鐘汶蓉 陶彬彬* 徐 聞, 譚 娟 羅紅瑞宋焱龍 陳 戟 胡 煒, *

(1.大連海洋大學(xué), 大連 116023; 2.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北洪山實(shí)驗(yàn)室,武漢 430072; 3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 4.懷化學(xué)院, 懷化 418000)

雌核發(fā)育(Gynogenesis)是指需要兩性親緣種精子的刺激而促使卵子活化, 導(dǎo)致卵子只依靠雌性原核進(jìn)行發(fā)育的一種特殊生殖方式[1,2]。人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)通常指卵子在遺傳滅活的外源精子刺激下, 經(jīng)染色體加倍過(guò)程后完全在母本遺傳信息控制下的發(fā)育[3], 該技術(shù)在魚(yú)類(lèi)種質(zhì)純化和全雌養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)品種培育等方面發(fā)揮了重要作用。通過(guò)物理或化學(xué)方式進(jìn)行人工雌核發(fā)育研究, 已獲得多種淡水、海水魚(yú)類(lèi)的雌核發(fā)育后代, 如鯉(Cyprinus carpio)[4]、黃鱔(Monopterus albus)[5]、草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella)[6]、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[7]和牙鲆(Cynoglossus semilaevis)[8]等。

泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)屬于鯉形目、鰍科、花鰍亞科的泥鰍屬, 對(duì)環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)性, 是廣泛分布于亞洲地區(qū)的重要淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。泥鰍素有“水中人參”的美譽(yù), 因其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美[9]、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高, 越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞; 近年來(lái), 泥鰍的市場(chǎng)需求量一直維持在較高的水平,2021年我國(guó)泥鰍養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到36.7086萬(wàn)噸[10], 泥鰍具有生長(zhǎng)的性別二態(tài)性, 雌性個(gè)體比雄性更大、生長(zhǎng)更快[11], 培育全雌泥鰍養(yǎng)殖新品種具有巨大的市場(chǎng)前景。自然水體中存在著二倍體、三倍體、四倍體、五倍體和六倍體[12]等不同倍性的泥鰍, 染色體倍性操作是泥鰍育種的研究重點(diǎn)之一, 如人工誘導(dǎo)泥鰍雌核發(fā)育二倍體[13], 人工誘導(dǎo)四倍體泥鰍雄核發(fā)育二倍體[14], 二倍體泥鰍與四倍體泥鰍雜交[15]等。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究一般是通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得泥鰍倍性操作的條件[16,17], 缺乏二倍體泥鰍雌核發(fā)育的細(xì)胞層面的研究。

本研究通過(guò)細(xì)胞觀察追蹤減數(shù)分裂過(guò)程中遺傳物質(zhì)的變化特征, 獲得人工誘導(dǎo)泥鰍雌核發(fā)育的熱休克參數(shù), 利用該參數(shù)成功實(shí)現(xiàn)泥鰍雌核發(fā)育的人工誘導(dǎo), 并進(jìn)一步通過(guò)核型和流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)雌核發(fā)育的泥鰍胚胎進(jìn)行檢測(cè)分析, 確定其倍性。本研究旨在建立精準(zhǔn)的泥鰍雌核發(fā)育技術(shù)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 親本來(lái)源及催產(chǎn)方法

野生性成熟泥鰍(雌30尾及雄6尾)購(gòu)買(mǎi)自湖南省懷化市集貿(mào)市場(chǎng), 性成熟雄性黃河鯉(Cyprinus carpio)來(lái)自中國(guó)科學(xué)院水生生物所官橋養(yǎng)殖基地。泥鰍在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1周, 水溫26—28℃, 溶氧＞5 mg/L, 保證餌料充足。在人工繁殖前1d, 雌泥鰍每尾經(jīng)腹鰭下注射鯉垂體1 mg, HCG 50 IU, 雄泥鰍劑量減半; 雄鯉每公斤經(jīng)胸鰭下注射鯉垂體2 mg, HCG 1000 IU。

