張靖鵬,翟宇晴,張得鈞

(青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院,青海 西寧 810016)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡頹子科沙棘屬植物,其果實(shí)中含有維生素C、維生素E、氨基酸、胡蘿卜素、黃酮類、多酚類等多種生物活性物質(zhì),而其葉片中富含茶多酚、氨基酸、脂肪、咖啡堿等成分[1].經(jīng)對沙棘葉分別以甲醇、水、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯為提取劑進(jìn)行提取,發(fā)現(xiàn)其提取物均具有一定的抗氧化活性[2].此外,研究發(fā)現(xiàn)沙棘葉提取物[5]具有調(diào)節(jié)糖代謝及降糖功效.經(jīng)驗證,10%沙棘葉含藥血清可降低高脂細(xì)胞模型的脂質(zhì)累積和降低細(xì)胞內(nèi)的TG、TC水平[3].此外,沙棘葉可以通過抗氧化酶的水平進(jìn)而減低黃曲霉毒素產(chǎn)生的氧化應(yīng)激作用[4].

普洱茶是由毛茶[Camelliasinensfs(Linn.)var.assamica(Masters)Kitamura]的鮮葉制作而成的,期間經(jīng)曬青、殺青、揉捻、日曬等工序,再采用特殊的“渥堆”工藝后發(fā)酵而成[5].研究表明,普洱茶中富含茶多酚、咖啡堿、茶素、茶單寧、維生素等活性成分,具有降血脂[6]、緩解酒精性脂肪肝[7]及抗氧化[8]等功效,而其具有的降血脂的作用可能是通過影響鯊烯合成酶催化水平,抑制膽固醇合成,降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度及參與肝細(xì)胞代謝過程實(shí)現(xiàn)的[6].

茶粉又稱茶精、速溶茶,是以成品茶為原料,經(jīng)提取、濃縮、噴霧干燥等工藝制成的粉末或顆粒狀產(chǎn)品[9].目前,普洱茶粉制備工藝較為完善,產(chǎn)品穩(wěn)定性較高[10].茶粉的提取方法包括水浸提法[11]、乙醇浸提法[12]及酶解法[13],其提取液中的可溶性固形物含量是評價茶粉提取率的重要指標(biāo)之一[11],而得到的茶粉具有較高的茶褐素含量[14],具有較茶相比具有更好的降血脂功效[15].而復(fù)配茶提取液具有更好的口感,如沙棘葉與羅漢果、金銀花復(fù)配,經(jīng)提取、加入甜味劑和酸味劑制得的復(fù)合茶飲料色澤清亮,茶香自然清新,口感清爽[16].綜上所述,將沙棘葉與普洱茶經(jīng)復(fù)配、提取、干燥可能制備出具有更高飲用價值的茶粉.

DPPH、ABTS因反應(yīng)穩(wěn)定、易操控等特點(diǎn)是體外自由基清除能力評價實(shí)驗中常用的指示劑,而總還原能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)與銅離子還原能力(cupric reducing antioxidant power,CuPRAC)則是通過還原金屬離子進(jìn)行的評估的一種體外抗氧化方法[17].

基于生產(chǎn)成本考慮,首先選擇原料配比(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)為研究對象,通過采用單因素分析、Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化沙棘普洱茶水提工藝,后對不同原料配比的沙棘普洱茶粉進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗,進(jìn)而對沙棘普洱茶粉的制備及功效進(jìn)行初步研究,進(jìn)而為沙棘、普洱綜合加工、利用提供一定理論及實(shí)踐參考.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及設(shè)備

沙棘葉(青海西寧大通縣);普洱茶末(云南茶東家茶葉有限公司,云南昆明);DPPH、ABTS;2,9-二甲基-1,10-菲啰啉(新亞銅靈);L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品(Vc)(Scientific Phygene);FRAP(T-AOC)試劑盒(南京建成生物工程研究所);其余試劑均為國產(chǎn)分析純;紫外可見光分光光度計(754PC)(上海元析儀器有限公司);酶標(biāo)儀(ST-360)(上?？迫A生物工程股份有限公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4)(天津賽得利斯實(shí)驗分析儀器制造廠);噴霧干燥機(jī)組(LPG-5)(江蘇先鋒干燥工程有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R5002K)(上海夏豐實(shí)業(yè)有限公司);數(shù)字阿貝折光儀(WYA-3S)(上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司);紫外可見光分光光度計(754PC)(上海元析儀器有限公司);酶標(biāo)儀(ST-360)(上?？迫A生物工程股份有限公司).

