焦紅燕，李國(guó)超，常亮，李巖異，翟麗麗

1.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，抗體藥物研制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，抗體藥物河北省工程研究中心，石家莊 052160；2.華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司，石家莊 050035

諾如病毒又名諾瓦克病毒（norwalk viruses，NV），是杯狀病毒科（Caliciviridae）諾如病毒屬（Norovirus）中的一種單鏈正義RNA 病毒［1］。大約五分之一的急性胃腸炎（acute gastroenteritis，AGE）是由NoV 引起的，以嘔吐、腹瀉為特征，部分患者出現(xiàn)惡心、發(fā)燒、寒戰(zhàn)和疲勞等癥狀［2］。NoV 在各年齡段均易感，5 歲以下兒童、老年人以及免疫力低下人群尤其嚴(yán)重［3-6］。全球每年約有6.99 億NoV 病例和21.9 萬(wàn)死亡病例，造成的直接治療成本約42 億美元，間接社會(huì)成本約603 億美元［3］。全世界每年死于NoV 相關(guān)疾病的5 歲以下兒童約有7 萬(wàn)人［3］。每年都會(huì)有NoV 的流行和爆發(fā)，我國(guó)5歲以下兒童的感染比例高達(dá)15.6 %［7］。

目前，尚無NoV疫苗或抗病毒藥物獲批使用。NoV胃腸炎患者的治療主要以預(yù)防脫水為主［8］，因此開發(fā)有效的NoV疫苗防范諾如病毒流行尤為重要。本文對(duì)NoV 疫苗的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，重點(diǎn)闡述了病毒樣顆粒（virus like particles，VLP）疫苗、病毒載體疫苗和基于P 顆粒疫苗研究現(xiàn)狀和發(fā)展前景，以期為NoV疫苗的研發(fā)提供新思路。

1 NoV概述

NoV 基因組全長(zhǎng)約7.7 kb，分為3 個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）（圖1A）［8-9］。ORF1 編碼一個(gè)大的多聚蛋白，后續(xù)被切割為6種非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein，NSP），參與病毒的復(fù)制［10］。NoV 衣殼蛋白（norovirus capsid protein，NVCP）VP1由ORF2編碼，其相對(duì)分子質(zhì)量約為58 kD，VP1單體包含一個(gè)保守的外殼S結(jié)構(gòu)域（黃色）和一個(gè)突出的P結(jié)構(gòu)域（藍(lán)色）（圖1B），S結(jié)構(gòu)域形成病毒的二十面體衣殼，而P結(jié)構(gòu)域參與病毒和細(xì)胞受體間相互作用，可與組織血型抗原（histoblood group antigen，HBGA）結(jié)合［11-12］。P 結(jié)構(gòu)域分為P1 和P2 亞結(jié)構(gòu)域，P2亞結(jié)構(gòu)域高度可變，顯示不同變體的特定表位［13］。VP1可通過自組裝產(chǎn)生VLP，VLP與天然病毒粒子具有相似的形態(tài)和抗原性［9］。VP2 是NoV 的次要結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白由ORF3 編碼，可能參與了維持衣殼穩(wěn)定的過程［9，14］。

圖1 NoV基因組及其衣殼結(jié)構(gòu)[15]Fig.1 NoV genome and capsid structure[15]

NoV具有高度的基因多態(tài)性，根據(jù)病毒的VP1衣殼蛋白的氨基酸序列不同，NoV 分為10 種基因型（GⅠ～GⅩ），并且在GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅧ和GⅨ基因組中鑒定出至少35種人類感染基因型［8，16-17］。感染人的NoV主要是GⅠ和GⅡ基因型的成員，其他基因型在人類感染中少有檢出［18-19］。目前，在全世界范圍內(nèi)主要流行的是GⅡ.4 毒株，其變異較快，2～5 年就會(huì)出現(xiàn)一種新的變體。GⅡ.4 sydney 變異株最早于2012 年出現(xiàn)在澳大利亞，隨后在世界范圍內(nèi)普遍流行［6，8］。

