黃麗丹,王博

(武漢大學人民醫(yī)院:1麻醉科,2胸外科,武漢 430060)

急性肺損傷是一種常見的危重癥,病死率極高[1]。臨床上,急性肺損傷患者主要表現(xiàn)為呼吸急促、紫紺、肺順應性降低及肺水腫,病理特征主要以大量炎癥細胞浸潤,肺泡上皮和血管內皮屏障損傷為主[2]。根據病理進展,急性肺損傷被分為4個時期,包括早期滲出期、晚期滲出或增殖期、扁平上皮化生期以及晚期增殖期[3]。引起急性肺損傷常見原因包括肺炎、肺栓塞以及肺移植后缺血再灌注或肺葉切除,間接原因為膿毒血癥和創(chuàng)傷[4]。目前臨床針對急性肺損傷的治療除對癥支持外,尚無特殊治療及預防手段[5]。此外,不同病因所致的急性肺損傷,分子作用機制也有所差異。因此,進一步加深對不同病因所致急性肺損傷發(fā)病機制的認識,解析其發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵靶點,對急性肺損傷的干預具有重要意義。

人卵泡抑素樣蛋白3(follistatin-like protein 3,FSTL3)是Hayette等[6]于1998年在慢性淋巴細胞白血病患者B細胞中發(fā)現(xiàn)的一種新型分泌蛋白。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)FSTL3參與調節(jié)多種生物過程,包括細胞分化、衰老、炎癥、氧化應激、代謝、免疫、動脈硬化和腫瘤進展[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn),FSTL3可通過誘導脂質沉積和巨噬細胞炎癥反應加速動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展[10]。此外,FSTL3在超重或肥胖個體的脂肪組織中高表達,并與機體炎癥反應呈正相關[11]。哮喘患者支氣管上皮細胞中FSTL3的低表達水平與肺成纖維細胞的活力降低存在顯著相關性[12]。上述研究均提示,FSTL3在炎癥疾病中發(fā)揮重要作用,但FSTL3在急性肺損傷中的表達及作用目前尚未有研究報道。本研究通過構建膿毒血癥肺損傷及肺缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)損傷兩種急性肺損傷模型,觀察FSTL3在肺損傷發(fā)生發(fā)展過程中的表達,同時使用FSTL3中和抗體(follistatin-like protein 3-neutra-lizing antibody,FSTL3-NA)或FSTL3基因敲除小鼠評估FSTL3抑制對急性肺損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)純度為97.53%,購自上海源葉生物科技有限公司;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、FSTL3、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)1、SOD2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH),均購自美國Abcam公司;FSTL3中和抗體(follistatin-like 3-neutralizing antibody,FSTL3-NA),購自北京熱景生物技術有限公司。

1.2 實驗小鼠及急性肺損傷模型的構建

SPF級野生型(wild type,WT)雄性C57 BL/6小鼠體質量20～24g,周齡8～10周,購自于湖北省實驗動物研究中心。FSTL3基因敲除雄性小鼠體質量20～24g,周齡8～10周,購自于賽業(yè)生物科技有限公司。

根據隨機數(shù)表法,將30只SPF級WT雄性C57 BL/6小鼠隨機分為5組,依次為LPS注射0h組、6h組、12h組、18h組和24h組,每組各6只,進行膿毒血癥肺損傷造模。膿毒血癥肺損傷模型具體構建過程:參考既往文獻[6]報道的方式,小鼠腹腔單次注射LPS 10mg/kg,分別在LPS注射0、6、12、18及24h后,腹腔注射50mg/kg的2%戊巴比妥鈉溶液對小鼠進行麻醉。隨后,使用眼科剪逐層剪開小鼠胸部皮膚并剪斷肋骨,打開胸膜充分暴露肺及心臟。使用1ml注射器,于心臟中抽取血液0.6～0.8ml。同時留取小鼠左肺組織,將左上肺組織置于10%中性福爾馬林溶液,左下肺組織剪碎后置于凍存管中,放置于-80℃冰箱。為進一步探討FSTL3-NA干預對膿毒血癥肺損傷的作用,另選取18只SPF級WT雄性C57 BL/6小鼠,根據隨機數(shù)表法,依次將其分為對照組、LPS組及治療組(LPS+FSTL3-NA組),每組各6只。LPS組及LPS+FSTL3-NA組小鼠接受腹腔單次注射LPS10mg/kg。LPS+FSTL3-NA組小鼠在LPS腹腔注射前2d給予尾靜脈注射FSTL3-NA 80μg/d,其余步驟同上。

