量表達(dá)分析

利用TriZol試劑盒(Invitrogen公司)提取小桐子葉片、根的總RNA，并利用DNase I (TaKaRa公司)消化RNA中的殘余基因組DNA, 得到純化的總RNA。分別取3g總RNA，以Random primer為逆轉(zhuǎn)錄引物，利用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa公司)合成第一鏈cDNA。以為內(nèi)參基因[19]，利用Power SYBR Green PCR Master Mix (ABI公司)進(jìn)行小桐子基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)表達(dá)分析，引物分別為PS-CK1-5_F1: 5′-CGATAGTGGTGGTTTGAGCG-3′，PS-CK1-5_R1: 5′-CCACCCTTACCCAACTTCCT-3′；GAPDH_F: 5′- TGAAGGACTGGAGAGGTGGA-3′，GAPDH_R: 5′- ATCAACAGTTGGAACACGGAA-3′。反應(yīng)體系總體積20L，每樣品重復(fù)3次。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；然后95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)；之后增加溶解曲線程序：0.5 ℃增量5 s，65 ℃～95 ℃連續(xù)檢測信號(hào)。以對(duì)照(CK)的表達(dá)量為基準(zhǔn)，采用2–ΔΔCT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 PS-CK1-5蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分析

根據(jù)基因的mRNA序列，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的全長編碼框(CDS)擴(kuò)增引物，引物分別為PS-CK1-5_F2: 5′-catggctgatatcggatccATGCCT- GAGCTTCGCAGAGGT-3′ (下劃線為R I酶切位點(diǎn))，PS-CK1-5_R2: 5′-agtggtggtggtggtggtgGG-AGACTGTCCGTCCATAGCA-3′ (下劃線為I酶切位點(diǎn))。以葉片cDNA為模板，使用高保真DNA聚合酶KOD FX Neo DNA Polymerase (TOYOBO公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性5 min; 然后98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸5 min。電泳檢測PCR產(chǎn)物質(zhì)量，擴(kuò)增產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pET-32a經(jīng)R I和I雙酶切，切膠回收后利用T4DNA連接酶16 ℃過夜連接，獲得重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB抗性(含50 mg/L的Amp)平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性克隆經(jīng)R I和I雙酶切鑒定，送華大基因公司進(jìn)行測序, 經(jīng)酶切和測序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pET-32a-。

將構(gòu)建的小桐子基因原核表達(dá)載體通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株，同時(shí)轉(zhuǎn)化pET-32a空質(zhì)粒作為對(duì)照，挑選陽性單克隆接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中(含50 mg/L的Amp)，37 ℃ 200 r/min過夜振蕩培養(yǎng)。之后按體積比1?100接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中(含50 mg/L的Amp), 37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6，取1 mL菌液至1.5 mL EP管中，4 ℃保存。之后，加入異丙基--d-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1 mmol/L, 16℃誘導(dǎo)表達(dá)，分別取誘導(dǎo)1、3、6、12 h的菌液1 mL于4 ℃保存?zhèn)溆?。將未誘導(dǎo)與誘導(dǎo)不同時(shí)間的菌液14 463×離心5 min，棄上清，將菌體沉淀利用200L PBS緩沖液(pH值7.4)重懸浮，加入50L 5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸10 min，冷卻至室溫，14 463×離心5 min，取20L上清蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(5%濃縮膠，12%分離膠)，考馬斯亮藍(lán)G250染色，檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

2 結(jié)果和分析

2.1 酪蛋白激酶CK基因家族的鑒定

根據(jù)同源序列比對(duì)，在小桐子基因組中共鑒定到基因7個(gè)、基因5個(gè)、基因3個(gè)、基因2個(gè)(表1)。除CK2-蛋白的等電點(diǎn)顯酸性外，其他家族成員的蛋白等電點(diǎn)都顯堿性?；蚪Y(jié)構(gòu)顯示，各基因家族的外顯子與內(nèi)含子分布都有家族特異性且較為保守(圖1)。小桐子酪蛋白激酶家族基因不均勻分布于9條染色體上，其中，11號(hào)染色體最多，有5個(gè)基因。