1.2 異源精子滅活

選一尾雄鯉擠出精液, 按1∶4的比例加入Hanks’ Balanced Salt Solution (C0218, Beyotime)稀釋。加水激活精子, 解剖鏡下觀察精子活力并計(jì)時(shí),若雄鯉的精子能快速開(kāi)始游動(dòng)且能持續(xù)游動(dòng)50s以上, 則認(rèn)為具有足夠的活力。玻璃皿中加入稀釋后的鯉精液1 mL, 厚度約1—2 mm。玻璃皿下墊碎冰降溫, 放于上方帶有紫外燈的搖床上進(jìn)行精子滅活。照射前10min打開(kāi)2支平行30 w紫外燈, 照距25 cm。照射10min后每1min鏡檢一次并計(jì)時(shí), 若大部分雄鯉的精子遇水后呈“醉漢狀”游動(dòng)且只能游動(dòng)20s以下, 則停止照射, 冰上避光保存。

1.3 人工授精及熱休克處理

通過(guò)熱休克處理二倍體泥鰍與黃河鯉精子自交/雜交受精卵。擠出雄鰍精液, 用hanks保存液稀釋備用。雌鰍擠出成熟卵子, 12尾雌鰍卵子各分為5份, 3份分別與200 μL泥鰍精子, 200 μL黃河鯉精子, 200 μL滅活黃河鯉精子人工授精, 兩份與200 μL滅活黃河鯉精子人工授精, 混勻后加入少量曝氣水。加水后開(kāi)始計(jì)時(shí), 在第2min30s/3min30s將受精卵置于40—41℃進(jìn)行熱休克處理刺激, 熱休克持續(xù)2min。獲得以下5種組合: A組(野生型組, 二倍體泥鰍卵×二倍體泥鰍精子)、B組(雜交組, 二倍體泥鰍卵×黃河鯉精子)、C組(未熱休克組, 二倍體泥鰍卵×滅活黃河鯉精子, 不進(jìn)行熱休克)、D1組(雌核發(fā)育組, 二倍體泥鰍卵×滅活黃河鯉精子, 2min30s進(jìn)行熱休克)和D2組(雌核發(fā)育組, 二倍體泥鰍卵×滅活黃河鯉精子, 3min30s進(jìn)行熱休克)。置于24—26℃水溫孵化, 于9h、48h和168h統(tǒng)計(jì)受精率、畸形率和存活率, 在25h剝?nèi)ヂ涯みM(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察, 50h進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.4 受精細(xì)胞學(xué)觀察

以A(野生型組)為對(duì)照組, 對(duì)B(雜交組)、C(未熱休克組)和D2(雌核發(fā)育組)的胚胎發(fā)育早期過(guò)程進(jìn)行熒光受精細(xì)胞學(xué)觀察。取樣時(shí)間分別為人工授精后0、1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min和10min, 每時(shí)間段取卵20—30個(gè)。先室溫下用4%多聚甲醛溶液固定卵24h, 再用4%多聚甲醛4℃固定48h。在體視顯微鏡(SZ61, Olympus)下剝?nèi)ヂ涯? 0.1% Triton X-100溶液37℃金屬浴3min; 用PBS溶液清洗3次, DAPI(C1006, Beyotime) 染色液避光染色30min, 在抗熒光淬滅劑(BMU104-CN, Abbkine)中保存, 保存時(shí)間不超過(guò)12h。利用活體光切層照顯微鏡(SP8 DLS,Leica)進(jìn)行觀察并拍照記錄。

1.5 胚胎染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)

取A(野生型組)、B(雜交組)、C(未熱休克組)和D2(雌核發(fā)育組)四組受精后24h胚胎各20—30個(gè), 撕去卵膜與卵黃, 用0.08%秋水仙素(C804812, Macklin)處理3h, 1%檸檬酸鈉低滲20min,用預(yù)冷的卡諾固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定3次,每次20min, 4℃低溫過(guò)夜。于1.8 m高處滴片, 酒精燈烤干。選擇中期分裂相用正置熒光顯微鏡(DM4B, Leica)拍照并計(jì)數(shù)。

