章寅，賈軍偉，白藍，陳一帆，阮功成，呂貝貝*，潘愛虎*

1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價（環(huán)境）重點實驗室；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（上海），上海 201106；2.越南北江農(nóng)林大學(xué)，越南 北江 21000

轉(zhuǎn)基因技術(shù)屬于基因工程領(lǐng)域的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)育種技術(shù)的核心技術(shù)［1］，它通過打破物種間的界限，從而實現(xiàn)作物目標(biāo)性狀的定向改變，在緩解資源約束、減少生態(tài)環(huán)境污染、改進農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量、節(jié)水增效、拓展農(nóng)業(yè)功能等方面顯示出重要作用和巨大潛力［2］，農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為世界各國增強農(nóng)業(yè)核心競爭力的戰(zhàn)略選擇［3］。

發(fā)展轉(zhuǎn)基因是我國農(nóng)業(yè)的重大戰(zhàn)略決策。2020 年2 月26 日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳印發(fā)關(guān)于《2020 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村科教環(huán)能工作要點》的通知中提到，組織實施轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項，進一步強化生物育種技術(shù)研究和產(chǎn)品熟化。轉(zhuǎn)基因?qū)⒊蔀楸Ｕ衔覈Z食安全、實現(xiàn)種業(yè)振興的重要手段之一。轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準能為轉(zhuǎn)基因食品的有效標(biāo)識、科學(xué)監(jiān)管、推廣應(yīng)用提供重要的技術(shù)支撐。詳細有效的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準方法驗證指南將為我國轉(zhuǎn)基因標(biāo)準體系的應(yīng)用推廣提供參考和技術(shù)指導(dǎo)。

1 轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準體系

轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準是農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理必不可少的技術(shù)保障［4-7］。在《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》等配套管理辦法的指導(dǎo)下，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局等相關(guān)部門組織制定了轉(zhuǎn)基因生物安全檢測標(biāo)準體系框架和標(biāo)準修制訂規(guī)劃［4，8-9］。

現(xiàn)有標(biāo)準中覆蓋了大豆、水稻、玉米、油菜、棉花、小麥、苜蓿、甜菜、番茄等轉(zhuǎn)基因作物，以及常用的抗病毒、抗蟲及耐除草劑基因、報告基因、內(nèi)標(biāo)準基因等檢測項目［10］。檢測標(biāo)準在被相應(yīng)的實驗室使用之前，需要實驗室按照《ISO/IEC17025：2017 檢測和校準實驗室能力的通用要求》或《CNAS-CL01：2018 檢測和校準實驗室能力認可準則》的要求開展方法驗證工作，證實實驗室具備進行轉(zhuǎn)基因準確檢測的能力。但是上述兩項標(biāo)準只給出了方法驗證的定義，并沒有具體開展的操作指南，同時現(xiàn)有的文獻中關(guān)于轉(zhuǎn)基因檢測方法的驗證缺少科學(xué)性、有效性的參考依據(jù)，故對于開展轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準的方法驗證分析研究有迫切的需求。

2 轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準方法驗證的關(guān)鍵點

2.1 儀器設(shè)備檢定校準

轉(zhuǎn)基因檢測數(shù)據(jù)一部分主要依靠儀器設(shè)備直接獲得，因此儀器設(shè)備的狀態(tài)對檢測結(jié)果有著直接的影響。開展標(biāo)準方法驗證之前需要確認儀器設(shè)備的靈敏度、準確度、穩(wěn)定性是否滿足要求。

轉(zhuǎn)基因檢測實驗室主要以出具定性結(jié)果為主，對儀器設(shè)備的性能指標(biāo)更加重視。關(guān)鍵設(shè)備如定性PCR 儀、實時熒光PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)等目前缺乏檢定或校準規(guī)程，故無法送至計量檢定部門進行檢定或校準，實驗室可以參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織的儀器比對或周期性地開展內(nèi)部校準和功能性檢查。其他關(guān)鍵設(shè)備如電子天平、移液器等則需送至計量檢定部門檢定或校準。