序列比對(duì)表明，小桐子酪蛋白激酶1都由1個(gè)高度保守的激酶結(jié)構(gòu)域和不保守的N端、C端非催化區(qū)域組成。核心激酶結(jié)構(gòu)域(Ser/Thr kinase domain)包含約280個(gè)氨基酸殘基，序列相似性為63%～92%,多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)都包含9個(gè)-螺旋和10個(gè)-折疊。同時(shí)，在激酶結(jié)構(gòu)域中都鑒定到典型的激酶活性環(huán)基序(A-loop)、ATP結(jié)合基序和核定位信號(hào)肽(NLS), 但小桐子CK1與PS-CK1都有自己的亞家族序列特異性。其中，ATP結(jié)合核心基序CK1亞家族都為-IGSGSFG-，而PS-CK1亞家族都為-LGKGGFG-;核定位信號(hào)肽序列CK1亞家族都為-TKKQKY-，而PS-CK1亞家族都為-QGD/ENKS/G-。另外，小桐子植物特異性PS-CK1較CK1蛋白具有更長的N端和C端序列，同時(shí)，激酶結(jié)構(gòu)域的11個(gè)保守基序之間間隔的氨基酸殘基數(shù)目也更多(圖2)。

表1 小桐子酪蛋白激酶家族基因信息

圖1 小桐子酪蛋白激酶CK家族的基因結(jié)構(gòu)

圖2 小桐子酪蛋白激酶1激酶結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)。α1～α9: α-螺旋; β2～β11: β-折疊; 下劃虛線: 活性環(huán)基序(A-loop); △: ATP結(jié)合核心基序; 下劃直線: 核定位信號(hào)肽。

2.2 PS-CK1-5基因的表達(dá)分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析的低溫表達(dá)特性。結(jié)果表明(圖3)，基因在葉片與根中都屬于低溫誘導(dǎo)基因且表現(xiàn)出相似的誘導(dǎo)表達(dá)特性，可能參與小桐子抗冷性過程。隨著低溫脅迫時(shí)間的持續(xù)，基因在葉片和根中的表達(dá)量都逐漸增加，分別在低溫脅迫3、0.5 h時(shí)達(dá)到最大，較對(duì)照(CK)分別提高3.29和2.89倍(<0.01)，說明基因在根中較葉片響應(yīng)低溫更加快速，之后表達(dá)量逐漸下降。另外，100mol/L ABA處理對(duì)低溫脅迫下小桐子幼苗葉片和根中基因的表達(dá)存在一定的抑制作用，僅在根中低溫脅迫0.5、24 h時(shí)，其表達(dá)量較未經(jīng)100mol/L ABA處理的稍有上調(diào)。

2.3 PS-CK1-5原核表達(dá)載體的構(gòu)建與蛋白表達(dá)

通過R I與I雙酶切，將小桐子基因的編碼框序列連接至pET-32a表達(dá)載體，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a-(圖4)，經(jīng)過酶切與測序驗(yàn)證正確，未出現(xiàn)突變。將大腸桿菌BL21(DE3)菌株、轉(zhuǎn)pET-32a空質(zhì)粒與pET-32a-重組載體的菌液裂解后進(jìn)行SDS-PAGE表達(dá)蛋白的電泳分析(圖5)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后都出現(xiàn)1條約81.6 kD的蛋白條帶，與理論融合蛋白的分子量一致，表明小桐子基因已經(jīng)在大腸桿菌中成功表達(dá)。另外, 目的蛋白在誘導(dǎo)1 h后即開始表達(dá)，且其表達(dá)量在誘導(dǎo)6 h時(shí)達(dá)到最大。而大腸桿菌BL21(DE3)菌株(CK-1)、轉(zhuǎn)pET-32a空質(zhì)粒(CK-2)及轉(zhuǎn)pET-32a-重組載體未誘導(dǎo)(0 h)的菌株都未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。