1.2 試驗方法

1.2.1 沙棘普洱茶粉工藝

將沙棘葉粉碎并與普洱茶末按照配料比(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)混合,加入純凈水,浸泡 0.5 h 后,在一定溫度、pH、時間下進(jìn)行水提,后進(jìn)行濃縮、噴霧干燥,最終得到沙棘普洱茶粉.

1.2.2 單因素試驗

以不同料液比、提取時間、提取溫度與pH進(jìn)行單因素試驗,考察不同因素對沙棘普洱茶粉料液中可溶性固形物的影響.除變化量外,試驗固定料液比為1∶8(g/mL),提取溫度為 80 ℃,提取時間為 3 h,pH為7,分別研究料液比(1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10 g/mL),提取溫度(60、70、80和 90 ℃、沸騰),提取時間(1、2、3、4和 5 h),pH(5、6、7、8、9)對可溶性固形物的影響.

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素確定3個水平,以料液比、提取時間、提取溫度與pH為試驗因素,以可溶性固形物為響應(yīng)值,采取Box-Behnken中心組合法進(jìn)行4因素3水平試驗設(shè)計,試驗因素水平見表1.

表1 響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計

1.2.4 理化檢測

檢測料液中可溶性固形物使用《GB/T 12143 飲料通用分析方法》中可溶性固形物的檢測方法.檢測不同沙棘葉、普洱茶末原料配比下沙棘普洱茶粉產(chǎn)品中相關(guān)活性化合物含量(包括：沙棘總黃酮、兒茶素、茶多酚及茶褐素),檢測方法：沙棘總黃酮參照《中國藥典2020年第一部》沙棘項下,茶多酚、兒茶素參照《GB∕T 8313—2018 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》,茶褐素參照《NY/T 3675—2020 紅茶中茶紅素和茶褐素含量的測定分光光度法》.

1.2.5 體外抗氧化能力評價

按照最優(yōu)提取工藝參數(shù),分別對沙棘葉、普洱茶末及不同沙棘葉、普洱茶末配比(1∶1、1∶4、4∶1)的沙棘普洱茶粉進(jìn)行提取,后經(jīng)濃縮、干燥制備得到茶粉樣品.

分別稱取沙棘茶粉、普洱茶粉、沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶1)、沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)、沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)及Vc 3.5 mg/mL 樣本溶液,對上述樣本溶液依次進(jìn)行梯度稀釋,得到1.0、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL 濃度梯度的樣本及對照品溶液.

1) DPPH抗氧化能力測定 稱 2 mg DPPH,用乙醇溶解定容至 25 mL,得到DPPH儲備液.吸取DPPH儲備液 15 mL 并用乙醇定容至 25 mL,得到DPPH工作液.于96孔板中加入 200μL 的DPPH工作液,再各自加入 5 μL 樣本溶液和 5 μL Vc溶液,分別作為樣品組和陽性對照組,每隔 5 min 于 517 nm 波長下測定OD值,直至測至 30 min,空白對照組以乙醇代替樣本溶液.DPPH自由基清除率計算公式為：

清除率(%)=(OD1-OD2)/OD1×100%

(1)

式中,OD1為空白對照組吸光度,OD2為樣本組吸光度.

2) ABTS抗氧化能力測定 稱ABTS 57.6 mg,用 0.02 mol/L 醋酸緩沖液溶解,定容至 15 mL.稱過硫酸鉀 6.6 mg,用 0.02 mol/L 醋酸緩沖液溶解,定容至 10 mL.取 5 mL ABTS溶液和 5 mL 過硫酸鉀溶液,混勻后避光反應(yīng) 12 h,得到ABTS母液.吸取 280 μL ABTS母液,用 0.02 mol/L 醋酸緩沖液稀釋至 6.5 mL,避光反應(yīng) 30 min 后,即得ABTS工作液.

于96孔板中加入 200 μL 的ABTS工作液,再各自加入 10 μL 樣本溶液和 10 μL Vc溶液,分別作為樣品組和陽性對照組.每隔 10 min 于 734 nm 波長下測定OD值,直至測至 60 min,空白對照組以乙醇代替樣本溶液.ABTS自由基清除率計算公式為：

清除率(%)=(OD1-OD2)/OD1×100%

(2)

式中,OD1為空白對照組吸光度,OD2為樣本組吸光度.