2.2 關(guān)鍵試劑及標(biāo)準物質(zhì)驗收

針對轉(zhuǎn)基因定量檢測標(biāo)準［11］，標(biāo)準物質(zhì)樣品是檢測結(jié)果可比、有效和可溯源的重要保障。檢測標(biāo)準要求在驗證工作開始前，需準備相對應(yīng)的標(biāo)準物質(zhì)樣品［12］。目前，有資質(zhì)研制轉(zhuǎn)基因標(biāo)準物質(zhì)的單位/機構(gòu)包括美國油脂化學(xué)家學(xué)會、歐盟聯(lián)合研究中心、中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心等［13］。標(biāo)準物質(zhì)也分為基體標(biāo)準物質(zhì)、基因組DNA 和質(zhì)粒DNA 標(biāo)準物質(zhì)［14-16］。方法驗證時需要根據(jù)實際的樣品種類、含量以及形態(tài)特征選擇合適的標(biāo)準物質(zhì)。通過標(biāo)準物質(zhì)的測定值來核實標(biāo)準驗證的有效性和準確性［17］。

除了標(biāo)準物質(zhì)，DNA 提取試劑盒、DNA 聚合酶、引物、探針、PCR 反應(yīng)緩沖液等也是轉(zhuǎn)基因檢測中的關(guān)鍵試劑耗材，標(biāo)準驗證過程中需要對其進行嚴格的驗收，并做好驗收記錄。

2.3 技術(shù)參數(shù)驗證

精密度、線性范圍、檢出限和定量限是標(biāo)準驗證中需要進行有效驗證的特性參數(shù)，上述指標(biāo)在食品理化檢測標(biāo)準中有詳細的操作步驟和技術(shù)要求，轉(zhuǎn)基因檢測屬于分子生物學(xué)檢測范疇，缺少此類的驗證技術(shù)指導(dǎo)。國際上進行轉(zhuǎn)基因檢測方法驗證的研究可參考歐盟聯(lián)合研究中心的權(quán)威指南文件《Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods》（EUR 24790 EN，JRC）。上述指南中規(guī)定，準確度驗證至少選擇包括接近定量限在內(nèi)的3 個不同濃度水平進行驗證，每個濃度水平要得到16 個PCR平行結(jié)果，平均值通過一定的計算公式計算，結(jié)果應(yīng)在可接受參考值的±25%內(nèi)。重復(fù)性驗證主要通過PCR 平行試驗進行評估，選取5%、1%、0.5%、0.1%這4 個不同轉(zhuǎn)基因含量的樣品進行檢測，每個水平至少要得到16個獨立測量結(jié)果，計算得到相對可重復(fù)性標(biāo)準差，要求結(jié)果應(yīng)在可接受參考值的±25%內(nèi)。定量限的驗證用一個低轉(zhuǎn)基因濃度的陽性對照樣品的至少10次PCR平行重復(fù)來測量，如果所有的平行重復(fù)結(jié)果都是陽性，這表示實驗室的定量限低于或等于該標(biāo)準中設(shè)定的陽性對照水平［18-19］。

2.4 環(huán)境區(qū)域隔離

在開展驗證之前，需要保證實驗環(huán)境未被污染。轉(zhuǎn)基因檢測主要針對DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子，檢測方法又具有高靈敏性，實驗室需要重點考慮氣溶膠污染和交叉污染。因此日常實驗室需要有效分區(qū)，檢測區(qū)和實驗室要隔離，可設(shè)置為試劑準備區(qū)、樣本準備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物檢測區(qū)等。對空調(diào)、生物安全柜等設(shè)施定期保養(yǎng)維護。有條件的實驗室安裝空氣過濾系統(tǒng)，并時常進行房間通風(fēng)，定期進行紫外線照射，有效控制氣溶膠對標(biāo)準方法驗證的影響［20-21］。