圖3 小桐子PS-CK1-5基因的低溫差異表達(dá)。A: 葉片; B: 根; CK: 對(duì)照; **: P<0.01; *: P<0.05。

圖4 小桐子PS-CK1-5基因的克隆及原核表達(dá)載體構(gòu)建。A: 基因擴(kuò)增; B: 重組質(zhì)粒pET-32a-JcPS-CK1-5; C: 菌落PCR驗(yàn)證; D: 酶切驗(yàn)證; M: DNA Marker。

3 結(jié)論和討論

由于植物基因家族成員較多，且相互之間存在功能冗余，導(dǎo)致植物CK1的功能及磷酸化作用機(jī)制研究起步較晚。早期研究主要集中在CK1蛋白的分離純化[20–21]，Klimczak等[22]與Liu等[23]將擬南芥與水稻CK1蛋白功能的研究推進(jìn)到分子與機(jī)理水平，體外表達(dá)研究表明，擬南芥AtCKI1與水稻OsCKI1都能夠磷酸化酪蛋白，同時(shí)OsCKI1基因受ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[23]。研究表明，植物低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也主要依賴ABA誘導(dǎo)基因的表達(dá)，此類低溫誘導(dǎo)基因含有ABA應(yīng)答元件(ABRE)，ABA通過亮氨酸拉鏈蛋白(bZIP)與該元件結(jié)合而調(diào)控基因的表達(dá)，另外，也可通過特異的轉(zhuǎn)錄因子如MYB、MYC、bZIP等，這些轉(zhuǎn)錄因子存在典型的DNA結(jié)合蛋白基序如bHLH、AP2等，可以與低溫誘導(dǎo)基因的上游調(diào)控區(qū)域結(jié)合而調(diào)控其表達(dá)[24]，Kim等[25]報(bào)道芝麻()的表達(dá)能夠被ABA誘導(dǎo)，并通過磷酸化bHLH轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控油酸去飽和酶(SeFAD2)的表達(dá)，從而影響種子中脂肪酸的代謝。本研究在小桐子基因啟動(dòng)子中鑒定到低溫響應(yīng)元件，但未見ABA響應(yīng)元件，同時(shí)，還鑒定到大量MYB、MYC等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域, 推測為小桐子基因表達(dá)的主要調(diào)控位點(diǎn)。小桐子屬于低溫敏感植物，基因家族參與小桐子抗冷性及其與ABA的響應(yīng)關(guān)系研究還未見報(bào)道, 根據(jù)我們課題組前期的小桐子低溫轉(zhuǎn)錄組與數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)表明，屬低溫誘導(dǎo)表達(dá)基因[26], 本研究通過qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，也表明基因受到低溫脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，與小桐子的抗冷性直接相關(guān)，但ABA對(duì)其低溫脅迫下的表達(dá)卻存在負(fù)調(diào)控作用，暗示基因的低溫誘導(dǎo)表達(dá)還受到其他轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)途徑如不依賴ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)。

圖5 小桐子PS-CK1-5基因大腸桿菌表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳。CK-1:大腸桿菌BL21(DE3)菌株；CK-2: 轉(zhuǎn)空pET-32a表達(dá)載體；0 h、1 h、3 h、6 h、12 h表示轉(zhuǎn)重組表達(dá)載體經(jīng)IPTG分別誘導(dǎo)0、1、3、6、12 h; M: Marker。