根據隨機數(shù)表法,另將30只SPF級WT雄性C57 BL/ 6小鼠隨機分為5組,依次為再灌注0h組、2h組、4h組、6h組、8h組,每組各6只,進行肺IR造模。肺IR模型具體構建過程:參考既往文獻[7]報道的方式,腹腔注射50mg/kg的2%戊巴比妥鈉溶液對小鼠進行麻醉。隨后,將小鼠仰臥位固定于保溫板上,左側進胸后使用顯微血管鉗夾閉左肺門2h,松夾后分別再灌注0、2、4、6及8h。再灌注結束后使用1ml注射器,于心臟中抽取血液0.6～0.8ml。同時留取小鼠左肺組織,將左上肺組織置于10%中性福爾馬林溶液,左下肺組織剪碎后置于凍存管中,放置于-80℃冰箱。

根據隨機數(shù)表法,另將12只SPF級WT雄性C57 BL/ 6小鼠隨機分為假手術(Sham)-WT組6只和IR-WT組6只,將12只FSTL3基因敲除(FSTL3 KO)小鼠隨機分為Sham-FSTL3 KO組6只和IR-FSTL3 KO組6只,進行肺IR造模,IR組造模方法同上。

1.3 小鼠血清中FSTL3及TNF-α水平的檢測

將各組小鼠全血樣品在室溫放置2h后于4℃下以3000轉/min的速度進行離心20min,上清液即為血清層。使用FSTL3 酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(批號:CT66668,上海初態(tài)生物科技有限公司)和TNF-α ELISA試劑盒(批號:CT66709,上海初態(tài)生物科技有限公司)對各組血清樣本中的FSTL3和TNF-α含量進行檢測,在450nm波長下對各孔的吸光度進行讀取并計算FSTL3和TNF-α的相對含量。

1.4 免疫印跡

用于4℃溫度保存的磷酸鹽緩沖液對小鼠肺組織充分洗滌后提取肺組織中總蛋白。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測各組小鼠肺組織中相關蛋白的表達水平。一抗稀釋倍數(shù)如下:TNF-α(1∶1000)、FSTL3(1∶500)、MCP-1 (1∶1000)、SOD1(1∶1000)、SOD2(1∶500)、GAPDH(1∶2000)。

1.5 轉錄實時定量聚合酶鏈反應

使用Trizol試劑盒(批號:abs60154,上海愛必信生物科技有限公司)對各組小鼠肺組織中的總RNA進行抽提。使用紫外分光光度計對RNA純度和濃度進行測定,樣本在260nm和280nm的吸光度比值為1.9～2.1時則認為其質量合格。隨后,使用互補DNA逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為互補DNA。使用實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)儀進行PCR 擴增,檢測相應目的基因的循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)。最后,以2-△△Ct法計算本研究中各目的基因的相對信使RNA(message RNA, mRNA)表達水平。

1.6 HE 染色

將各組小鼠的左上肺組織固定并包埋后切成4μm的組織切片。使用蘇木素和伊紅對肺組織切片進行HE染色。光鏡下觀察染色結果并對各組小鼠肺損傷程度進行評分。評分指標包括炎癥細胞浸潤、組織水腫和肺泡間隔增厚的程度[5]。各指標評分細則如下:肺組織正常為0分;損傷程度<25%為1分;25%≤損傷程度<50%為2分;50%≤損傷程度<75%為3分;75%≤損傷程度為4分。3項指標評分總和即為最終的肺損傷評分。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 FSTL3在兩種急性肺損傷小鼠血清中的表達

在LPS誘導的膿毒血癥肺損傷模型中,LPS腹腔注射6h后,血清中TNF-α的蛋白表達水平顯著升高,12h后達到峰值,24h后水平仍顯著高于0h(P<0.05;圖1A);血清中FSTL3的蛋白表達水平在12h顯著升高,18h達到峰值,后趨于穩(wěn)定,均顯著高于0h(P<0.05;圖1A)。在IR誘導的急性肺損傷模型中,缺血2h,再灌注2h后,小鼠血清中TNF-α和FSTL3的蛋白表達水平均顯著升高,6h后達到峰值,8h后水平仍顯著高于0h(P<0.05;圖1B)。