3 轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準方法驗證工作建議

3.1 積極參加能力驗證工作

實驗室內(nèi)自身開展的轉(zhuǎn)基因方法驗證工作屬于內(nèi)部質(zhì)量控制方法的一種，能有效監(jiān)控實驗室在技術(shù)能力、資源配置、體系保證等方面的符合程度，但該方法無法有效消除實驗室內(nèi)誤差，而參加能力驗證則可以很好地解決這一問題。通過參加權(quán)威能力驗證單位組織的驗證工作，轉(zhuǎn)基因檢測實驗室可直觀判定本實驗室檢測結(jié)果的準確性，及時識別出實驗室存在的質(zhì)量問題，從而更好地評價轉(zhuǎn)基因標(biāo)準方法驗證工作。

3.2 注重積累定量檢測方法驗證經(jīng)驗

現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準以定性檢測為主，在方法驗證過程中缺乏對數(shù)據(jù)定量結(jié)果的驗證工作。隨著轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度在中國及國際上的不斷推行，很多國家不僅要求對轉(zhuǎn)基因食品進行定性檢測，更加會對定量檢測提出需求，故轉(zhuǎn)基因檢測實驗室需要加強對檢測數(shù)據(jù)真實性、準確性等方面的驗證工作，同時要對數(shù)字PCR 等一系列定量檢測儀器的計量校準工作提前準備。國外轉(zhuǎn)基因含量標(biāo)識的閾值一般在0.9%～5%之間［22］，標(biāo)準方法在驗證過程中要更加注重這幾個點的驗證工作，有條件時還需要完成不確定度的評價工作，以便為標(biāo)準方法的驗證工作提供更加全面完善的信息。

3.3 拓展標(biāo)準物質(zhì)的日常質(zhì)量控制

轉(zhuǎn)基因檢測過程中，要同時設(shè)置陰性對照、空白對照和陽性對照，以此來確保實驗過程的可塑性和可比性，故實驗室要將標(biāo)準物質(zhì)納入到日常的質(zhì)量控制中。標(biāo)準物質(zhì)可以購買大豆、玉米、油菜等作物特定品系的陽性標(biāo)準物質(zhì)，也可以購買目前研究比較熱門的陽性標(biāo)準質(zhì)粒分子。已有報道將包括CaMV35S 啟動子、NOS 終止子在內(nèi)的8 個調(diào)控原件轉(zhuǎn)化到質(zhì)粒上，形成陽性標(biāo)準質(zhì)粒分子，可用于轉(zhuǎn)基因成分的檢測與研究。該方法不僅能減少陽性物質(zhì)的反復(fù)提取，降低污染，同時能覆蓋大多數(shù)轉(zhuǎn)化體，提高檢測的覆蓋面。

3.4 探索引入國際GLP質(zhì)量管理準則

良好實驗室規(guī)范（good laboratory practice，GLP），作為一種國際認可的實驗室質(zhì)量管理體系，常被應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等重要領(lǐng)域的非臨床安全性評價試驗中。轉(zhuǎn)基因檢測數(shù)據(jù)成為監(jiān)管部門作出行政審批的技術(shù)依據(jù)，直接關(guān)系著我國轉(zhuǎn)基因技術(shù)未來的發(fā)展方向，世界上美國、歐盟等發(fā)達國家均已將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物領(lǐng)域。在將來的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準方法驗證工作中，可以探索引入GLP 準則中的質(zhì)量要求，從而更好保障數(shù)據(jù)的真實性和可追溯性，以期為轉(zhuǎn)基因生物安全管理、研發(fā)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供借鑒。