2 NoV疫苗研究現(xiàn)狀

疫苗按照性質(zhì)可分為4類，分別是減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗和基因工程疫苗（表1）［20］。傳統(tǒng)疫苗（包括滅活疫苗、減毒活疫苗和亞單位疫苗）的制備需要體外制備大量病原體。由于NoV對(duì)內(nèi)源性干擾素敏感、體外培養(yǎng)時(shí)需要輔助因子（例如膽汁酸、腸道共生菌）等原因，直至2014 年Jones 等才發(fā)現(xiàn)在表達(dá)HBGA 的腸道菌群的輔助下，GⅡ.4-Sydney NoV 毒株可以感染并在人類B細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制［22-23］。2016 年，Ettayebi 等［24］發(fā)現(xiàn)NoV 的GⅠ和GⅡ基因型的多個(gè)毒株可以在干細(xì)胞來源的、非轉(zhuǎn)化的人腸道類腸（human gut like intestine，HIEs）單層培養(yǎng)的細(xì)胞中復(fù)制，然而NoV在這些細(xì)胞中的復(fù)制量并不高。目前，尚沒有合適的用于體外大量培養(yǎng)NoV 的細(xì)胞，因此利用NoV病毒制備疫苗的傳統(tǒng)方法并不適用于NoV疫苗的開發(fā)［25］。

表1 疫苗類型[21]Table 1 Types of vaccines[21]

由于缺乏成功的動(dòng)物模型，抗NoV 藥物和非傳統(tǒng)疫苗的后續(xù)評(píng)價(jià)受到了限制［18］。針對(duì)此問題目前已發(fā)現(xiàn)無菌豬和無菌?？筛腥救祟怤oV GⅡ.4 基因型菌株，但由于動(dòng)物與人的腸道環(huán)境不同，人和動(dòng)物感染的癥狀并不完全相同，因此人類NoV 感染的標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物模型還需進(jìn)一步探索［26-27］。體外評(píng)價(jià)系統(tǒng)中，多項(xiàng)研究表明抗體阻斷VLP 結(jié)合配體（如合成的HBGA、人類唾液、豬粘液素）的效率與對(duì)NoV 的保護(hù)效應(yīng)呈正相關(guān)。目前，實(shí)驗(yàn)室常采用HBGA 體外阻斷試驗(yàn)（合成的 HBGA）評(píng)價(jià)NoV疫苗的保護(hù)效應(yīng)。

2.1 VLP疫苗

VLP 是一種跟病毒結(jié)構(gòu)類似的納米結(jié)構(gòu)，顆粒大小在20～200 nm 間［28］。VLP 由一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白組成，可在細(xì)菌、酵母、昆蟲等多種細(xì)胞中重組表達(dá)并自組裝［29］。根據(jù)有無脂質(zhì)包膜，可將VLP 分為包膜型和非包膜型，其結(jié)構(gòu)蛋白可形成單層、雙層或三層的蛋白衣殼（圖2）［29-30］。病毒衣殼蛋白自發(fā)聚合可以產(chǎn)生具有幾何對(duì)稱性的VLPs，不同的病毒衣殼形成不同的對(duì)稱幾何體，通常為二十面體、球形或桿狀結(jié)構(gòu)［29］。VLP 的多個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)作為高密度的表位，具有高度的免疫原性，可引發(fā)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)［31］。VLP 缺乏病毒遺傳物質(zhì)，不能感染宿主細(xì)胞，具有較好的安全性，在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域越來越受歡迎［32］。

圖2 VLP分類[28]Fig.2 VLP classification[28]

