牛逸琳，陳爍，陳雨詩，何冬梅，尹永芹

（1.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006；2.惠州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 惠州 516001）

卵巢早衰（premature ovarian failure, POF）指女性40 歲前由于性激素水平紊亂而導(dǎo)致的卵巢功能障礙，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)及潮熱、焦慮、抑郁等圍絕經(jīng)期癥狀，常伴有促卵泡激素（follicle stimulating hormone,FSH）和促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）水平升高，雌激素（estradiol, E2）水平降低[1]，是早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）的終末階段[2]。POF 的發(fā)病機制復(fù)雜，中醫(yī)認為其與腎虛、沖任虛衰有關(guān)，研究表明自身免疫性因素、遺傳、代謝、藥物和感染等均可導(dǎo)致本病發(fā)生[3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要以激素代替療法進行治療，雖可改善患者臨床表現(xiàn)，但停藥后易復(fù)發(fā)且可能提高乳腺癌的發(fā)生率[4]。

益經(jīng)湯出自《傅青主女科》，其藥物包括熟地黃、白術(shù)、山藥、當歸、白芍、酸棗仁、牡丹皮、北沙參、柴胡、杜仲、人參，主要治療“年未老經(jīng)水斷”。傅氏認為：“經(jīng)原非血也……出自腎中”，“女子年未七七而經(jīng)水先斷者，人以為血枯經(jīng)閉也，誰知是心肝脾之氣郁乎！”方中以熟地黃滋補腎陰，杜仲溫補肝腎，白術(shù)、山藥補脾益氣，人參大補元氣，當歸、白芍養(yǎng)肝活血，酸棗仁養(yǎng)心安神，柴胡疏肝解郁，北沙參養(yǎng)陰生津，牡丹皮清熱涼血。余卉嬌[5]使用益經(jīng)湯對POF 患者進行治療，顯著改善月經(jīng)周期，降低血清中FSH 及E2水平。陶莉莉等[6]發(fā)現(xiàn)卵泡細胞的過快凋亡導(dǎo)致卵巢功能減退，加減益經(jīng)湯可增加卵巢Bcl-2 表達，減少Bax 表達，抑制卵泡細胞凋亡。萬云慧[7]發(fā)現(xiàn)使用加減益經(jīng)湯治療后的POF 患者血清FSH、LH 水平明顯降低，竇狀卵泡數(shù)量增加。益經(jīng)湯在調(diào)經(jīng)促孕方面療效較好，臨床常用其加減方治療卵巢早衰等婦科疾病，但其發(fā)揮作用的機制尚不清楚。課題組前期通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究益經(jīng)湯對POF 的作用通路主要為PI3K-AKT（PI3K-AKT signaling pathway）、癌癥中的蛋白多糖（proteoglycans in cancer）等。PI3K-AKT 信號通路參與細胞活化凋亡，調(diào)控卵泡的發(fā)育和閉鎖，同時FOXO3A 作為該通路下游轉(zhuǎn)錄因子之一，在細胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用。因此本文通過觀察益經(jīng)湯對POF 小鼠治療作用及PI3K/AKT/FOXO3A 的影響，探討其治療POF的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6 小鼠40 只，5～6 周齡，雌性，體質(zhì)量15～25 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2022-0002。動物實驗操作經(jīng)廣東藥科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準（gdpu‐lacspf2022034）。

1.2 主要試劑耗材和儀器

注射用環(huán)磷酰胺（H2124176，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；戊酸雌二醇片（補佳樂，H20160679，拜爾醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司）；蘇木素伊紅（HE）染液（G1120，北京索萊寶科技有限公司）；小鼠雌E2、FSH、LH、抗繆勒氏管激素（AMH）、孕酮（PROG）酶聯(lián)反應(yīng)吸附試驗ELISA試劑盒（MM-0566M1、MM-0555M1、MM-44039M1、MM-44202M1、MM-0568M1，廣州研賽生物制品有限公司）；PI3K、AKT、FOXO3A 蛋白單克隆抗體（AF6241、AF6261、AF6020，Affinity Biosciences）。氯化鈉注射液（H22070710，廣東科倫藥業(yè)有限公司）；異氟烷（H20020267，魯南貝特制藥有限公司）；4%多聚甲醛通用型組織固定液（22291398，廣州碩譜生物科技有限公司）。

