張永紅，李巖異 ，劉容麟，呂娜，張衛(wèi)婷

華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司，石家莊 050035

免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）是存在于哺乳動物血液、組織液等中的一類蛋白質(zhì)，當機體免疫系統(tǒng)受到抗原的刺激誘導而產(chǎn)生，能與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，達到中和抗原的作用，以抵抗病毒、過敏原、細菌和毒素等物質(zhì)的侵襲。由于免疫球蛋白的生物學活性，其廣泛應(yīng)用于生化診斷、生物制藥和免疫治療等方面［1］，免疫球蛋白Y存在于許多物種體內(nèi)，從低等的兩棲類、爬行類到高等動物鳥類［2］，它與哺乳動物中的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）具有相同的生物學活性［3］。然而，IgY 不能結(jié)合或激活哺乳動物補體系統(tǒng)、Fc受體和類風濕因子［4］。

隨著新型冠狀病毒的全球大流行，各種病毒的防控研究迫在眉睫。目前針對病毒感染最好的防控手段仍然是被動免疫。被動免疫是將特異性的免疫球蛋白或者抗體直接輸入未經(jīng)免疫的受試者體內(nèi)，從而獲得免疫力。各種病毒疫苗能有效地預防病毒感染，降低疾病的發(fā)生率和死亡率，但疫苗的開發(fā)耗時長且成本高昂，同時還需面臨很多挑戰(zhàn)，例如如何應(yīng)對毒株的變異和抗原的突變等。

在病毒學研究領(lǐng)域，IgY 主要應(yīng)用于病毒性疾病的診斷和治療。IgY 的產(chǎn)生一般只需要2 個月時間，接種母雞可以生產(chǎn)含有保護性IgY 抗體的雞蛋［5］，這些抗體可以很容易地加工成持久且易于儲存的凍干產(chǎn)品。在抗病毒方面，通過IgY被動免疫，能夠為人類和動物提供快速和及時的保護，抵抗病毒感染［6］。因此，在一些突發(fā)情況下，免疫球蛋白治療策略能夠為免疫人群或動物在窗口期提供一種安全、緊急的治療方案［7］。近期關(guān)于IgY 的綜述主要集中在其生產(chǎn)工藝、疾病診斷方面，對于病毒性疾病的治療少有報道，本綜述通過對IgY 特性的最新研究、生產(chǎn)技術(shù)的進展進行報道，重點介紹了IgY 在病毒性疾病治療方面的應(yīng)用，以期為IgY 在病毒感染性疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供一些啟示。

1 IgY的抗體性質(zhì)

IgY 和IgG 均具有典型的免疫球蛋白的空間構(gòu)象（圖1），兩者由兩條相同的重鏈和輕鏈組成，通過二硫鍵結(jié)合在一起。它們具有可變區(qū)和恒定區(qū)，其中可變區(qū)識別并結(jié)合抗原，恒定區(qū)提供效應(yīng)功能。它們通過與抗原特異性地結(jié)合，達到中和抗原的作用，以抵抗病毒、過敏原細菌和毒素等物質(zhì)［8］。

圖1 IgY和IgG的結(jié)構(gòu)圖Figure 1 The structural diagram of IgY and IgG

IgY 和IgG 雖然存在功能同源性，但在分子量、結(jié)構(gòu)和生化功能上存在顯著差異。IgY 分子量更高，約為180 kD（重鏈65 kD，輕鏈25 kD）［9］；IgY 的重鏈由4 個恒定區(qū)和1 個可變區(qū)組成；IgY沒有鉸鏈區(qū)，而IgG 有一個鉸鏈結(jié)構(gòu)；IgY 的疏水基團多于IgG，這使得它更適于脂類含量豐富的卵黃環(huán)境。IgY 這種特殊結(jié)構(gòu)致使擺動性、柔韌性下降；與IgG 相比，IgY 穩(wěn)定性較好，具有更強的抗蛋白酶水解功能［10］。

2 IgY抗體的生產(chǎn)

最初的IgY 生產(chǎn)工藝是給肉雞接種目標抗原，誘導體液免疫，其血清能夠產(chǎn)生特異性的免疫球蛋白，同時作為一種防御措施，免疫球蛋白能夠從血清中轉(zhuǎn)移到蛋黃中從而被動保護發(fā)育的雛雞［11］。一般IgY 產(chǎn)生的量占雞總抗體的1%～10%，每個蛋黃大約能提供100 mg 的IgY 產(chǎn)量?？贵w滴度受多種因素的影響，如抗原類型和劑量、佐劑的使用、接種途徑、接種頻率、鳥類的發(fā)育階段等［10］。所需的接種次數(shù)取決于抗原的類型和劑量，以及所使用的佐劑。產(chǎn)蛋期前必須進行至少兩次接種，間隔時間為4～6周。