目前，已有3 款基于VLP 的疫苗（乙肝疫苗、宮頸癌疫苗和戊肝疫苗）上市。22 nm 球形乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）表面抗原（HBsAg）疫苗是一種滅活疫苗，最初來源于人血漿，該疫苗于1981 年在美國(guó)獲得許可［33］。1986 年，默克公司用釀酒酵母也生產(chǎn)出22 nm 的HBsAg顆粒人用疫苗RECOMBIVAX HB［33］。第2 種人用VLP 疫苗是2006 年由默克公司研制的人類乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）疫苗［33］。第3 種是由我國(guó)廈門大學(xué)和養(yǎng)生堂萬(wàn)泰公司聯(lián)合研制的戊型肝炎疫苗Hecolin，該疫苗于2012年上市，是全球首款上市戊型肝炎疫苗。Hecolin是由大腸桿菌表達(dá)的重組Ⅰ型戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）ORF2 截短蛋白HEV239（aa368-aa606），經(jīng)純化和折疊后，HEV239 可以自組裝成VLPs 顆粒，而這些顆粒與成熟HEV 病毒粒子的衣殼結(jié)構(gòu)具有高度的相似性［34］。Hecolin 在16～65 歲人群中具有較好的耐受性和較高的保護(hù)率，并且該疫苗在2～8℃長(zhǎng)期保存具有較好的穩(wěn)定性［35］。

由于NoV 存在基因多樣、高度變異且無法在體外大規(guī)模培養(yǎng)等問題，導(dǎo)致NoV 疫苗的研制進(jìn)程緩慢。NoV 的ORF2 編碼的主要衣殼蛋白VP1可以通過自組裝產(chǎn)生VLP，VLP 與天然病毒顆粒具有相似的形態(tài)和抗原性［9］。NoV VP1 衣殼蛋白可以在昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)、植物表達(dá)系統(tǒng)和乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)等多個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。目前，NoV 疫苗研發(fā)主要集中在VLP 疫苗、病毒載體疫苗和基于P 顆粒疫苗等方面?，F(xiàn)階段全球處于臨床階段的NoV 疫苗共有8款，其中6 款為重組蛋白疫苗，1 款為腺病毒載體疫苗，1款為mRNA核酸疫苗（表2）。

表2 全球處于臨床研究的NoV疫苗Table 2 NoV vaccines in clinical research worldwide

武田公司開發(fā)的HIL-214疫苗目前處于Ⅱ/Ⅲ期臨床研究，該疫苗由昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，包含150 μg GⅡ.4 流行株共有序列衍生的GⅡ.4 衣殼蛋白VLP 和50 μg GⅠ.1 衣殼蛋白VLP，純化后的純度達(dá)到95%以上［36-37］。以500 μg 氫氧化鋁為佐劑，肌內(nèi)注射第一劑和第二劑HIL-214疫苗間隔兩個(gè)月，受試者NoV 特異性血清抗體滴度至少增加了3 倍，并且會(huì)誘導(dǎo)對(duì)其他毒株的交叉反應(yīng)［36］。

HIL-214 疫苗中的GⅡ.4 組分是由3 個(gè)流行株的共有序列衍生的，以期能提供對(duì)多株NoV 的多價(jià)保護(hù)［37］。事實(shí)上HIL-214 疫苗的臨床Ⅰ期試驗(yàn)結(jié)果顯示接種疫苗可以快速誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，并阻斷一系列疫苗VLP 和非疫苗VLP 與腸道上皮細(xì)胞配體的結(jié)合［38］。值得注意的是，HIL-214疫苗誘導(dǎo)的抗體能夠結(jié)合接種疫苗時(shí)還未傳播的NoV（GⅡ.4.2012 和GⅡ.4.2006b.P.D302）VLP，并能阻斷這兩種VLP 與腸道上皮配體的結(jié)合［38］。這些數(shù)據(jù)表明接種HIL-214 疫苗能夠誘導(dǎo)一定的交叉免疫保護(hù)作用。然而，該項(xiàng)研究的規(guī)模很?。╪=10），并且抗體結(jié)合和抗體阻斷實(shí)驗(yàn)并不能完全模擬人體免疫系統(tǒng)對(duì)NoV 感染時(shí)的反應(yīng)，因此需要更多的研究來揭示HIL-214 疫苗對(duì)NoV 的多價(jià)保護(hù)。