IMS-70 型全自動雪花制冰機（常熟市雪科電器有限公司）；BX51 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；?80 ℃超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）；FA2104型電子天平（上海舜宇恒平科技儀器有限公司）；RM2016 病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；H1650-W 臺式微量高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；DK-8D 型三孔電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）；Spectra MAX Plus384 型酶標儀（美谷分子儀器有限公司）。

2 方法

2.1 益經(jīng)湯的制備

益經(jīng)湯使用處方顆粒，由海東市平安正陽互聯(lián)網(wǎng)中醫(yī)醫(yī)院有限公司提供，全方與益經(jīng)湯原方一致。生藥由熟地黃30 g、麩炒白術(shù)30 g、北柴胡3 g、鹽杜仲3 g、酒當歸15 g、麩炒山藥15 g、人參6 g、牡丹皮6 g、北沙參9 g、酸棗仁9 g、炒白芍9 g 組成，生藥量135 g，顆粒劑1劑36 g，1 g相當于生藥量3.75 g。將益經(jīng)湯顆粒加蒸餾水調(diào)配成質(zhì)量濃度為0.32 g/mL和0.96 g/mL的藥液，低溫儲藏備用。

2.2 POF模型構(gòu)建及分組給藥

參考文獻[8]方法建立卵巢早衰模型，造模小鼠腹腔注射CTX 溶液。因CTX 具有自限性，采用首日腹腔注射60 mg/kg，2～15 日腹腔注射8 mg/kg，建立POF 小鼠模型，注射體積為10 mL/kg。空白組腹腔注射與模型組等量的生理鹽水，1 次/d，共15 d。注射結(jié)束24 h 后每日進行陰道涂片，移液槍吸取生理鹽水沖洗小鼠陰道2～3 次后進行涂片，自然風(fēng)干進行HE 染色。觀察小鼠陰道涂片，若出現(xiàn)動情周期紊亂則視為造模成功[9]。

選取動情周期規(guī)律的小鼠，隨機抽取6 只作為空白組，其余小鼠造模成功后，采用隨機數(shù)字表法將小鼠隨機均分為4 組，分別為模型組、陽性對照組、益經(jīng)湯低劑量組、益經(jīng)湯高劑量組，每組6 只。根據(jù)體表面積比換算，以小鼠與人體藥物等效劑量倍數(shù)為12.33，分別計算各組給藥劑量。各組給藥方法如下：益經(jīng)湯低、高劑量組分別以益經(jīng)湯顆粒6.34、19.02 g/（kg·d）進行灌胃；陽性對照組以戊酸雌二醇片0.18 mg/（kg·d）灌胃；空白組和模型組給予蒸餾水灌胃。各組灌胃體積均為20 mL/kg，1 次/d，共30 d。

2.3 取材

益經(jīng)湯干預(yù)30 d 后，各組小鼠均需禁食不禁水12 h，稱取小鼠體質(zhì)量。用異氟烷進行麻醉，眼球取血法取血放置EP 管中，靜置分層后，在4 ℃下以3 000 r/min 離心10 min，提取血清置于?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別摘取雙側(cè)卵巢、腎臟及子宮，去除附著在表面的筋膜及脂肪等，精密稱重，部分組織放入4%（φ）多聚甲醛固定液中；其余組織?80 ℃冰箱冷凍保存。動物尸體進行無害化處理。

2.4 檢測體質(zhì)量及臟器指數(shù)變化

實驗期間，每周觀察小鼠毛發(fā)、精神狀態(tài)及活動情況。小鼠造模及給藥期間每隔一天稱質(zhì)量，實驗開始及實驗結(jié)束當天稱體質(zhì)量，取各臟器稱重并計算臟器指數(shù)。根據(jù)各臟器濕質(zhì)量，卵巢、子宮指數(shù)計算公式分別為：卵巢指數(shù)＝卵巢濕質(zhì)量（g）／體質(zhì)量（g）×100%；子宮指數(shù)＝子宮濕質(zhì)量（g）／體質(zhì)量（g）×100%。

2.5 觀察小鼠動情周期

在造模及給藥期間每日進行陰道脫落細胞檢查，移液槍吸取生理鹽水沖洗小鼠陰道2～3 次，將脫落細胞均勻涂抹在載玻片上，自然風(fēng)干后，95%乙醇固定3 min，蘇木精染液染色5 min，沖洗后鹽酸乙醇分色數(shù)秒，自來水沖洗反藍5 min，伊紅染色2 min，沖洗后干燥，封片判斷動情周期，連續(xù)45 d。正常小鼠動情周期多為4～5 d，其余則視為動情周期紊亂。各組小鼠動情周期紊亂率=動情周期紊亂小鼠只數(shù)/各組小鼠總只數(shù)×100%。