佐劑具有增強作用［12］，可誘導產(chǎn)生高滴度的抗體。弗氏完全佐劑（Freund's adjuvant complete，F(xiàn)CA）和非弗氏完全佐劑（Freund's adjuvant incomplete，F(xiàn)IA）是IgY 生產(chǎn)中常用的佐劑［13］。雖然佐劑在注射部位能誘導炎癥反應(yīng)，但研究結(jié)果顯示鳥類比哺乳動物更耐受FCA［14］。CPG寡脫氧核苷酸（CPG oligonucleotide，CPG-ODN）作為一種新型的佐劑能夠減少動物的疼痛并顯著提高IgY的產(chǎn)量［15］?，F(xiàn)在主要的接種途徑是雞胸部肌肉注射，與雞腿部或脖子部位注射相比，這種注射方式損害較小，并且能產(chǎn)生與皮下免疫相當?shù)目贵w量［16］。此外，抗原也可以通過口服給藥［17］。

目前，有一些規(guī)?；⒊墒斓姆椒軌驈碾u蛋黃中有效提取IgY 活性成分。主要方法是蛋黃中去除脂蛋白后，形成水溶性的中間體，后續(xù)進行抗體的沉淀和提純。IgY 純化方法有聚乙二醇沉淀法、硫酸銨沉淀法、超過濾法、凝膠過濾法、親硫凝膠色譜法和離子交換層析法等。目前，提取IgY 的方法較為常用的是聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000 沉淀法。提取方法會影響產(chǎn)率和最終純度，選擇何種提取方法取決于研究目的、純化程度、提取規(guī)模、成本以及環(huán)境條件［17］。

3 IgY 抗體在病毒感染性疾病治療方面的應(yīng)用

3.1 流感病毒

流感是一種由流感病毒家族（通常分為甲、乙、丙三型）［18］引起的具有高度傳染性的呼吸道疾病。雖然流感通常是一種自限性疾病，但是也會出現(xiàn)肺炎和器官衰竭等可導致死亡的并發(fā)癥，尤其對于易感人群。流感病毒幾乎每年都會因抗原漂移而出現(xiàn)新的變異病毒株，盡管研究者針對新的毒株，一直在努力開發(fā)新型有效的流感病毒疫苗，但疫苗也只能將流感疾病的發(fā)生率降低約50%［19-20］。由于疫苗接種和抗病毒藥物的局限性，抗流感IgY 可能是一種低成本和快速的預防方法。Nguyen 等［21］發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)給予50 μL 抗流感H5N1（hemagglutinin 5，neuraminidase 1）IgY，通過與病毒表位結(jié)合，能夠阻止流感病毒進入小鼠體內(nèi)，預防其感染H5N1病毒。

針對各種流感病毒株開發(fā)的IgY 是一種有效的流感治療方法。Wallach 等［22］生產(chǎn)了針對H1N1（hemagglutinin 1，neuraminidase 1）、H3N2（hemagglutinin 3，neuraminidase 2）和H5N1 流感病毒株的IgY，體外血清中和實驗和血凝抑制試驗證實IgY 抗體具有抑制同源毒株的作用（表1）。體外實驗發(fā)現(xiàn)，針對乙型流感病毒（influenza B viruses，IBV）的IgY同樣具有抑制血凝素和神經(jīng)氨酸酶的活性，并能夠抑制病毒的復制。當鼻內(nèi)給予小鼠抗IBV IgY 時，可預防乙型流感的發(fā)生和減緩輕型疾病的進展［23］。

表1 IgY抗體在部分病毒感染性疾病中的作用Table 1 The role of IgY antibody in some viral infectious diseases

3.2 輪狀病毒

輪狀病毒是兒童腹瀉的最常見原因，目前臨床上尚無治療輪狀病毒感染的有效藥物，一般處理方法是補充水和電解質(zhì)。Rahman 等［24］進行了一項隨機安慰劑對照試驗，以評估IgY對輪狀病毒的療效。在這項試驗中，52名輪狀病毒患兒每天4次，每次1袋口服卵黃蛋白混合物，該混合物是通過用兩種輪狀病毒株免疫母雞獲得的。研究人員發(fā)現(xiàn)，這種治療方法減少了口服補液的用量，縮短了病程，并且特異性IgY能夠以劑量依賴的方式抑制細胞損傷和輪狀病毒的粘附［25］。此外，還有一項隨機安慰劑對照試驗，參與對象為輪狀病毒腸炎患兒，每天3 次口服1.0 g 抗輪狀病毒雞卵黃免疫球蛋白，比較IgY與益生菌的治療效果。結(jié)果顯示，IgY 比益生菌能更有效地縮短病程，并顯著降低腹瀉的頻率［26］。Wang 等［27］對17 項隨機臨床試驗中2 626 名輪狀病毒腹瀉嬰兒進行了分析。其中，1 347 名口服抗輪狀病毒IgY 進行治療，1 279名接受常規(guī)治療，結(jié)果表明，抗輪狀病毒IgY 明顯比常規(guī)治療更有效。以上結(jié)果表明IgY 能更有效地治療輪狀病毒腸炎。