中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究院黃忠課題組與智飛龍科馬生物制藥有限公司用畢赤酵母異源表達(dá)了NoV 的GⅠ.1、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.17 基因型的VLP，制備了四價(jià)重組諾如病毒疫苗，該疫苗免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生與單價(jià)疫苗相當(dāng)?shù)目贵w水平［18，39］。2019 年5 月30 日，該四價(jià)重組諾如病毒疫苗（畢赤酵母）進(jìn)入臨床研究，現(xiàn)處于Ⅰ/Ⅱ期臨床階段［38］。此外，遠(yuǎn)大賽威信生命科學(xué)（南京）有限公司研發(fā)的四價(jià)重組諾如病毒疫苗（漢遜酵母）包含GⅡ.2、GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.17 4 種基因型的VLP，該VLPs形態(tài)和免疫原性與天然病毒相似，可與宿主受體HBGA 結(jié)合，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)諾如病毒的免疫應(yīng)答。四價(jià)重組諾如病毒疫苗（漢遜酵母）于2023 年10 月11 日在我國(guó)獲批開展臨床Ⅰ期試驗(yàn)。

目前，臨床上最高價(jià)NoV 疫苗是康華生物研制的由畢赤酵母表達(dá)的重組六價(jià)諾如病毒疫苗。將GⅠ.1、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.6 和GⅡ.17 的VP1基因序列經(jīng)酵母遺傳密碼子優(yōu)化后，插入pPinkhc 中，分別轉(zhuǎn)入畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，用BMGY（buffered glycerol-complex medium）培養(yǎng)基，28 ℃，220 r·min-1培養(yǎng)，甲醇作為誘導(dǎo)劑［7］。純化后VLP純度達(dá)到95 %以上，電鏡檢測(cè)VLP 顆粒完整，大小均一，獲得的VLP 結(jié)構(gòu)完整、性能穩(wěn)定［7］。用該疫苗免疫小鼠后可誘導(dǎo)持久、高滴度的抗體反應(yīng)，并產(chǎn)生特異性的阻斷抗體和T 細(xì)胞免疫反應(yīng)［7］。該疫苗于2023 年2 月28 日在澳大利亞獲批進(jìn)入臨床試驗(yàn)，于2023 年9 月7 日在美國(guó)獲批進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

2.2 病毒載體疫苗

病毒載體疫苗可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行翻譯和修飾。減毒活疫苗在各種疫苗中免疫效果最好、免疫持續(xù)時(shí)間最久，但是NoV 在體外不能大量培養(yǎng)，因此研發(fā)NoV 的減毒活疫苗和滅活疫苗不能實(shí)現(xiàn)，復(fù)制病毒載體疫苗提供了一種既不需要完整病原體參與也不需要培養(yǎng)病原體的活疫苗方法［1，40］。

2.2.1 處于臨床階段的病毒載體疫苗 Vaxart 公司開發(fā)的口服腺病毒載體疫苗能夠啟動(dòng)腸道免疫反應(yīng)，這對(duì)于預(yù)防感染腸粘膜的病原體是有利的［41］。Vaxart 公司構(gòu)建了一種表達(dá)GⅠ.1 NoV 株VP1的腺病毒載體疫苗用于誘導(dǎo)保護(hù)性免疫和預(yù)防諾如病毒疾病，該疫苗目前處于Ⅰ期臨床研究。NoV腺病毒載體疫苗可在人腸上皮細(xì)胞中以類似于自然NoV 感染的方式表達(dá)VP1。Kim 等［42］研究發(fā)現(xiàn)用雙鏈RNA 作為佐劑，口服免疫該片劑疫苗時(shí)耐受性良好，并可產(chǎn)生全身和黏膜免疫反應(yīng)。NoV毒株的基因是多樣化的，并且變異較快，單一毒株的感染只能提供短期的免疫保護(hù)［43］。此外，Vaxart 公司構(gòu)建的腺病毒載體疫苗可以在同一載體上表達(dá)多種抗原，這對(duì)于預(yù)防基因多樣化的NoV具有較大的潛力［42］。