圖1 FSTL3和TNF-α在兩種急性肺損傷小鼠模型血清中的表達Figure 1 Expression of FSTL3 and TNF-α in serum of two acute lung injury mice models (n=6, A: changes of serum TNF-α and FSTL3 protein levels in mice after intraperitoneal injection of LPS; B: changes of serum TNF-α and FSTL3 protein levels in reperfusion mice after 2 hours of ischemia. FSTL3: follistatin-like protein 3; TNF-α: tumor necrosis factor-α; LPS: lipopolysaccharide. Compared with 0 h, *P<0.05.

2.2 FSTL3在膿毒血癥肺損傷小鼠肺組織中的表達

在LPS誘導的膿毒血癥肺損傷模型中,LPS腹腔注射6h后,小鼠肺組織中TNF-α的蛋白和mRNA表達水平顯著升高;12h后,TNF-α的mRNA表達水平達到峰值;18h后,TNF-α的蛋白表達水平達到峰值(均P<0.05)。LPS腹腔注射6h后,小鼠肺組織中FSTL3的mRNA表達水平顯著升高;12h后,FSTL3的蛋白表達水平著升高;18h后,FSTL3的蛋白和mRNA表達水平均達到峰值(均P<0.05;表1,圖2)。

表1 LPS腹腔注射后不同時間小鼠肺組織中TNF-α和FSTL3的蛋白及mRNA的相對表達量

表2 缺血再灌注不同時間小鼠肺組織TNF-α和FSTL3的蛋白及mRNA的相對表達量

表3 FSTL3-NA對膿毒血癥小鼠肺組織中TNF-α, MCP-1,SOD1和SOD2蛋白表達的影響

表4 FSTL3基因敲除對IR小鼠肺組織中TNF-α, MCP-1, SOD1和SOD2蛋白表達的影響

圖2 LPS腹腔注射后不同時間小鼠肺組織中TNF-α和FSTL3蛋白表達的Western blotting檢測Figure 2 Western blotting of TNF-α and FSTL3 protein expression in lung tissue of mice at different time points after intraperitoneal injection of LPS (n=6, LPS: lipopolysaccharide; TNF-α: tumor necrosis factor-α; FSTL3: follistatin-like protein 3; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

圖3 缺血再灌注不同時間小鼠肺組織中TNF-α和FSTL3蛋白表達的Western blotting檢測Figure 3 Western blotting of TNF-α and FSTL3 protein expression in lung tissue of mice at different time points of ischemia-reperfusion (n=6, TNF-α: tumor necrosis factor-α; FSTL3: follistatin-like protein 3; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

圖4 FSTL3-NA對膿毒血癥小鼠肺病理損傷的影響Figure 4 Effects of FSTL3-NA on lung pathological injury in septic miceFSTL3-NA: follistatin-like protein 3-neutralizing antibody; LPS: lipopolysaccharide.

2.3 FSTL3在肺IR損傷小鼠肺組織中的表達

在肺IR損傷小鼠模型中,缺血2h,再灌注2h后,小鼠肺組織中TNF-α的蛋白和mRNA表達水平顯著升高;再灌注4h后,TNF-α的蛋白表達水平達到峰值;再灌注6h后,mRNA表達水平均達到峰值(均P<0.05)。缺血2h,再灌注2h后,小鼠肺組織中FSTL3的蛋白和mRNA表達水平顯著升高;再灌注4h后,FSTL3的蛋白和mRNA表達水平均達到峰值(均P<0.05;表2,圖3)。

2.4 FSTL3-NA對膿毒血癥小鼠肺病理損傷的影響

HE染色結果表明,LPS刺激12h后,與對照組相比,LPS組小鼠肺組織出現(xiàn)了明顯的炎癥細胞浸潤、組織水腫和肺泡間隔增厚,肺損傷評分明顯增加[(8.15±2.54)和(1.04±0.15)分;P<0.05]。與LPS組相比,LPS+FSTL3-NA組小鼠肺炎癥細胞浸潤、組織水腫和肺泡間隔增厚均明顯減輕,肺損傷評分明顯降低[(4.14±1.32)和(8.15±2.54)分;P<0.05;圖4)]。

