馮唐鍇 雷 群 羅麗萍 藍(lán) 玉

（1景德鎮(zhèn)學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，江西景德鎮(zhèn) 333499；2景德鎮(zhèn)市第十二小學(xué)，江西景德鎮(zhèn) 333000）

金銀花在抗菌消炎和對(duì)抗病毒性疾病方面有一定作用，常用于中藥方劑中。綠原酸（Chlorogenic acid，CGA）是金銀花重要的藥用成分之一，具有多種藥用功效[1]。植物綠原酸合成途徑有3 條：一是咖啡酰輔酶A 和奎寧酸由羥基化肉桂酸輔酶A或奎寧酸肉桂酸羥基化轉(zhuǎn)移酶催化生成綠原酸；二是在羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶等作用下生成p-香豆酰奎寧酸，再由p-香豆酸3-羥化酶（p-coumarate3-hydroxylase，C3H）羥基化生成綠原酸；三是咖啡酰葡萄糖苷作為中間產(chǎn)物，和奎寧酸在羥基化肉桂酰D-葡萄糖、奎寧酸羥基化肉桂酰轉(zhuǎn)移酶催化作用下生成綠原酸。C3H 是綠原酸合成代謝過程中的關(guān)鍵酶，該酶催化咖啡酸的生物合成，這個(gè)過程是合成綠原酸的重要步驟。C3H 屬于細(xì)胞色素P450家族，與各類植物的CYP450 98A 亞家族蛋白具有高度同源性。在植物苯丙素代謝中能催化苯環(huán)C3位置的羥基化反應(yīng)，是綠原酸生物合成的關(guān)鍵酶之一。金銀花基因組中有兩個(gè)C3H拷貝，2013年第一個(gè)C3H 基因拷貝（LjC3H）被克隆，亓希武等[2]對(duì)另外一個(gè)C3H 基因拷貝（LjC3H2）進(jìn)行了研究。其他植物C3H 也有相關(guān)研究，王漫青等[3]的研究表明，當(dāng)歸C3H 基因開放閱讀框長1 530 bp，編碼509 個(gè)氨基酸。周美娟等[4]克隆了慈竹C3H 基因并進(jìn)行了分析。李高等[5]的研究表明檸條錦雞兒C3H 與擬南芥C3H 具有部分相同的功能。本文從各類數(shù)據(jù)庫收集了37 種植物40 個(gè)C3H 蛋白序列，利用多種生物信息學(xué)分析工具，以LjC3H2為研究對(duì)象，對(duì)該基因表達(dá)酶的結(jié)構(gòu)、功能和分類等特點(diǎn)進(jìn)行了進(jìn)一步的分析研究。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)材料

LjC3HL2酶蛋白在NCBI 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序號(hào)為ART33341.1。以該蛋白氨基酸序列為樣本進(jìn)行Blast 比對(duì)，在NCBI 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫找到37 種植物40個(gè)C3H蛋白氨基酸序列，用來對(duì)LjC3H2進(jìn)行分子進(jìn)化分析。相關(guān)植物蛋白序列號(hào)如下：金銀花（ART33341.1、AGQ48118）、桔梗（AEM63674.1）、夏威夷金合歡（AOX49220.1）、西樺（QGX89943.1）、擰條錦雞兒（AEV93473.1）、薊（QQH14908.1）、矮牽牛（AVA30528.1）、毛白楊（AFZ78540.1、APR63682.1）、中?？Х龋ˋBB83677.1）、苦蕎麥（AHA14499.1）、芝麻（AAL47545.1）、黃水仙（AUG71937.1）、藍(lán)星睡蓮（XP_031473498.1）、鮑氏文殊蘭（WGU11329.1）、粗壯女貞（WEX29781.1）、紅花釣鐘柳（WEX29779.1）、沙蓬（WBR79877.1）、茄子（UXQ89629.1）、蓖麻（XP_002511566.3）、圓葉黃山藥（XP_039114632.1）、龍葵（QIC52992.1）、缸豆（QCD97092.1）、桃兒七（AIA24412.1） 、水 仙（AGI97941.1） 、 慈 竹（AFD29885.1）、杉木（AFX98060.1）、火炬松（AAL47685.1）、歐洲云杉（CAK22403.1）、地黃（QJS39421.1）、箭葉淫羊藿（AIS92508.1）、陸地棉（ALH21661.1）、南非醉茄（ADM47799.1）、大麻槿（AGA60530.1）、藥蜀葵（UOI87846.1）、巨芒草（ANB43566.1、ANB43567.1）、黃芩（BAJ09387.1）和辣椒（ACF17644.1）。這40 個(gè)植物C3H 蛋白中，除了沙蓬和歐洲云杉的酶蛋白序列不夠完整以外，其他植物的酶蛋白氨基酸數(shù)都在510 左右，最少的為503（杉木），最多的為517（西樺、矮牽牛和茄子）。