2.6 HE染色法觀察小鼠卵巢、子宮組織變化

卵巢、子宮組織放置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h 后，經(jīng)過石蠟包埋后，切片，脫蠟，蘇木素染液浸泡10 min，純水清洗15 s，分化液5 s，純水清洗15 s 后放入純水浸泡5 min 返藍，伊紅染液浸泡3 min 后脫水，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢、子宮的組織學(xué)變化。

2.7 ELISA 法檢測血清E2、FSH、LH、AMH、PROG表達

通過ELISA 法檢測各組小鼠血清E2、FSH、LH、AMH、PROG 水平，根據(jù)試劑盒說明書操作，使用酶標儀在450 nm 波長下檢測吸光度（A），建立標準曲線，按曲線方程計算E2、FSH、LH、AMH、PROG濃度。

2.8 卵巢中PI3K、AKT、FOXO3A蛋白表達水平

取卵巢組織經(jīng)梯度乙醇脫水固定、包埋切片等處理之后，采用免疫組織化學(xué)檢測蛋白表達水平：經(jīng)過脫蠟，采用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑進行阻斷，抗原修復(fù)，洗滌后加入封閉液，室溫60 min；加入一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后加入相應(yīng)二抗37 ℃孵育30 min，洗滌后加入DAB 顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染30 s 后封片，400 倍的顯微鏡下觀察拍照。用Image Pro Plus軟件分析。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以表示，使用t檢驗，采用單因素方差分析進行組間分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 動情周期變化

通過對陰道脫落細胞涂片分析小鼠造模情況。正常小鼠動情周期多為4～5 d，分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期。若小鼠的動情周期表現(xiàn)為混亂無序、持續(xù)時間超過6 d，或長期停滯在某個時期，則認為小鼠出現(xiàn)動情周期紊亂，代表POF 模型構(gòu)建成功，見圖1。實驗結(jié)束時，空白組小鼠表現(xiàn)出規(guī)律的動情周期；模型組有83.33%的小鼠動情周期紊亂，益經(jīng)湯低、高劑量組分別有33.33% 和16.67%的小鼠動情周期紊亂，提示益經(jīng)湯可以改善由CTX造成的動情周期紊亂。

3.2 益經(jīng)湯對各組小鼠體質(zhì)量以及卵巢、子宮指數(shù)的影響

體質(zhì)量變化情況見表1。造模結(jié)束后，相較于空白組，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）；相較于模型組，陽性組和益經(jīng)湯高劑量組小鼠體質(zhì)量明顯升高（P＜0.05）。益經(jīng)湯低劑量組體質(zhì)量也呈升高趨勢。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況Table 1 Changes in body weight of mice in each group(,n=6)m/g

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況Table 1 Changes in body weight of mice in each group(,n=6)m/g

與空白組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。

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卵巢指數(shù)如表2所示，與空白組比較，模型組的卵巢指數(shù)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，益經(jīng)湯高劑量組卵巢指數(shù)顯著性升高（P＜0.05），其余給藥組也呈現(xiàn)升高趨勢。

表2 各組小鼠卵巢、子宮指數(shù)比較Table 2 Comparison of ovarian and uterine indices among different groups of mice(,n=6)

表2 各組小鼠卵巢、子宮指數(shù)比較Table 2 Comparison of ovarian and uterine indices among different groups of mice(,n=6)

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

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子宮指數(shù)如表2所示，相較于空白組，模型組的子宮指數(shù)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和益經(jīng)湯高劑量組子宮指數(shù)均顯著性升高，以陽性對照組最為顯著（P＜0.01）。

3.3 卵巢、子宮組織形態(tài)變化

HE 染色結(jié)果顯示，空白組小鼠卵巢形狀完整，可見較多不同發(fā)育階段卵泡，細胞間質(zhì)及血管纖維較少。與空白組相比，模型組卵巢體積減小，可見少量次級卵泡，閉鎖卵泡增多，卵巢基質(zhì)層結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)較大細胞間質(zhì)和纖維化現(xiàn)象；與模型組相比，各給藥組卵巢體積增大，次級卵泡和初級卵泡數(shù)量較多，伴隨少量竇狀卵泡，卵巢基質(zhì)層結(jié)構(gòu)有所改善，細胞間質(zhì)和纖維化現(xiàn)象減少，見圖2。