Western blotting結果表明,與對照組相比,LPS刺激可明顯上調小鼠肺組織中TNF-α和MCP-1的蛋白表達水平(P<0.05),同時下調SOD1和SOD2的蛋白表達水平(P<0.05)。與LPS組相比,FSTL3-NA預處理可明顯下調膿毒血癥小鼠肺組織中TNF-α和MCP-1的蛋白表達水平(P<0.05),同時上調SOD1和SOD2的蛋白表達水平(P<0.05;表3,圖5)。

圖5 FSTL3-NA對膿毒血癥小鼠肺組織炎癥及氧化應激的影響Figure 5 Effects of FSTL3-NA on lung inflammation and oxidative stress in septic miceA: protein expression of TNF-α and MCP-1 by western blotting; B: protein expression of SOD1 and SOD2 by western blotting. FSTL3-NA: follistatin-like protein 3-neutralizing antibody; TNF-α: tumor necrosis factor-α; MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; SOD1: superoxide dimutase 1; SOD2: superoxide dimutase 2; LPS: lipopolysaccharide.

圖6 FSTL3基因敲除對IR小鼠肺病理損傷的影響Figure 6 Effects of FSTL3 gene knockout on lung pathological injury in IR miceFSTL3: follistatin-like 3; IR: ischemia reperfusion; WT: wild type; KO: knockout.

2.5 FSTL3敲除對IR小鼠肺病理損傷的影響

HE染色結果表明,與Sham-WT組相比,IR-WT組小鼠肺損傷評分明顯增加[(7.66±1.43)分和(1.21±0.31)分;P<0.05]。與IR-WT組相比,IR-FSTL3 KO組小鼠肺病理損傷明顯減輕,且肺損傷評分明顯降低[(2.34±0.23)和(7.66±1.43)]分;P<0.05;圖6]。

Western blotting結果表明,與Sham-WT組相比,缺血2h再灌注4h可明顯上調野生型小鼠肺組織中TNF-α和MCP-1的蛋白表達水平(P<0.05),同時下調SOD1和SOD2的蛋白表達水平(P<0.05)。與IR-WT組相比,FSTL3敲除可明顯下調IR小鼠肺組織中TNF-α和MCP-1的蛋白表達水平(P<0.05),同時上調SOD1和SOD2的蛋白表達水平(P<0.05;表4,圖7)。

圖7 FSTL3基因敲除對IR小鼠肺組織炎癥及氧化應激的影響Figure 7 Effects of FSTL3 gene knockout on lung inflammation and oxidative stress in IR miceA: protein expression of TNF-α and MCP-1 by western blotting; B: protein expression of SOD1 and SOD2 by western blotting. FSTL3: follistatin-like 3; IR: ischemia reperfusion; TNF-α: tumor necrosis factor-α; MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; SOD1: superoxide dimutase 1; SOD2: superoxide dimutase 2; WT: wild type; KO: knockout.

3 討 論

急性肺損傷是一種由多種致病因素引起的臨床綜合征,包括急性肺炎、膿毒血癥、外傷、肺IR、嚴重外傷及急性胰腺炎等[1,3,4]。急性肺損傷以肺部劇烈炎癥反應和肺上皮及血管內皮屏障受損為主要特征,若不及時控制,最終可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)甚至引起死亡[13]。盡管機械通氣可顯著改善ARDS的癥狀,但ARDS所致的死亡率仍然高達35%～55%[14]。LPS是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分,進入血液循環(huán)后可被天然免疫細胞識別并啟動炎性介質的大量分泌,該過程會導致肺泡上皮和內皮屏障的破壞,損害宿主的正常呼吸功能,最終誘發(fā)急性肺損傷甚至ARDS[15]。IR損傷通常是由器官或組織床血流中斷一段時間后血供突然恢復所誘發(fā)。在肺中,IR損傷既可單獨發(fā)生也可與其他損傷過程伴隨發(fā)生,包括感染、缺氧、肺不張、機械通氣損傷鈍性(非穿透性)肺挫傷[16]。既往研究表明,不論是LPS誘導的膿毒血癥肺損傷還是IR誘導的肺損傷,肺組織中均出現(xiàn)了過度激活的炎癥反應和氧化應激[17,18]。因此,進一步探尋可減輕肺損傷期間炎癥及氧化應激的藥物或分子靶點,對于臨床急性肺損傷的防治具有重要意義。