2.2.2 NoV 的病毒載體疫苗臨床前研究 Harrington 等［44］構(gòu)建了表達(dá)NVCP 的委內(nèi)瑞拉馬腦炎（venezuelan equine encephalitis，VEE）病毒復(fù)制子顆粒（virus replicon particles，VRPs），并通過口腔免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)VRPs 可以在小鼠中誘導(dǎo)高水平的全身和粘膜免疫反應(yīng)。然而，利用VEE 復(fù)制子載體疫苗的安全性還有待進(jìn)一步研究。

王金冬等［1］發(fā)現(xiàn)用NVCP VP1 和VP2 以及其3′UTR 區(qū)構(gòu)建重組腺病毒疫苗免疫小鼠時(shí)，其免疫效果比單獨(dú)表達(dá)VP1 的重組腺病毒載體疫苗好。然而，人類普遍存在對(duì)腺病毒的免疫，腺病毒載體疫苗的免疫效果可能受到宿主免疫反應(yīng)的影響［45］。

水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）很少感染人類，因此，人體基本不存在預(yù)先對(duì)VSV 的免疫［46］。Ma 等［45］構(gòu)建了一種表達(dá)NVCP VP1的減毒重組水泡性口炎病毒載體疫苗（rVSVVP1），rVSV-VP1可以引起小鼠針對(duì)NoV的高水平的體液、細(xì)胞和粘膜免疫。

新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）只編碼7種蛋白質(zhì)，受宿主范圍的限制，其感染人類時(shí)高度減毒，并且基因重組發(fā)生較少［47］。Kim［40］制備了表達(dá)NoV VA387 株衣殼蛋白VP1 的重組新城疫病毒載體疫苗（rNDV），rNDV 載體疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了高水平的血清、細(xì)胞和粘膜免疫反應(yīng)。

2.3 mRNA疫苗

mRNA 疫苗的原理是將編碼病原體特異性抗原的mRNA 通過一定處理后，注入人體使其通過人體的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)生產(chǎn)出所需的抗原，該免疫方法模擬了病原體感染細(xì)胞的過程，可同時(shí)引發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫。與傳統(tǒng)疫苗相比，mRNA疫苗具有研發(fā)周期短、安全性高、水溶性好、易成藥、設(shè)計(jì)性強(qiáng)、可快速制備等優(yōu)點(diǎn)。然而，mRNA疫苗研發(fā)過程中主要存在的問題有：①裸露的mRNA 不易穿過細(xì)胞膜，需要高效的遞送系統(tǒng)輔助；②mRNA 穩(wěn)定性較差，易降解，在體內(nèi)半衰期短；③mRNA 免疫原性過高，可能會(huì)引起人體強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)；④翻譯效率較低。

Karikó 等［48］發(fā)現(xiàn)摻入修飾的核苷m5C、m6A、m5U、s2U或假尿苷可防止機(jī)體將合成的mRNA視為敵人，此發(fā)現(xiàn)解決了mRNA 疫苗易引起人體強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)的問題，這些研究成果為mRNA 疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。2023年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予Katalin Karikó和Drew Weissman，以表彰他們?cè)诤塑账釅A基修飾研究領(lǐng)域的貢獻(xiàn)。目前，全球上市的mRNA疫苗主要用于預(yù)防新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19），包括Biontech 公司研發(fā)的Comirnaty 和Moderna 公司研發(fā)的Spikevax。此外，多款新型冠狀病毒mRNA疫苗獲得緊急使用授權(quán)，如沃森生物、中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院和艾博生物共同研發(fā)的沃艾可欣和斯微生物自主研發(fā)的mRNA疫苗以及石藥集團(tuán)研發(fā)的SYS6006疫苗。

mRNA 疫苗在應(yīng)對(duì)NoV 基因多樣、高度變異方面具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。目前，Moderna 公司開發(fā)的用于預(yù)防幼兒和老年人急性胃腸炎的2 款多價(jià)VLP 疫苗mRNA-1403（三價(jià)）和mRNA-1405（五價(jià)）正處于臨床Ⅰ期試驗(yàn)招募階段。