3.3 寨卡病毒

寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）主要由伊蚊傳播，是西半球新出現(xiàn)的一種病原體。目前，還沒有針對寨卡病毒感染的有效藥物或疫苗。已有研究發(fā)現(xiàn)，ZIKV IgY 在斑塊減少中和試驗中，產(chǎn)生的保護作用大于50%，并且ZIKV IgY 在體外不產(chǎn)生抗體依賴的增強作用（antibody-dependent enhancement，ADE）［28］。腹腔注射1 mg ZIKV 特異性IgY，可以保護小鼠3 周內(nèi)免受致命的ZIKV 攻擊（表1）。該研究證明了鵝源性抗ZIKV IgY 在體外和體內(nèi)的有效性，且研究提出多克隆ZIKV特異性IgY 可能為寨卡病毒感染提供了一種可行的無ADE的被動免疫方法。

3.4 肝炎病毒

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是引發(fā)大多數(shù)肝炎甚至死亡的原因［34］。但就乙型肝炎而言，雖然有預防的疫苗，但還沒有有效的治療方法，而對于丙型肝炎則尚無可用疫苗［35］。因此，開發(fā)治療和預防的藥物仍是當務(wù)之急。Guo 等［36］曾嘗試用禽戊型肝炎病毒重組抗原表位免疫禽類，制備出抗戊型肝炎病毒IgY，但所制備的抗體在體外不具有抗感染的保護作用和中和作用。在病毒性肝炎領(lǐng)域，利用IgY 治療肝炎仍是一個有待探索的目標。盡管接種疫苗有效，但人類的疫苗接種率很低，在資源有限的情況下可能無法獲得正規(guī)的免疫療法，IgY 作為治療人類感染HBV 的方法也可能值得評估（表1）。

與人類HBV 相似，鴨乙肝病毒感染可導致慢性肝炎、纖維化、肝硬化和肝細胞癌［37］。在接種鴨乙肝病毒疫苗的鴨產(chǎn)的蛋黃中發(fā)現(xiàn)了特異性的高滴度IgY［38］。

3.5 埃博拉病毒

埃博拉病毒（Ebola virus，EBoV）感染較為罕見，但在人類和非人類靈長類動物中可導致高死亡率。目前，對抗EBoV 主要有恢復期血漿、單克隆抗體等方法。雖然EBoV 治療性抗體具有良好的應(yīng)用前景，但局限性仍然十分突出。首先，恢復期血漿的來源和安全性有限，阻礙了其應(yīng)用。其次，單克隆抗體具有制備周期長、生產(chǎn)成本高、運輸和儲存條件嚴格等劣勢。此外，埃博拉疫情主要發(fā)生在溫帶和較貧困的非洲地區(qū)，這也限制了治療性抗體的應(yīng)用。

已有研究發(fā)現(xiàn)用編碼EBoV 的糖蛋白對母雞進行免疫，并可以誘導母雞產(chǎn)生高滴度的IgY 抗體。小鼠腹腔注射高劑量IgY（106NAU·kg-1）可達到完全的保護作用，而注射低劑量IgY（104NAU·kg-1）的小鼠則表現(xiàn)出部分的保護作用（表1）［29］。低成本及大規(guī)模生產(chǎn)和避免抗體依賴性增強的優(yōu)勢可能使抗埃博拉病毒IgY 成為一種新穎的藥物。

3.6 中東呼吸綜合征冠狀病毒

中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome，MERS-CoV）是一種不斷進化的人畜共患病毒，可引起人類致命的呼吸道疾?。?9-40］，于2012 年首次被發(fā)現(xiàn)［41］。雖然大多數(shù)病例是在中東報告的，但該病毒有可能引起全球大流行。目前還沒有獲批的治療方法或疫苗［42］。