FSTL3是一種富含酸性半胱氨酸的分泌糖蛋白,廣泛分布于哺乳動物睪丸、腎上腺、脂肪、肺、胎兒心臟以及胎盤。FSTL3基因定位于人類染色體19p13[19]。FSTL3與轉化生長因子-β家族配體(如激活素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白和肌肉生長抑制素)通過不可逆地結合,使其生物活性降低。其中,FSTL3對激活素的抑制作用最強,其次是肌肉生長抑制素,對骨形態(tài)發(fā)生蛋白的抑制作用最弱。同時,FSTL3與上述配體結合后也易被細胞內吞降解[8]。既往研究顯示,FSTL3在能量代謝、骨骼形成與強化、造血細胞黏附與造血、多能干細胞分化、生殖發(fā)育等生理過程中發(fā)揮關鍵作用。例如,嚙齒動物中FSTL3的抑制可導致內臟脂肪量減少,并增加小鼠胰島素敏感性[20]。此外,FSTL3敲除可明顯改善主動脈縮窄術誘發(fā)的小鼠心臟功能與心室肥厚,其機制可能與FSTL3敲低后激活素A上調介導的抗凋亡蛋白Bcl-2過表達有關[21]。然而FSTL3是否在膿毒血癥肺損傷及肺IR損傷中發(fā)揮作用,目前尚不清楚。本研究結果顯示,FSTL3蛋白在LPS誘導的膿毒血癥肺損傷模型和IR誘導的肺損傷模型小鼠血清中表達均明顯升高,且FSTL3蛋白表達水平與炎癥標志物TNF-α的蛋白變化趨勢一致,表明FSTL3可能與兩種誘因所致的小鼠急性肺損傷存在潛在相關性。特別地,我們發(fā)現(xiàn)在LPS刺激12h后,血清中TNF-α的蛋白水平到達峰值,18h后,肺組織中TNF-α的蛋白水平達到峰值,表明LPS刺激12h后全身炎癥反應最激烈,18h后肺內炎癥最激烈。有趣的是,肺組織中FSTL3和TNF-α的蛋白變化水平趨勢基本一致,提示LPS刺激后,肺組織中FSTL3與炎癥存在明顯的交互作用。在IR模型中,血清中TNF-α和FSTL3的變化水平趨勢基本完全一致,但肺組織中,FSTL3蛋白較TNF-α蛋白水平提前達到峰值。我們推測這種差異可能與兩種模型中炎癥類型差異有關。LPS誘導的是一種有菌性的全身性炎癥[22],而IR誘導的損傷則為一種局部的無菌性炎癥[23]。全身性炎癥可能對炎癥具有放大效應,而IR誘導炎癥則對肺組織的局部效應更為明顯。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn),使用中和抗體抑制小鼠體內FSLT3后可明顯減輕膿毒血癥小鼠肺病理損傷,炎癥反應及氧化應激。在小鼠IR損傷模型中,FSLT3基因敲除也可明顯減輕膿毒血癥小鼠肺病理損傷、炎癥反應及氧化應激。結合兩種肺損傷模型,抑制FSLT3水平均可發(fā)揮明顯的肺保護作用。盡管如此,本研究仍舊存在以下不足之處:(1)本研究只在動物層面探索了FSLT3對肺損傷表型的影響,未在細胞層面對FSLT3的作用加以驗證;(2)本研究未對FSLT3通過何種靶點調控炎癥和氧化應激進行探索。

綜上,FSLT3在不同病因誘導的肺損傷模型中表達均發(fā)生改變,且在肺損傷發(fā)生發(fā)展中呈現(xiàn)動態(tài)改變,提示FSLT3參與急性肺損傷的病理發(fā)展。此外,靶向抑制FSTL3可顯著減輕膿毒血癥或IR所致的急性肺損傷,基于FSTL3的分子靶點可能為今后急性肺損傷的防治提供新方向。