1.6 DNA含量測(cè)定

以二倍體泥鰍體細(xì)胞DNA含量作為對(duì)照, 利用微流顆粒成像分析系統(tǒng)(CytoFlex S, Beckman)檢測(cè)以下各試驗(yàn)樣品DNA含量。取父母本泥鰍以及黃河鯉尾靜脈血1 μL, 用200 μL Sysmex-Partec/CyStain?DNA 1step(05-5004, Merck millipore)染液稀釋成一定濃度, 經(jīng)細(xì)胞過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾后進(jìn)行測(cè)定。取獲得的每組受精后48h胚胎各10尾, 用1 mg/mL膠原酶Ⅳ(C8160, Solarbio) 37℃消化4h后, 用200 μL Sysmex-Partec/CyStain?DNA 1step染色, 經(jīng)細(xì)胞過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾后進(jìn)行測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel統(tǒng)計(jì), 數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。分析均使用GraphPad Prism 9進(jìn)行。兩組數(shù)據(jù)之間的差異通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行檢測(cè)。在所有統(tǒng)計(jì)學(xué)比較中,P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 泥鰍卵細(xì)胞第二次減數(shù)分裂細(xì)胞學(xué)觀察

對(duì)四組(野生型組、雜交組、未熱休克組和雌核發(fā)育組)人工授精后的泥鰍受精卵進(jìn)行共聚焦3D時(shí)序成像。如圖1a, 在24—26℃水溫條件下, 單個(gè)泥鰍精子通過(guò)卵子受精孔進(jìn)入內(nèi)部, 促使卵子第二次減數(shù)分裂完成, 分裂成卵核以及第二極體。0—3min內(nèi), 精子逐漸向卵核靠近, 泥鰍卵內(nèi)染色體聚攏在一起, 整齊地排列在赤道板上, 卵核與第二極體還未分開(kāi); 至5min, 觀察到染色體已經(jīng)分開(kāi)為兩份, 向著相反方向移動(dòng), 即第二極體已經(jīng)與卵核分開(kāi);8min時(shí), 仍可以觀察到有精子還未與卵核結(jié)合的情況; 10min時(shí), 可觀察到第二極體正遠(yuǎn)離受精核向外排出。當(dāng)鯉精子作為異源精子通過(guò)受精孔進(jìn)入卵子, 刺激泥鰍卵完成第二次減數(shù)分裂的共聚焦3D時(shí)序成像如圖1b, 在3—5min內(nèi), 泥鰍卵核第二極體分開(kāi), 10min內(nèi)鯉精核與泥鰍卵核并未融合。當(dāng)滅活的鯉精子通過(guò)受精孔進(jìn)入卵子, 刺激泥鰍卵完成第二次減數(shù)分裂的細(xì)胞觀察時(shí)序圖如圖1c, 在4—6min內(nèi), 泥鰍卵核第二極體分開(kāi)。當(dāng)滅活的鯉精子通過(guò)受精孔進(jìn)入卵子, 刺激泥鰍卵完成第二次減數(shù)分裂,并在人工授精后3min30s進(jìn)行2min熱休克, 細(xì)胞觀察時(shí)序圖如圖1d, 在3—5min內(nèi), 泥鰍卵核第二極體分開(kāi), 精核在向卵核靠近時(shí), 第二極體并未向外排出,且10min以后, 未觀察到有卵核、第二極體及精核的圖像, 表明此時(shí)卵核已經(jīng)向卵子內(nèi)部移動(dòng)。

圖1 不同處理組受精卵受精細(xì)胞學(xué)觀察Fig.1 Fertilization cytology observation of fertilized eggs in different groups

2.2 確定人工誘導(dǎo)泥鰍減數(shù)分裂雌核發(fā)育參數(shù)

統(tǒng)計(jì)野生型、雜交型、單倍體和雌核發(fā)育組胚胎9h、48h和168h后的受精率、畸形率、存活率,各組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較的結(jié)果如表1。結(jié)果顯示野生型組(組A)的受精率和存活率最高、畸形率最低,且與其他組有顯著性差異(P＜0.05); 雜交組(組B)與未熱休克組(組C)魚(yú)苗全部發(fā)育畸形, 且在開(kāi)口前(7d內(nèi))全部死亡; 對(duì)比兩個(gè)雌核發(fā)育組(組D1, 在人工授精后2min30s后熱休克; 組D2, 在人工授精后3min30s后熱休克)的數(shù)據(jù), 發(fā)現(xiàn)人工授精后3min30s開(kāi)始熱休克比人工授精后2min30s開(kāi)始熱休克產(chǎn)生的受精率和存活率更高, 畸形率更低, 但是兩組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

表1 不同處理組胚胎的受精率、畸形率和存活率Tab.1 Fertilization rate, deformity rate, and survival rate of embryos in different groups