3) FRAP抗氧化能力測定 以試劑盒提供的實(shí)驗方法進(jìn)行實(shí)驗,于比色皿中加入 1 800 μL FRAP工作液,再分別加入 50 μL 樣本溶液,將其置于25～37 ℃ 下孵育 10 min,于 520 nm 波長下檢測吸光度,根據(jù)吸光度計算公式：

總抗氧化能力(U/mL)=(A1-A2)/0.01÷T×V1/V2

(3)

式中,A1為測定組吸光度,A2為空白組吸光度,T為反應(yīng)時間(30 min),V1為取樣量(mL),V2為反應(yīng)液總體積(mL).

4) CuPRAC抗氧化能力測定 稱取CuCl2·2H2O 4.28 mg 加水溶解,定容 25 mL,搖勻備用;稱 19.27 g 醋酸銨加水溶解,定容至 250 mL,搖勻備用;稱取 164.89 mg 新亞銅靈(2,9-二甲基-1,10-菲啰啉)加無水乙醇溶解,定容至 100 mL,搖勻,避光保存.

吸取新亞銅靈溶液、CuCl2溶液和醋酸銨溶液各 1 mL,分別加入Vc(3.5 mg/mL)溶液10、20、30、40、50、60 μL 后用無水乙醇補(bǔ)足 4 mL,避光反應(yīng) 30 min 后在 450 nm 波長下檢測OD值.做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程.樣本溶液按上述操作加入,加入樣品 2.5 μL,反應(yīng) 30 min 后于 450 nm 波長下檢測OD值.根據(jù)樣品OD值,帶入回歸方程得到對應(yīng)的清除Vc-Cu2+還原能力值.

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,每個實(shí)驗重復(fù)3次.試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析.數(shù)據(jù)采用單因素ANOVA分析,以評價兩組差異的顯著性.使用Design Expert V8.0.5軟件對響應(yīng)面模型進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗結(jié)果及分析

2.1.1 料液比對沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影響

由圖1可知,當(dāng)料液比在1∶5～1∶7時,料液的可溶性固形物隨著水添加量的增加而增加,說明增加水添加量促進(jìn)原料中水溶性成分溶出[18].當(dāng)料液比增加至1∶8以上時,料液中的可溶性固形物含量明顯下降,這是由于過多水對料液起到稀釋作用[19].

2.1.2 水提溫度對沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影響

由圖2可知,當(dāng)溫度在60～80 ℃ 時,料液中的可溶性固形物不斷增加,說明溫度升高可以明顯提高原料中水溶性成分溶出.當(dāng)溫度增加至 80 ℃ 以上時,料液中可溶性固形物出現(xiàn)輕微下降及逐步穩(wěn)定現(xiàn)象,這可能是達(dá)到一定溫度后,使水溶性物質(zhì)已基本完全溶出且溫度過高會破壞部分活性成分,故而使得溫度對其影響不再明顯[19].

圖1 料液比對沙棘普洱茶粉料液中可溶性固形物的影響

圖2 水提溫度對沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影響

2.1.3 水提時間對沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影響

由圖3可知,在提取時間在 3 h 以內(nèi)時,料液中的可溶性固形物不斷增加,說明隨時間增加原料中水溶性成分會不斷溶出.當(dāng)將提取時間增加至 4 h 以上時,料液中可溶性固形物會逐步穩(wěn)定,這可能是一段時間后,水溶性物質(zhì)已基本溶出且部分活性成分有所損失,故而料液中的可溶性固形物含量不再增加[19].

2.1.4 pH對沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影響

由圖4可知,料液中pH值在8以下時,料液中的可溶性固形物不斷增加,當(dāng)將pH值增加至9時,料液中可溶性固形物略有下降,這可能是由于過堿環(huán)境不利于茶多酚等物質(zhì)溶出,故而導(dǎo)致料液中的可溶性固形物含量有所下降[19].

圖3 水提時間對沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影響

圖4 pH對沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗結(jié)果

在單因素的基礎(chǔ)上,選取料液比(A)、水提溫度(B)、水提時間(C)、pH(D) 4個因素為變量,以沙棘普洱茶料液中可溶性固形物為響應(yīng)值,采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件進(jìn)行4因素3水平試驗.實(shí)驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示.