2.4 P顆粒疫苗

2.4.1 NoV P顆粒疫苗 NVCP VP1的P結(jié)構(gòu)域包含P1 和P2 亞結(jié)構(gòu)域，其中P2 亞結(jié)構(gòu)域位于病毒衣殼的表面，在進(jìn)化上高度可變，存在與HBGA結(jié)合的界面［49］。P 顆粒是由12 個(gè)P 二聚體形成的八面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑約20 nm，分子量約為830 kD（圖3A）［49-51］。P顆粒能與HBGA結(jié)合，并誘導(dǎo)NoV特異性抗體阻斷VLP 與HBGA 受體的結(jié)合［48］。P顆粒容易在大腸桿菌中產(chǎn)生，非常穩(wěn)定，具有高度的免疫原性，因此P 顆粒可以作為NoV 的候選疫苗［49-50，52］。在P 結(jié)構(gòu)域兩端加入半胱氨酸殘基能促進(jìn)P顆粒的形成，進(jìn)一步修飾P結(jié)構(gòu)域的C端形成一種新的亞病毒粒子，即小P 粒子［53］。小P 顆粒由6 個(gè)P 二聚體組成，呈四面體對(duì)稱，直徑約為14 nm，中心有一個(gè)空腔，具有與VLP 和P 顆粒相似的抗原性和HBGA 結(jié)合特性［53］。P 顆粒尺寸較大，可能更具免疫原性，但小P 顆粒尺寸更小，可能具有穿透獨(dú)特的組織或宿主細(xì)胞等獨(dú)特的應(yīng)用［51，53］。

圖3 NoV P顆粒及其表面環(huán)[49-50]Fig.3 NoV P particles and their surface rings[49-50]

2.4.2 P 顆粒嵌合疫苗 P 顆粒的每個(gè)P 結(jié)構(gòu)域單體存在3 個(gè)表面環(huán)（白色）（圖3B），這些表面環(huán)可以允許大序列插入，是外來抗原呈遞的潛在位點(diǎn)［50］。研究發(fā)現(xiàn)，將輪狀病毒VP8 蛋白插入P 結(jié)構(gòu)域的表面環(huán)不影響P 顆粒的形成，并且VP8 抗原能很好地呈現(xiàn)在P 顆粒表面［50，54］。該研究還發(fā)現(xiàn)P顆粒-VP8嵌合蛋白能夠同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)輪狀病毒和NoV 的抗體，并且與游離的抗原相比，P 顆粒誘導(dǎo)的VP8 抗體滴度顯著增加［50］。Tan 等［50］認(rèn)為P 單體的3 個(gè)環(huán)均可插入外源抗原，可通過在P 顆粒的72 個(gè)表面環(huán)上插入串聯(lián)重復(fù)序列增加拷貝數(shù)，從而增加免疫反應(yīng)，或?qū)⒉煌目乖迦隤單體的不同表面環(huán)中，開發(fā)多價(jià)疫苗。開發(fā)以P 顆粒為載體的納米疫苗具有廣闊的前景，目前已有以P 顆粒為載體的嵌合疫苗處于臨床前研究階段。