鑒定CK下游靶標(biāo)蛋白的種類及磷酸化位點(diǎn)對(duì)于該激酶家族功能的分子機(jī)制研究至關(guān)重要。目前，植物CK磷酸化位點(diǎn)的識(shí)別主要依賴生物信息學(xué)預(yù)測，且都是基于微生物和動(dòng)物CK的研究，而對(duì)于植物特異性酪蛋白激酶PS-CK1的靶標(biāo)蛋白研究還鮮有報(bào)道。最早報(bào)道的綠藻PS-CK1蛋白MUT9能夠磷酸化組蛋白H2A和H3，從而調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)[10]，對(duì)應(yīng)擬南芥MLKs主要通過磷酸化組蛋白H2A的Ser95促進(jìn)開花生理過程[27]，利用生物信息學(xué)預(yù)測小桐子PS-CK1-5的磷酸化靶標(biāo)蛋白也包括組蛋白家族，與上述綠藻、擬南芥的報(bào)道一致。另外，水稻PS-CK1蛋白EL1通過磷酸化赤霉素信號(hào)途徑中的負(fù)調(diào)控因子SLR1的Ser196和Ser510來調(diào)節(jié)水稻的開花時(shí)間[28]，而擬南芥的AEL蛋白通過磷酸化ABA受體PYL1的Ser136和Ser182，加速其泛素化降解，從而調(diào)節(jié)種子的休眠與萌發(fā)過程[29]。這些說明PS-CK1可以磷酸化多種下游靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物整個(gè)生命周期中的代謝過程。通過STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和NetPhos磷酸化位點(diǎn)分析工具鑒定小桐子PS-CK1家族的靶向目標(biāo)蛋白顯示，除包含模式植物擬南芥已經(jīng)報(bào)道的途徑外，還涉及植物形態(tài)建成、光合作用、ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆性如抗冷性ICE-CBF途徑等生理生化過程。

在小桐子全基因組中鑒定到酪蛋白激酶基因家族7個(gè)基因、5個(gè)基因、3個(gè)基因、2個(gè)基因?？寺〉叫⊥┳又参锾禺愋岳业鞍准っ富颍湓谛⊥┳尤~片與根中都受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，在小桐子抗冷性中發(fā)揮重要作用。構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體pET-32a-，并成功在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。

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Cloning and Prokaryotic Expression of Plant-specific Casein Kinase Genefrom

WANG Haibo, WU Zhenying, GUO Junyun

(College of Biological Resource and Food Engineering, Qujing Normal University,Qujing 655011, Yunnan, China)

Casein kinase (CK), a ubiquitous Ser/Thr protein kinase, plays an important role in the whole physiological process and signal transduction pathway of plants through regulating activity and stability of target protein. Thegene family inwas identified fromgenome based on the BLAST method. The results showed that a total of seven, five, three, and twowere identified fromgenome, and the four subfamily members owned family-specificity in amino acid length, isoelectrical point, and exon number. Domain and motif analysis revealed that all of CK1 contain N-terminal conserved kinase domain, and the kinase activation loop (A-loop), ATP-binding core motif, and nuclear localization signal peptide (NLS) were identified in its interior. A plant-specific casein kinse 1-5 gene, named, was cloned. qRT-PCR analysis showed thatgene was a low temperature-induced gene in both leaves and roots, and might be involved in cold resistance of. A prokaryotic expression vector pET-32a-was constructed and transformed intoBL21(DE3). A band of 81.6 kD was obtained, which was consistent with the expected weight. Therefore, these would provide a reference for studying the functional identification ofgene and the stress signal transduction mechanism in.

; Gene family; Casein kinase; Gene cloning; Prokaryotic expression

10.11926/jtsb.4719

2022–08–25

2022–10–12

云南省地方本科高校(部分)基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)項(xiàng)目(202001BA070001-003)；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(202110684009)資助

This work was supported by the Project for Local Colleges Applied Basic Research in Yunnan (Grant No. 202001BA070001-003), and the Program for Yunnan Undergraduate on Innovation and Entrepreneurship Training (Grant No. 202110684009).

王海波(1980年生)，男，博士，教授，研究方向?yàn)橹参锬婢撤肿由飳W(xué)。E-mail: bocai0406@163.com