圖2 益經(jīng)湯對各組小鼠卵巢組織病理形態(tài)的影響(HE,100×)Figure 2 Effect of Yijing decoction on the pathological morphology of ovarian tissue in mice of different groups(HE,100×)

空白組小鼠子宮結(jié)構(gòu)完整，子宮腺上皮細胞形態(tài)正常，腺體分布密集，子宮肌層纖維排列緊密。與空白組比較，模型組小鼠子宮腺體明顯減少，結(jié)構(gòu)不完整，腺體稀疏且排列不整齊；與模型組比較，各給藥組子宮內(nèi)膜增厚，子宮腺上皮細胞排列較為整齊，腺體數(shù)量增加，見圖3。

3.4 血清性激素水平的影響

與空白組相比，模型組小鼠血清E2、AMH、PROG 水平顯著降低，F(xiàn)SH、LH 水平顯著性升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，陽性對照組和益經(jīng)湯低、高劑量組血清E2、AMH、PROG水平均升高（P＜0.05，P＜0.01），F(xiàn)SH、LH 水平顯著下降（P＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 益經(jīng)湯對各組小鼠血清性激素水平的影響Table 3 Effect of Yijing decoction on serum sex hormone concentration in mice of different groups(,n=6)

表3 益經(jīng)湯對各組小鼠血清性激素水平的影響Table 3 Effect of Yijing decoction on serum sex hormone concentration in mice of different groups(,n=6)

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

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3.5 益經(jīng)湯對小鼠卵巢PI3K/AKT/ FOXO3A 通路蛋白表達水平的影響

通過免疫組化（IHC）對小鼠卵巢PI3K、AKT 和FOXO3A 表達進行檢測，并對吸光度（A）進行分析。與空白組相比，PI3K、AKT、FOXO3A 3 種蛋白在模型組表達皆顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組及益經(jīng)湯低、高劑量組中蛋白表達均顯著降低（P＜0.01）。顯示陽性藥及益經(jīng)湯對PI3K、AKT、FOXO3A 蛋白表達有抑制作用，結(jié)果見圖4－5。

圖4 各組小鼠卵巢PI3K、AKT、FOXO3A表達比較Figure 4 Comparison of ovarian PI3K,AKT,and FOXO3A expression in mice of different groups(,n=6)

圖5 IHC檢測卵巢PI3K、AKT、FOXO3A的表達Figure 5 IHC detection of ovarian PI3K，AKT，F(xiàn)OXO3A expression（200×）

4 討論

卵巢早衰發(fā)病機制復(fù)雜，臨床表現(xiàn)為持續(xù)性閉經(jīng)、不孕和更年期綜合征等。隨著社會壓力不斷增大，卵巢早衰趨于年輕化，對于心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等均造成不同程度的危害。目前的臨床檢測手段主要包括內(nèi)分泌激素測定、基礎(chǔ)卵巢體積、竇狀卵泡計數(shù)等[10]，治療則主要有雌孕激素補充治療、干細胞治療、卵巢移植、促排卵療法等。西醫(yī)治療方法產(chǎn)生的副作用不可忽視，中醫(yī)整體觀念、辨證論治的思想則具有明顯優(yōu)勢。POF 臨床癥狀在中醫(yī)歸為月經(jīng)過少、閉經(jīng)、血枯、不孕癥等范圍，經(jīng)典方益經(jīng)湯重在心肝脾腎四經(jīng)同治，強調(diào)“補以通之、散以開之”[11]，正如《傅青主女科》中所言：“散心肝脾之郁，而大補其腎水，仍大補其心肝脾之氣，則精溢而經(jīng)水自通矣”，臨床已證實其功效。