通過將甲型流感病毒中高度保守的流感病毒基質(zhì)蛋白2（M2e）抗原插入P結(jié)構(gòu)域的第二個(gè)表面環(huán)制備成的NoV P顆粒-流感病毒嵌合疫苗能增強(qiáng)小鼠對(duì)M2e 的免疫反應(yīng)，還可誘導(dǎo)阻斷NoV VLP或P 顆粒與HBGA 結(jié)合的抗體［55］。將NoV 和戊肝病毒的P結(jié)構(gòu)域融合制備的融合疫苗誘導(dǎo)的抗體水平顯著高于單獨(dú)的NoV P 二聚體或單獨(dú)的戊肝二聚體誘導(dǎo)的抗體水平［56］。將NoV、戊肝病毒和星狀病毒的P 結(jié)構(gòu)域融合，可形成針對(duì)NoV、戊肝病毒和星狀病毒的三價(jià)嵌合疫苗［57］。將HIV病毒包膜與HIV 的廣泛性中和抗體（BnAbs）結(jié)合的MPER 表位4E10 或10E8 插入NoV P 顆粒的表面環(huán)中生產(chǎn)的Nov PP 融合蛋白可以作為呈遞4E10或10E8表位的載體，從而誘導(dǎo)針對(duì)HIV-1 gp41的特異性免疫應(yīng)答［58］。將β 淀粉樣蛋白的Aβ1-6 表位插入NoV P 顆粒的表面環(huán)中構(gòu)建的新型阿爾茲海默癥候選疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高濃度的Aβ 特異性抗體，該疫苗避免了接種全長(zhǎng)Aβ42 而引起的自身免疫性腦膜炎問題，并且該疫苗比截短的Aβ 小肽表位免疫效果好［59］。孫瑤等［60］將含多個(gè)磷酸化靶點(diǎn)的pTau（細(xì)胞骨架蛋白tau）多肽抗原表位偶聯(lián)至NoV P 顆粒上，制成了P 顆粒-磷酸化Tau表位疫苗，該疫苗在Tau相關(guān)疾病的小鼠模型P301S中降低了小鼠腦內(nèi)磷酸化Tau的積累，緩解了Tau 相關(guān)的運(yùn)動(dòng)功能障礙，表現(xiàn)出較好的免疫原性、安全性和有效性。

3 展望

NoV 具有高傳播性，是引發(fā)全球性急性胃腸炎疾病的主要病原體之一，同時(shí)NoV 的多種毒株增加了人類對(duì)NoV 防控的難度，目前還沒有上市的疫苗或藥物用于NoV的預(yù)防和治療。NoV的多發(fā)性和傳播性突出了NoV 疫苗開發(fā)的必要性，本文綜述了NoV VLP 疫苗、腺病毒載體疫苗和基于P 顆粒疫苗的研發(fā)現(xiàn)狀，有助于發(fā)現(xiàn)安全有效，具有臨床應(yīng)用價(jià)值的NoV疫苗。

隨著研究的不斷深入，NoV 體外難培養(yǎng)和動(dòng)物評(píng)價(jià)模型建立困難等難題正在逐步攻克，NoV疫苗技術(shù)已經(jīng)日漸成熟。NoV VLP 疫苗、腺病毒載體疫苗和基于P顆粒疫苗等多種疫苗的研發(fā)都有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，多款疫苗的研發(fā)已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。盡管目前NoV 疫苗的研究有了一些突破，但仍面臨許多挑戰(zhàn)。首先，諾如病毒有多種基因型且變異速度快，人們?cè)谘邪l(fā)NoV 疫苗時(shí)，需要考慮疫苗的廣譜性；其次，人們對(duì)自然NoV 感染的免疫力是短暫的，需要考慮疫苗產(chǎn)生免疫力的時(shí)效性；最后，NoV疫苗的應(yīng)用目前仍有一些迫切需要突破的瓶頸，例如NoV 基因組結(jié)構(gòu)和NoV 發(fā)病機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。未來，隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，NoV 疫苗研發(fā)將提升至一個(gè)新的高度，為阻斷NoV 的傳播提供重要助力。