1.2 生物信息學(xué)工具和分析方法

使用的生物信息學(xué)工具包括各類在線數(shù)據(jù)庫、在線數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站以及離線分析軟件，具體名稱、網(wǎng)址及功能如表1所示。

表1 使用的生物信息學(xué)分析軟件和在線程序

美國國家生物信息中心（NCBI）可用于獲得、提交和分析各類生物信息數(shù)據(jù)。BLAST是其中的一個(gè)分析工具，可對(duì)不同氨基酸或核酸序列進(jìn)行同源比較。DNAMAN 是一款高度集成化的序列分析軟件，本文利用該軟件進(jìn)行金銀花C3H蛋白的輔助序列處理和分析。MEGA 是對(duì)物種和種群DNA 和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分子進(jìn)化遺傳分析的軟件套裝，本文利用該軟件對(duì)不同植物C3H蛋白氨基酸序列進(jìn)行比較和進(jìn)化樹的構(gòu)建。ProtParam 是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析的軟件，可計(jì)算蛋白質(zhì)的各種物化參數(shù)，包括分子量、理論pI 和氨基酸組成等。ProtScale 是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行親疏水性分析的在線軟件。SignalP 6.0能夠預(yù)測信號(hào)肽的存在及其在蛋白質(zhì)中的切割位點(diǎn)的位置[6]。TMHMM 是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜螺旋區(qū)分析的服務(wù)器，用隱馬爾可夫模型預(yù)測跨膜蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[7]。Euk-mPLOC是真核蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析工具，包括具有多個(gè)亞細(xì)胞位點(diǎn)的真核蛋白質(zhì)也能預(yù)測[8]。SOPMA 是一種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法，分析蛋白質(zhì)中α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲等主要二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在情況[9]。SWISS-MODEL 得到了Alpha-Fold 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫等資源工具的支撐，能高效精準(zhǔn)的自動(dòng)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源性建模[10]。Prot-Param、ProtScale、SignalP6.0、TMHMM、Euk-mPLOC、SOPMA和SWISS-MODEL這些在線程序都有功能強(qiáng)大，簡單易用的特點(diǎn)。對(duì)該基因的生物信息學(xué)進(jìn)行分析，將下載好的LjC3H2氨基酸序列導(dǎo)入其輸入界面中，再點(diǎn)擊提交即可得到相關(guān)蛋白信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位以及蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 LjC3H2編碼蛋白的理化性質(zhì)