人工授精后25h及50h的不同處理組魚(yú)苗的形態(tài)觀察如圖2所示。授精后25h野生型組(圖2a) 、授精后50h野生型組(圖2e)與授精后25h雌核發(fā)育組 (圖2d) 、授精后50h雌核發(fā)育組(圖2h)均為發(fā)育正常的魚(yú)苗, 而授精后25h雜交組(圖2b) 、授精后50h雜交組(圖2f)與授精后25h未熱休克組 (圖2c) 、授精后50h未熱休克組(圖2g)的魚(yú)苗發(fā)育畸形, 出現(xiàn)身體扭曲, 尾部短且彎曲, 水腫, 圍心腔擴(kuò)大、心血管畸形和黑色素增多等非正常形態(tài)。

圖2 不同處理組幼魚(yú)的形態(tài)觀察Fig.2 Morphological observation of juvenile fish in different groups

2.3 雌核發(fā)育泥鰍的染色體數(shù)目分析

通過(guò)染色體計(jì)數(shù)法分析A(野生型組)、B(雜交組)、C(未熱休克組)、E(雌核發(fā)育組)4個(gè)處理組的染色體數(shù)目。結(jié)果表明, 不同處理組有不同頻率的整倍體和非整倍體, 野生型組多為正常二倍體, 染色體數(shù)目如圖3a (2n=50), 雜交組染色體數(shù)目近三倍體, 如圖3b (n+n=68), 未熱休克組染色體數(shù)目為正常單倍體如圖3c (n=25), 雌核發(fā)育組二倍體染色體數(shù)目如圖3d (2n=50)。

圖3 不同處理組胚胎的中期分裂相染色體Fig.3 The metaphase chromosome of embryos in different groups

二倍率最高的是泥鰍精子與泥鰍卵人工授精的野生型組, 眾數(shù)百分比為96.67%(圖4a); 其次是雌核發(fā)育組, 二倍體眾數(shù)(2n=50)百分比為64.71%(圖4b); 雜交組出現(xiàn)n+n=75的眾數(shù)百分比為0, 均不為25的整倍數(shù)(圖4c); 未熱休克組出現(xiàn)單倍體(n=25)的眾數(shù)百分比為96.97%(圖4d)。

圖4 不同處理組染色體數(shù)目分布Fig.4 Distribution frequency of the number of chromosome in embryos of different groups

2.4 雌核發(fā)育泥鰍的相對(duì)DNA含量分析

利用流式細(xì)胞儀對(duì)父母本二倍體泥鰍、黃河鯉、子代野生型組胚胎、雜交組胚胎、未熱休克組胚胎、雌核發(fā)育組胚胎的核DNA相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定(圖5)。因?yàn)榕咛ピ缙诩?xì)胞分裂較為旺盛, 所以出現(xiàn)了幾個(gè)峰值, 細(xì)胞頻率高的是處在有絲分裂G0—G1期的細(xì)胞。父本泥鰍(圖5a)、母本泥鰍(圖5b)、黃河鯉(圖5c)的DNA相對(duì)含量主要峰值在15—16, 野生型胚胎(圖5d)的DNA相對(duì)含量主要峰值在15—16, 雜交組胚胎(圖5e)的DNA相對(duì)含量主要在21—22, 單倍體胚胎(圖5f)的DNA相對(duì)含量主要峰值在8—9, 雌核發(fā)育胚胎(圖5g)的DNA相對(duì)含量主要峰值在15—16。通過(guò)比較可以看出, 雜交胚胎細(xì)胞的DNA相對(duì)含量是二倍體細(xì)胞的1.31—1.46倍, 未熱休克胚胎細(xì)胞的DNA相對(duì)含量是二倍體的0.50—0.56倍, 雌核發(fā)育胚胎細(xì)胞的DNA相對(duì)含量與二倍體相差不大。上述結(jié)果表明, 雜交組胚胎既不是二倍體, 也不是三倍體, 未熱休克胚胎為單倍體, 雌核發(fā)育胚胎為二倍體。