4 展望

轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)標(biāo)準是保證我國轉(zhuǎn)基因生物安全管理制度順利實施的重要技術(shù)支撐，隨著我國生物育種產(chǎn)業(yè)化的推進，轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化種植和轉(zhuǎn)基因研發(fā)新技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因研究試驗、生產(chǎn)加工、進出口和標(biāo)簽標(biāo)識等方面的監(jiān)管任務(wù)劇增，我國必然需要增加轉(zhuǎn)基因檢測的技術(shù)力量。建立一套詳細、嚴謹?shù)霓D(zhuǎn)基因標(biāo)準方法驗證標(biāo)準規(guī)程，保障檢測結(jié)果的真實性、準確性、可比性和溯源性，有利于各家機構(gòu)統(tǒng)一化、高標(biāo)準地開展方法驗證工作，同時便于監(jiān)管機構(gòu)開展對檢測機構(gòu)的評審考核工作，進一步提高轉(zhuǎn)基因檢測體系的能力水平，促進我國轉(zhuǎn)基因檢測水平與國際對標(biāo)，為我國農(nóng)業(yè)生物安全監(jiān)管工作提供堅強的技術(shù)支撐。未來轉(zhuǎn)基因標(biāo)準方法驗證規(guī)程需要具備以下幾方面的要求。

首先，驗證規(guī)程需要適用多類型機構(gòu)。轉(zhuǎn)基因監(jiān)管的檢測機構(gòu)數(shù)量需要進一步增加，除了部級質(zhì)檢機構(gòu)、出入境檢驗檢疫機構(gòu)等政府實驗室，還應(yīng)將社會實驗室補充進入轉(zhuǎn)基因政府監(jiān)管工作中。這些機構(gòu)在建設(shè)布局、條件水平、質(zhì)量體系、運行模式，檢測能力等方面存在巨大差異，而轉(zhuǎn)基因檢測工作很敏感，公眾關(guān)注度高，檢測數(shù)據(jù)的真實性要求高。驗證規(guī)程要適用大部分的轉(zhuǎn)基因檢測實驗室，以同一尺度開展驗證工作，從儀器設(shè)備檢定校準、關(guān)鍵試劑及標(biāo)準物質(zhì)驗收、技術(shù)參數(shù)驗證、環(huán)境區(qū)域隔離等關(guān)鍵參數(shù)開展驗證工作。

其次，驗證規(guī)程需適用于新型標(biāo)準物質(zhì)。轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準物質(zhì)作為實物標(biāo)準，對支撐轉(zhuǎn)基因檢測工作的開展、數(shù)據(jù)的準確性、有效性和可追溯性具有重要意義。國務(wù)院印發(fā)的《計量發(fā)展規(guī)劃（2021—2035 年）》要求“建立完善以國家基準物質(zhì)、國家標(biāo)準物質(zhì)和工作標(biāo)準物質(zhì)為主要組成部分的標(biāo)準物質(zhì)體系”，要求加快重點領(lǐng)域的標(biāo)準物質(zhì)研制和應(yīng)用。隨著農(nóng)業(yè)農(nóng)村部轉(zhuǎn)基因重大專項“基因檢測標(biāo)準物質(zhì)研制”等項目的實施，我國已經(jīng)具備研發(fā)轉(zhuǎn)基因定量檢測標(biāo)準物質(zhì)的能力［23］。未來除了現(xiàn)有的基體標(biāo)準物質(zhì)、基因組標(biāo)準物質(zhì)，新型的質(zhì)粒標(biāo)準物質(zhì)也將成為方法驗證中重要的標(biāo)準物質(zhì)［24］，其具有制備靈活、不受樣品影響、性質(zhì)簡單、可操作性強等優(yōu)點，將成為轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準方法驗證重要的技術(shù)材料。

最后，驗證規(guī)程需適應(yīng)新型檢測標(biāo)準。目前，國內(nèi)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準體系中的主流技術(shù)為普通PCR，將來隨著轉(zhuǎn)基因作物分子特征分析、精準定量、標(biāo)準物質(zhì)定值等工作的開展，精準定量、快速檢測技術(shù)、高通量檢測技術(shù)、基因編輯產(chǎn)品檢測標(biāo)準數(shù)量將增加［25-26］，實驗室需要做好相應(yīng)的標(biāo)準技術(shù)和標(biāo)準能力的儲備工作。