李麗美等[12]通過構(gòu)建卵巢儲備功能下降（DOR）大鼠模型研究加減益經(jīng)湯對其影響，發(fā)現(xiàn)加減益經(jīng)湯可以改善DOR 模型大鼠的性激素水平以及卵巢組織病理形態(tài)。DOR 會使血清中E2的水平下降，F(xiàn)SH、LH 水平明顯升高。E2主要由卵泡顆粒細胞分泌，可維持正常生殖功能，對于PROG合成亦存在促進作用，協(xié)同維持妊娠過程[13]；AMH 是糖蛋白家族中的一員，主要由卵巢竇前卵泡和小竇卵泡細胞分泌，通過調(diào)控起始和循環(huán)募集達到對卵巢儲備的影響，同時抑制卵泡的生長，與卵巢功能密切相關(guān)[14]。在卵泡生長發(fā)育過程中，LH可刺激卵泡內(nèi)膜分泌睪酮，由FSH 刺激顆粒細胞對睪酮進行轉(zhuǎn)化為E2，二者協(xié)同作用可有效促進E2、PROG 的合成與釋放，同時受到E2、PROG 的負反饋調(diào)節(jié)[15]，反映卵巢功能。CTX 作為一種化療藥物，會使處于生殖期年輕患者的卵巢嚴重損傷，會導(dǎo)致卵巢顆粒細胞凋亡和大量卵泡停滯發(fā)育等，引起閉經(jīng)、不育和POF。本實驗以CTX 所致POF 模型小鼠為對象，研究益經(jīng)湯對其治療作用。實驗表明，小鼠造模后出現(xiàn)動情周期紊亂，卵巢及子宮指數(shù)明顯下降，組織形態(tài)也出現(xiàn)對應(yīng)的變化，血清E2、AMH、PROG 水平表達降低，LH、FSH 水平表達上升，反映實驗造模成功。經(jīng)藥物干預(yù)，與模型組相比，小鼠毛發(fā)光亮濃密，體質(zhì)量有所上升，食欲和精神狀態(tài)均有改善；在卵巢組織切片中觀察到卵巢體積增大，次級和初級卵泡數(shù)量增多，細胞間質(zhì)和纖維化現(xiàn)象減少，小鼠卵泡發(fā)育情況有所改善；子宮組織切片中，觀察到子宮內(nèi)膜增厚，子宮腺上皮細胞排列變得整齊，腺體數(shù)量有所增加；血清激素水平結(jié)果顯示，陽性對照組和益經(jīng)湯高劑量組血清E2、AMH、PROG 水平均升高，F(xiàn)SH、LH 水平顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。通過益經(jīng)湯給藥治療，以上病理指標均有不同程度改善，結(jié)果表明益經(jīng)湯在生活行為、卵泡發(fā)育和激素水平層面對CTX 誘導(dǎo)的POF 小鼠卵巢具有保護作用，根據(jù)子宮相關(guān)病理數(shù)據(jù)，提示益經(jīng)湯在保護卵巢時可能對子宮也有一定影響。

PI3K/AKT 信號通路是調(diào)節(jié)自噬的經(jīng)典傳導(dǎo)通路，可以調(diào)控卵巢顆粒細胞的增殖與分化、卵母細胞的減數(shù)分裂等，與卵泡發(fā)育和閉鎖有著密切的關(guān)系。FOXO3A是PI3K/AKT 通路下游重要轉(zhuǎn)錄因子之一，也參與了細胞的增殖、分化、凋亡以及衰老等。目前認為卵巢中多數(shù)原始卵泡都處于靜息休眠狀態(tài)，每個周期中只有極少數(shù)會被激活進入生長卵泡池，一旦過度激活進入生長卵泡池，會有大量生長卵泡發(fā)生異常閉鎖，導(dǎo)致DOR 的發(fā)生[16]，所以維持卵泡狀態(tài)的動態(tài)平衡尤為重要。本實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠卵巢AKT、PI3K、FOXO3A蛋白表達顯著性升高，說明在CTX 作用下該通路被過度激活，卵泡發(fā)生異常閉鎖，導(dǎo)致卵巢早衰的發(fā)生。經(jīng)過治療后，給藥組AKT、PI3K、FOXO3A蛋白表達較模型組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，益經(jīng)湯能夠有效改善POF 小鼠動情周期、卵巢與子宮指數(shù)和組織形態(tài)學(xué)變化，改善卵巢和子宮的功能，其機制可能與提高血清E2、AMH、PROG 和降低FSH、LH 的表達以及調(diào)控PI3K/AKT/FOXO3A 通路相關(guān)蛋白表達水平有關(guān)，達到維持正常卵巢儲備水平、預(yù)防卵巢早衰的作用。益經(jīng)湯在治療卵巢方面的研究較多，應(yīng)用于子宮較少，有待進一步探索。