圖5 不同處理組胚胎相對(duì)DNA含量Fig.5 Relative DNA contents in embryos of different groups

3 討論

本研究通過(guò)共聚焦3D成像分析二倍體泥鰍卵的第二極體與卵核分開(kāi)的過(guò)程, 獲得了熱休克人工誘導(dǎo)二倍體泥鰍雌核發(fā)育的參數(shù)。即在水溫24—26℃條件下, 二倍體泥鰍卵子與紫外滅活的黃河鯉精子授精3min30s, 于41℃的熱水中持續(xù)處理2min,常規(guī)孵化。利用該誘導(dǎo)參數(shù), 本研究成功實(shí)現(xiàn)了人工誘導(dǎo)泥鰍減數(shù)分裂雌核發(fā)育, 并進(jìn)一步通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)?zāi)圉q的染色體數(shù)目和相對(duì)DNA含量, 確定人工誘導(dǎo)的減數(shù)分裂雌核發(fā)育胚胎為二倍體。

細(xì)胞DNA熒光染色與共聚焦3D成像相結(jié)合的技術(shù)為研究魚(yú)類(lèi)生殖細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程提供了新的技術(shù)手段, 如Zhang等[18]用了PI (碘化丙啶)紅熒光和DAPI藍(lán)熒光, 追蹤了異育銀鯽減數(shù)分裂染色體的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。本研究通過(guò)DAPI熒光染色后,采用光切層共聚焦3D顯微成像的方法, 對(duì)泥鰍早期胚胎第二次減速分裂中期、第二次減速分裂后期以及精卵融合、第二極體排出的核變化過(guò)程進(jìn)行了時(shí)序觀察, 獲得了二倍體泥鰍卵第二極體染色體與卵染色體分離的時(shí)間參數(shù), 該方法與已報(bào)道的泥鰍受精過(guò)程及第二極體排出過(guò)程中細(xì)胞學(xué)觀察法相比有明顯的優(yōu)勢(shì)。在為數(shù)不多的泥鰍受精細(xì)胞學(xué)觀察研究中, 胡雨等[19]通過(guò)掃描電鏡檢測(cè)和石蠟切片觀察, 觀察到二倍體泥鰍的受精后, 精子入卵時(shí)受精孔的表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化, 但是步驟較為復(fù)雜, 耗時(shí)較長(zhǎng)。黃松錢(qián)等[20]使用了熒光染料DAPI,對(duì)誘導(dǎo)三倍體泥鰍受精卵及胚胎早期發(fā)育的遺傳物質(zhì)進(jìn)行了追蹤, 但在普通熒光顯微鏡下的圖像可能出現(xiàn)卵表面黏附精子的干擾, 且不易看出卵子與精子空間上的相對(duì)位置。本研究通過(guò)DAPI染色結(jié)合共聚焦3D成像分析, 觀察精子及卵子核移動(dòng)的3D過(guò)程, 可以更為清晰地顯示染色體的高度螺旋狀態(tài),并且排除背景的雜色干擾。研究溫度休克處理對(duì)卵子的影響, 可以為建立精準(zhǔn)的人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)提供細(xì)胞學(xué)的理論依據(jù)。