采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸分析,對自變量A、B、C、D和可溶性固形物進(jìn)行多元二項式方程擬合.回歸方程,如下：

Y=-64.804 17-2.483 33×A+0.58×B+2.508 33×C+9.275 00×D+(5.000 00E-003)×A×B+0.025×A×C+0.2A×D-(5.000 00E+003)×B×C+0.025 000×B×D+0.125 00×C×D-0.420 83×A2-(5.083 33E+003)×B2-0.583 33×C2-0.620 83×D2

表2 響應(yīng)面實(shí)驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面方差分析

對回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3.回歸方程顯著性檢驗P<0.05,表明模型具有顯著性;失擬項P=0.826 0>0.05,表明方程擬合程度較高,無明顯失擬存在,此模型成立[20].

可溶性固形物的響應(yīng)面圖見圖5～10,響應(yīng)面圖可以直觀地反映各因素間的交互作用及各因素與響應(yīng)值間的關(guān)系.響應(yīng)面坡度越陡表示兩因素交互作用越大,反之則表示兩因素交互作用不顯著.等高線呈圓形表示兩因素之間交互作用不顯著,呈橢圓形或馬鞍形則表示兩因素之間交互作用顯著[20].

表3 方差分析結(jié)果

續(xù)表3

(A) (B)圖5 提取溫度和料液比的響應(yīng)面(A)和等高線圖(B)

(A) (B)圖6 提取時間和料液比的響應(yīng)面(A)和等高線圖(B)

(A) (B)圖7 pH和料液比的響應(yīng)面(A)和等高線圖(B)

(A) (B)圖8 提取時間和提取溫度的響應(yīng)面(A)和等高線圖(B)

(A) (B)圖9 提取溫度和pH的響應(yīng)面(A)和等高線圖(B)

(A) (B)圖10 pH和提取時間的響應(yīng)面(A)和等高線圖(B)

經(jīng)軟件分析,沙棘普洱茶粉的最佳工藝是：料液比為1∶8(g/mL),提取溫度為 78.4 ℃,提取時間為 2.8 h,pH為8.3,預(yù)測可溶性固形物為4.9%.為了便于控制實(shí)驗條件,將最佳工藝調(diào)整為料液比為1∶8(g/mL)、提取溫度為 79 ℃,提取時間為 3 h,底物pH為8.3.應(yīng)此條件進(jìn)行3次平行試驗,平均可溶性固形物含量為4.8%±0.1%(RSD<2%),與預(yù)測值接近,說明該模型可用于擬合分析,結(jié)果穩(wěn)定可靠,也與其他研究的相關(guān)提取參數(shù)一致[13,21].

2.3 不原料配比下沙棘普洱茶粉活性成分檢測及體外抗氧化實(shí)驗結(jié)果

2.3.1 不同原料配比下沙棘普洱茶粉活性成分檢測

由表4所示,5種配比的沙棘普洱茶粉均含有相關(guān)活性物質(zhì),其中普洱茶粉中各成分含量較高,沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)為3種混合茶粉中活性成分含量最高的,此外沙棘茶粉中沙棘總黃酮含量相對較高.

表4 樣品理化指標(biāo)檢測 (mg/100g)

2.3.2 DPPH自由基清除能力測定

由圖11所示,在相同活性成分濃度含量、反應(yīng)時間條件下,沙棘茶粉與沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)的DPPH自由基清除能力最強(qiáng),普洱茶粉和沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)均有較強(qiáng)的清除能力,沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶1)最弱,且均有劑量依賴性.其中,沙棘茶粉及沙棘普洱茶粉的IC50(半清除率濃度)均在 1.0 mg/mL 以下.45 min 時,3.5 mg/mL 的不同溶液對DPPH自由基清除能力為：Vc>沙棘茶粉>普洱茶粉>沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)>沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)>沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶1).

(A)濃度測試 (B)反應(yīng)時長測試圖11 DPPH抗氧化試驗

2.3.3 ABTS自由基清除能力測定

由圖12所示,在測定范圍內(nèi),沙棘茶粉與沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)的ABTS自由基清除能力最強(qiáng),普洱茶粉與沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)對ABTS的清除能力基本一致,而沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶1)清除能力相對較弱,所有測試成分均具有劑量依賴性,而所有茶粉的IC50均在 1.0 mg/mL 以下.40 min 時,3.5 mg/mL 的不同活性成分溶液對ABTS自由基清除能力為：Vc>沙棘茶粉>沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)>普洱茶粉>沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)>沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶1).