通過程序EXPASY 的ProtParam 分析金銀花LjC3H2編碼蛋白的理化性質(zhì)。結(jié)果顯示，LjC3H2編碼蛋白質(zhì)原子總數(shù)8 133，分子式為C2601H4083N715O715S19；分子量57 419.53；等電點(diǎn)pI 為8.92；序列的N 末端是M（Met）時(shí)估計(jì)半衰期為30 h（哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞）＞20 h（酵母）＞10 h（大腸桿菌）。不穩(wěn)定性指數(shù)計(jì)算為38.41，即該蛋白質(zhì)應(yīng)歸類為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脂肪指數(shù)92.33，親水性總平均值（重力）-0.231，偏親水性蛋白。LjC3H2蛋白共含氨基酸殘基506 個(gè)，包括蛋白質(zhì)中常見的20 種氨基酸，其中亮氨酸（Leu，11.7%），丙氨酸（Ala，8.3%），精氨酸（Arg，6.9%），纈氨酸（Val，6.9%），脯胺酸（Pro，6.9%），谷氨酸（Glu，6.3%），甘氨酸（Gly，6.1%），賴氨酸（Lys，5.7%），天冬氨酸（Asp，5.1%）含量相對(duì)較多，半胱氨酸（Cys，0.8%）最少，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（天冬氨酸+谷氨酸）為58，帶正電的殘基總數(shù)（精氨酸+賴氨酸）為64（表2）。

表2 LjC3H2蛋白質(zhì)的氨基酸組成

預(yù)測LjC3H2在水中280 nm處的消光系數(shù)，若假設(shè)所有的半胱氨酸殘基都形成胱氨酸，則消光系數(shù)為80 120，吸光度值（0.1%濃度）為1.395。假設(shè)所有的半胱氨酸殘基都不形成胱氨酸，則消光系數(shù)為79 870，吸光度值（0.1%濃度）為1.391。用DNAMAN軟件對(duì)LjC3H2做胰蛋白酶的酶切分析，結(jié)果表明胰蛋白酶對(duì)LjC3H2做酶切分析可得39 個(gè)片段。用DNAMNA 軟件預(yù)測LjC3H2抗原位點(diǎn)的結(jié)果表明，在LjC3H2中存在的抗原位點(diǎn)有8個(gè)（表3）。

表3 LjC3H2抗原位點(diǎn)預(yù)測

用ProtScale 軟件對(duì)LjC3H2做親水性和疏水性預(yù)測分析，得到的結(jié)果如圖1 所示。其中以LjC3H2中的氨基酸（aa）序列號(hào)作橫坐標(biāo)，親水性分值作為縱坐標(biāo)，負(fù)值越高表示親水性越強(qiáng)，正值越高表示疏水性越強(qiáng)。結(jié)果表明，除了起始的少數(shù)幾個(gè)氨基酸疏水性較高以外，整個(gè)蛋白質(zhì)沒有特別明顯的“峰頂”和“谷底”，親/疏水性相對(duì)均勻，整體來看親水性略高。

圖1 LjC3H2親水性分析

2.2 LjC3H2蛋白的信號(hào)肽情況

用DNAMAN 軟件對(duì)LjC3H2進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測分析，結(jié)果表明該蛋白自然分裂位點(diǎn)CS 的峰值為0.134 778，在第22 位；OTHER 的峰值為0.999 885，在第70 位；而信號(hào)肽峰值為0.262，無明顯峰值，即LjC3H2無信號(hào)肽。

2.3 LjC3H2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)情況

運(yùn)用程序工具TMHMM 對(duì)LjC3H2蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜區(qū)分析。結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)氨基酸序列長度506，預(yù)測出的跨膜螺旋數(shù)量為0，跨膜螺旋氨基酸殘基數(shù)量的期望值為4.674 93，蛋白前60 個(gè)氨基酸中，跨膜螺旋的氨基酸量的期望值為4.430 10，位于膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)的總概率為0.221 44，預(yù)測結(jié)果表明LjC3H2沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。通常蛋白質(zhì)跨膜螺旋中的氨基酸殘基多為疏水性氨基酸殘基，親/疏水性分析結(jié)果表明該蛋白偏親水，這與該蛋白缺乏跨膜螺旋結(jié)果是吻合的。

2.4 LjC3H2的基因亞細(xì)胞定位

利用Euk-mPLOC對(duì)LjC3H2蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示LjC3H2蛋白可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上發(fā)揮作用。