已有研究利用體外中和實驗評估了MERSCoV 刺突蛋白特異性的IgY 對MERS-CoV 感染的中和效果。給雞注射純化的MERS-CoV 重組S1蛋白，在免疫后第7 周，可產(chǎn)生特異性IgY。免疫印跡實驗表明，IgY 抗體能特異性結(jié)合MERSCoV S1 蛋白。免疫熒光實驗證實，抗S1 IgY 抗體也能識別細胞內(nèi)的MERS-CoV。斑塊減少和微量中和試驗顯示，抗S1 IgY 抗體在感染MERS-CoV的小鼠Vero 細胞中能有效中和MERS-CoV，肺組織中病毒抗原表達量明顯減少，炎癥反應(yīng)明顯減輕（表1）［30］。數(shù)據(jù)表明，抗MERS-CoV S1 IgY可以作為MERS-CoV感染的潛在候選藥物。

3.7 其他病毒

3.7.1 漢坦病毒 漢坦病毒肺綜合征（Hantavirus pulmonary syndrome，HPS）是一種主要由安第斯病毒（Andes virus，ANDV）感染引起的罕見、嚴重和潛在致命的呼吸道疾?。?3］，目前還沒有有效的治療方法［44］。Brocato 等［31］研究發(fā)現(xiàn)IgY 抗體在體外具有中和ANDV 的能力。鼻內(nèi)給予ANDV 攻擊敘利亞倉鼠8 d后，給予≥5 000 NAU·kg-1抗ANDV的IgY，體外斑塊減少中和實驗檢測發(fā)現(xiàn)，IgY抗體能有效地中和ANDV；給予12 000 NAU·kg-1鴨蛋來源的IgY/IgY△Fc 可保護倉鼠免受ANDV 的攻擊（表1）。這表明IgY作為ANDV感染后預防HPS發(fā)病的治療方法值得評估。

3.7.2 腸道病毒71(enterovirus 71,EV71) EV71病毒感染通常是輕微的，如手足口病和皰疹性咽峽炎，但偶爾會導致嚴重的疾病，如無菌性腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹，甚至對新生兒致命的腦炎［45］。目前尚無治療人類EV71 型病毒感染的常規(guī)療法。研究人員評價了卵黃免疫球蛋白（IgY）對人腸病毒71 型（EV71）的被動保護作用。以滅活的人EV71 病毒為抗原免疫母雞，純化蛋黃中的IgY。結(jié)果表明，從第一次免疫后第3 周開始，IgY 特異性抗體滴度升高；免疫后3～18周，卵黃總IgY 含量為每蛋黃190±26 mg，特異IgY 平均濃度為每蛋黃6.34±3.38 mg（表1）［32］。EV71 攻毒小鼠實驗結(jié)果表明，無論是腹腔注射還是口服給藥，EV71 特異性IgY 都能顯著降低EV71 感染幼鼠的發(fā)病率和死亡率。

3.7.3 牛呼吸道合胞病毒 牛呼吸道合胞病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）和人類呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV）是兩種密切相關(guān)的病毒，分別是犢牛［46］和幼兒嚴重呼吸綜合征的主要病因。兩種病毒感染的流行病學和發(fā)病機制非常相似［47］。為了預防該疾病，被動免疫可以成為傳統(tǒng)疫苗接種的一種實用替代方案。Ferella 等［33］對雞卵黃IgY 的產(chǎn)生及其體外中和BRSV 的能力進行了評價（表1）。純化的抗BRSV IgY 特異性識別BRSV 并能中和該病毒，說明IgY 可以作為治療RSV 感染的潛在藥物。

4 展望

通過采用單克隆抗體或恢復期血漿中的抗體可以有效地治療各種傳染病，但抗體的應(yīng)用局限性仍然十分突出。例如，恢復期血漿來源的有限性和單克隆抗體生產(chǎn)的高成本等缺點，均阻礙了抗體在病毒性疾病治療方面的應(yīng)用。特異性抗病毒藥物和疫苗的研發(fā)周期長、生產(chǎn)工藝復雜、成本高，因此有必要探索開發(fā)一種針對病毒感染性疾病更為快捷、經(jīng)濟、有效的替代療法。IgY 具有中和體內(nèi)病原體的能力，同時具有易生產(chǎn)、成本低、起效快等優(yōu)點。IgY 抗體口服或鼻內(nèi)給藥，對可能定植、感染或損害胃腸道和呼吸道的病原體，發(fā)揮廣泛的中和能力，達到優(yōu)良的治療效果。雖然在病原體感染前服用IgY，已被證實具有顯著的保護作用，但針對血液循環(huán)中或定位于特定區(qū)域的特定病原體，IgY 抗體的中和作用可能還需要進一步評估。通過與生物工程技術(shù)的結(jié)合（如基因重組技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)），IgY 抗體可以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。隨著對IgY 技術(shù)研究和應(yīng)用的不斷深入，IgY 的前景會越來越廣闊。未來IgY 有望成為一類新型藥物，為人類疾病的治療和預防帶來全新的視角和希望。