在已報(bào)道的人工誘導(dǎo)泥鰍雌核發(fā)育的研究中,初步分析了第二極體形成和溫度休克處理的時(shí)間點(diǎn), 但不同學(xué)者的研究結(jié)果不同。如胡雨等[19]通過(guò)組織觀察, 發(fā)現(xiàn)二倍體泥鰍第二極體形成的時(shí)間為授精后6—8min; 黃松錢(qián)等觀察到二倍體泥鰍授精后5—10min第二極體已形成且未排出; 趙振山等[21]發(fā)現(xiàn)大鱗副泥鰍卵與泥鰍精子授精后6—9min時(shí)雌核膨脹后向卵子內(nèi)部移動(dòng), 提示此時(shí)第二極體已經(jīng)形成; 何進(jìn)[22]通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二倍體泥鰍雌核發(fā)育授精后3min熱休克的處理效果最佳; 林忠喬等[14]發(fā)現(xiàn)四倍體泥鰍雄核發(fā)育授精后5min冷休克的處理效果最佳。以上研究中, 第二極體形成和溫度休克處理時(shí)間點(diǎn)的差異可能與卵子狀態(tài)、干法授精及孵化時(shí)的水溫、刺激卵子第二次減數(shù)分裂的精子來(lái)源的不同有關(guān)。本研究對(duì)比了在24—26℃水溫條件下, 泥鰍卵子分別與泥鰍精子、鯉精子及滅活的鯉精子進(jìn)行人工授精后第二次減數(shù)分裂的細(xì)胞學(xué)過(guò)程, 其中使用滅活鯉精子刺激后的泥鰍卵子分別進(jìn)行熱休克和未熱休克兩種方式處理。本研究觀察到滅活的鯉精子刺激泥鰍卵第二極體分開(kāi)的時(shí)間是授精后4—6min, 用未滅活的鯉精子刺激分開(kāi)的時(shí)間是授精后3—5min, 而使用滅活的鯉精子刺激后又熱休克, 泥鰍卵子第二極體與卵核分開(kāi)的時(shí)間是授精后3—5min。不同卵子第二極體與卵核分開(kāi)的時(shí)間點(diǎn)略有不同, 這主要受卵子質(zhì)量的影響。將熱休克的起始時(shí)間設(shè)置在我們觀察到的第二極體與卵核最早出現(xiàn)分離后的30s, 即授精后3min30s, 并持續(xù)熱休克處理2min。在此過(guò)程中, 泥鰍卵的第二極體與卵核逐漸開(kāi)始分離。在熱休克結(jié)束時(shí), 即授精后5min30s, 基本所有的泥鰍第二極體與卵核已經(jīng)分離, 使得熱休克處理最大程度影響泥鰍第二極體與卵核分開(kāi)的過(guò)程。因此, 本研究將人工誘導(dǎo)泥鰍雌核發(fā)育的熱休克起始時(shí)間點(diǎn)優(yōu)化為受精后3min30s, 持續(xù)熱休克處理2min。比較發(fā)現(xiàn), 泥鰍卵在滅活的鯉精子刺激后, 不進(jìn)行熱休克處理的卵子, 其第二極體形成時(shí)間相較于熱休克處理的卵子稍晚, 精子的種類(lèi)、精子的滅活和受精卵孵化水溫度的變化是否對(duì)泥鰍第二次減數(shù)分裂過(guò)程的快慢有影響還需要進(jìn)一步研究。

本研究誘導(dǎo)獲得的雌核發(fā)育胚胎的畸形率為22.24%, 略高于授精3min后持續(xù)60min的冷休克畸形率(14.53%)[23]。但是, 本研究基于泥鰍雌核發(fā)育胚胎的細(xì)胞學(xué)特征建立的精準(zhǔn)的人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù), 通過(guò)熱休克得到的胚胎二倍率達(dá)64.71%,高于授精后3min后持續(xù)2min的熱休克(42.79%)、授精后3min后持續(xù)20min的冷休克(38.11%)。而且,本研究利用核型分析和流式細(xì)胞技術(shù)從染色體和DNA水平鑒定雌核發(fā)育誘導(dǎo)成功率, 相較于孵化率和正常苗率能更準(zhǔn)確反映人工誘導(dǎo)泥鰍雌核發(fā)育的二倍化效率。熱休克的持續(xù)時(shí)間通常比冷休克更短[24,25], 因此找到泥鰍減數(shù)分裂第二極體形成及排出的精確時(shí)間對(duì)于泥鰍減數(shù)分裂雌核發(fā)育的研究具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)第二極體與卵核分離到第二極體完成排出的時(shí)間為授精后5—10min,長(zhǎng)于本研究中熱休克的持續(xù)時(shí)間2min。那么要對(duì)第二極體的排出進(jìn)行干擾, 相較于在第二極體與卵核分開(kāi)的早期進(jìn)行熱休克處理, 在第二極體與卵核分開(kāi)的中后期對(duì)受精卵進(jìn)行熱休克處理的誘導(dǎo)效果是否會(huì)更好, 尚需要在未來(lái)的研究中進(jìn)行分析。

綜上所述, 本研究通過(guò)觀察泥鰍第二次減數(shù)分裂時(shí)期卵染色體與第二極體染色體分離的過(guò)程, 基于細(xì)胞生物學(xué)特征, 優(yōu)化了人工誘導(dǎo)泥鰍減速分裂雌核發(fā)育熱休克的起始時(shí)間, 并利用優(yōu)化的誘導(dǎo)參數(shù)條件, 成功得到雌核發(fā)育二倍體泥鰍子代。在核物質(zhì)層面分析泥鰍減速分裂雌核發(fā)育的條件, 為建立精準(zhǔn)的人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)快速獲得全雌的泥鰍新種質(zhì)提供了可靠的技術(shù)支撐。