2.5 LjC3H2蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)

采用SOPMA 對(duì)LjC3H2的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，α-螺旋（Alpha helix）占比50.20%；無規(guī)則卷曲（Random coil）占比33.00%；β-折疊也稱延伸鏈結(jié)構(gòu)（Extended strand）占比11.66%；β 轉(zhuǎn)角（Beta turn）占比5.14%。表明LjC3H2的二級(jí)結(jié)構(gòu)是以α-螺旋為主要類型，無規(guī)則卷曲較多，β-折疊即延伸鏈結(jié)構(gòu)數(shù)量較少。在SWISS-MODEL對(duì)LjC3H2進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的比較建模分析，結(jié)果表明，LjC3H2與細(xì)胞色素P450的三級(jí)結(jié)構(gòu)較相似（圖2）。

圖2 LjC3H2和細(xì)胞色素P450建模預(yù)測的三級(jí)結(jié)構(gòu)比較

2.6 LjC3H2與不同植物間的進(jìn)化關(guān)系

以LjC3H2氨基酸序列為樣本進(jìn)行Blast 比對(duì)，獲得了37 種植物40 個(gè)C3H 蛋白氨基酸序列樣本，對(duì)這些樣本進(jìn)行同源比較和分子進(jìn)化分析。結(jié)果表明，LjC3H2基因編碼蛋白的氨基酸序列與薊、桔梗的C3H 親緣關(guān)系較近，而金銀花另一個(gè)C3H 蛋白則與龍葵、粗壯女貞、黃芩、芝麻、紅花釣鐘柳、地黃以及桃兒七等植物的進(jìn)化關(guān)系較近（圖3），這表明金銀花中兩個(gè)C3H 拷貝的分子進(jìn)化路線可能略有不同。此外，這兩個(gè)蛋白質(zhì)在數(shù)據(jù)庫中的命名和作用對(duì)象也略有不同，其中LjC3H可能更多作用于香豆?；ヮ悾琇jC3H2則多作用于香豆酸。

圖3 37種植物中的40個(gè)C3H蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化情況

3 結(jié)論與討論

LjC3H2作為細(xì)胞色素P450 CYP98A 亞家族成員，具有該亞家族蛋白高度相似的空間結(jié)構(gòu)，該蛋白分子偏親水，沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，沒有信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，無規(guī)則卷曲較多，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。分子進(jìn)化方面，與薊、桔梗的C3H 親緣關(guān)系較近，與同屬于金銀花的LjC3H親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

金銀花中有2 個(gè)C3H 蛋白的基因拷貝[11-12]，對(duì)LjC3H2的研究相對(duì)成熟，因此本文選擇以LjC3H2作為研究對(duì)象，進(jìn)行深入分析。結(jié)果表明，該酶沒有跨膜結(jié)構(gòu)域、沒有信號(hào)肽，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，關(guān)于該酶的各類分析表明，該酶主要在細(xì)胞內(nèi)起作用。

對(duì)多種植物的C3H 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明金銀花已知的2 種C3H 蛋白在進(jìn)化上的親緣關(guān)系并不接近，表明這2 個(gè)拷貝的基因在進(jìn)化上可能分屬兩條不同的路線，有一定的區(qū)別。即這2 個(gè)基因拷貝表達(dá)的酶蛋白在功能上可能存在細(xì)微的差異。后續(xù)研究可進(jìn)一步對(duì)這2個(gè)基因表達(dá)的酶蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行精細(xì)分析和比較，并通過試驗(yàn)方法研究兩者的差異。

本文從數(shù)據(jù)庫收集了37 種植物40 個(gè)C3H 蛋白序列，利用生物信息學(xué)分析工具，以LjC3H2為研究對(duì)象，對(duì)該基因表達(dá)酶的結(jié)構(gòu)、功能和分類等特點(diǎn)進(jìn)行了分析研究，為今后繼續(xù)研究金銀花C3H 蛋白酶提供參考。