(A)濃度測試 (B)反應(yīng)時長測試圖12 ABTS抗氧化試驗

2.3.4 FRAP抗氧化能力測定

由圖13可知,普洱茶粉、沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)對FRAP鐵離子均有較強(qiáng)的還原能力,而沙棘茶粉則相對較弱.

2.3.5 CuPRAC抗氧化能力測定

由圖14可知,從清除率來看,沙棘普洱茶粉(1∶4)對Cu2+離子的還原能力最強(qiáng),普洱茶粉次之,沙棘普洱茶粉(4∶1)也有較強(qiáng)還原能力,而沙棘茶粉及沙棘普洱茶粉(1∶1)還原能力相對較弱,且均呈現(xiàn)劑量依賴性.

圖13 FRAP抗氧化試驗(濃度測試)

圖14 CuPRAC抗氧化試驗(濃度測試)

3 討論與結(jié)論

研究表明,沙棘葉中富含黃酮類、多酚等營養(yǎng)成分,是開發(fā)成功能性食品、藥品、保健食品等的潛在原材料,此外,通過充分利用沙棘葉,不但可以利用廢棄資源,還可以提高人們健康水平,進(jìn)而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)價值[22].經(jīng)研究表明,沙棘葉水溶提取物對羥基自由基及超氧陰離子自由基均有較強(qiáng)的清除能力,其清除率達(dá)到80%以上[2],進(jìn)一步驗證了沙棘葉中存在抗氧化能力較強(qiáng)的生物活性物質(zhì).普洱茶因其在陳化過程中其品質(zhì)型理化指標(biāo),如茶多酚、茶色素、多糖、氨基酸等均會發(fā)生變化[23],而香氣組分會發(fā)生富集,從而使其更具飲用價值[24].利用其所制作的普洱茶粉能夠顯著提高高血脂癥大鼠肝組織細(xì)胞中GSH-Px酶、SOD酶活力及降低MDA含量,從而起到降低血脂的作用,其抗氧化性明顯高于六堡茶和黑茶粉[15].

本研究基于單因素實(shí)驗、響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗,討論沙棘普洱茶浸提過程中的關(guān)鍵工藝條件,得到了最優(yōu)工藝參數(shù).此外,通過使用體外抗氧化實(shí)驗的方法對不同原料沙棘葉與普洱茶末配比下所制備的茶粉進(jìn)行對比實(shí)驗,實(shí)驗發(fā)現(xiàn)沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)、沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)相對于普洱茶粉、沙棘茶粉均具有較強(qiáng)的綜合體外抗氧化活性,而相關(guān)理化檢測結(jié)果顯示其所含活性成分也相對較高,說明通過沙棘葉與普洱茶的復(fù)配,其茶粉內(nèi)活性成分富集,具有更強(qiáng)的抗氧化活性,更有益于人體健康[25].

本研究通過單因素實(shí)驗及響應(yīng)面法設(shè)計優(yōu)化了沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)水提的最佳工藝條件,結(jié)果表明,沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)的最佳工藝條件為：料液比為1∶8(g/mL)、提取溫度為 79 ℃,提取時間為 3 h,底物pH為8.3.應(yīng)用此條件進(jìn)行3次平行試驗,平均可溶性固形物達(dá)到4.8%.此外,通過對不同配料比的沙棘普洱茶粉進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗,發(fā)現(xiàn)沙棘茶粉及沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)對ABTS、DPPH的清除能力最強(qiáng),普洱茶粉的總抗氧化能力最強(qiáng),沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)對Cu2+的還原能力最強(qiáng).此外,理化指標(biāo)檢測顯示沙棘普洱茶粉相對于單一茶粉所含相關(guān)活性成分(茶多酚、茶褐素及總黃酮)更均衡,進(jìn)一步說明沙棘普洱茶粉可以富集相關(guān)活性成分,提高體外抗氧化能力.由此,經(jīng)過對沙棘普洱茶粉水提工藝及抗氧化能力進(jìn)行研究,可以為其進(jìn)一步綜合利用沙棘、普洱資源進(jìn)而開發(fā)功能性茶粉提供了一定的科學(xué)依據(jù).