李可心 祝璟琳, 李大宇 鄒芝英 肖 煒 喻 杰 陳炳霖 楊 弘*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院, 無錫 214128; 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無錫 214081)

羅非魚(Oreochromisspp.)是熱帶和亞熱帶地區(qū)的世界性養(yǎng)殖魚類, 具有無肌間刺、生長快、繁殖能力強(qiáng)和適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1]。中國羅非魚產(chǎn)量全球第一, 2020年達(dá)到165.54萬噸。隨著養(yǎng)殖密度的增加和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化, 羅非魚病害逐漸增多, 其中由無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)引起的鏈球菌病已成為限制羅非魚產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的最重要因素之一[2]。無乳鏈球菌, 也稱為B組鏈球菌(GBS), 引起魚類敗血癥、腦膜腦炎、突眼癥、厭食癥和腹水等癥狀[3]。目前在尖吻鱸(Lates calcarifer)[4], 亞馬遜鯰(Pseudoplatystomasp.)[5]、龍膽石斑(Epinephelus lanceolatus)[6,7]和金鯧(Trachinotus ovatus)[8]等病魚體內(nèi)也分離出無乳鏈球菌。據(jù)報(bào)道, 鏈球菌病暴發(fā)引起了世界各地的羅非魚大規(guī)模死亡, 造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[9,10]。

抗病育種是通過定向選擇或改變某些基因型來培育對(duì)特定疾病產(chǎn)生較強(qiáng)抵抗力的動(dòng)物新品種的方法。近幾年我國羅非魚養(yǎng)殖品種不斷更新?lián)Q代, 培育出了“壯羅1號(hào)”羅非魚等新品種, 在同等養(yǎng)殖條件下, “壯羅1號(hào)” 羅非魚抗無乳鏈球菌感染能力比吉富羅非魚(Oreochromis niloticusGIFT strain)強(qiáng), 養(yǎng)殖成活率比吉富羅非魚高15.2%—21.4%[11]。羅非魚養(yǎng)殖品系較多, 不同品系間抗病力差異較大,不同學(xué)者探討了不同遺傳背景的羅非魚與其抵抗無乳鏈球菌能力的相關(guān)性。Huang等[12]研究發(fā)現(xiàn)奧尼羅非魚 (O.niloticus♀×O.aureus♂)比“新吉富”羅非魚(NEW GIFT tilapia,O.niloticus♀×O.niloticus♂)和吉奧羅非魚(NEW GIFT tilapia ♀×O.aureus♂)對(duì)無乳鏈球菌的抵抗力更強(qiáng), 抗病力與某些天然免疫參數(shù)有關(guān), 如溶菌酶活性、NBT活性和特異性抗體水平。強(qiáng)俊等[13]研究發(fā)現(xiàn)吉富羅非魚與奧利亞羅非魚雜交后代對(duì)海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)的抗病力明顯高于吉富羅非魚自繁組F1代, 相同攻毒條件下奧利亞羅非魚自繁組F1代死亡率最低, 奧利亞羅非魚較強(qiáng)的抗病性能可能有助于提高雜交子代的抗病力。有文獻(xiàn)認(rèn)為不同品系羅非魚抗病力和耐受性差異是先天免疫和后天免疫協(xié)同作用的結(jié)果[12]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)雜交育種能提高魚體抗病力, 奧利亞羅非魚抗鏈球菌病能力介于奧尼羅非魚和尼羅羅非魚之間[14]。與其他羅非魚品系相比, 奧利亞羅非魚在耐寒、耐鹽等抗逆性方面也有顯著優(yōu)勢(shì)[15,16], 已被廣泛用作奧尼雜交羅非魚的親本。研究發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚對(duì)無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的抗性存在加性遺傳變異, 表明通過人工選擇提高對(duì)鏈球菌病暴發(fā)的存活率是可能的[17,18]。因此, 通過選育親本來提高雜交子代的抗病性能是可行的, 本研究以奧利亞羅非魚“夏奧1號(hào)”和埃及品系為研究材料, 檢測(cè)它們感染無乳鏈球菌后存活率, 血清中生化指標(biāo)和脾臟促炎性細(xì)胞因子表達(dá)變化差異, 初步篩選出抗病力和耐受性強(qiáng)的品系, 為培育抗鏈球菌病的奧尼羅非魚提供抗性的親本種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚

本實(shí)驗(yàn)所用魚均來自國家特色淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系羅非魚種質(zhì)資源和品種改良崗位的保種基地, 其中奧利亞羅非魚“夏奧1號(hào)”(簡寫為AX品系)為1983年從美國引進(jìn)的奧利亞羅非魚群體基礎(chǔ)上十代連續(xù)群體選育獲得的新品種(品種登記號(hào)GS-01-002-2006), 奧利亞羅非魚埃及品系(簡寫為AE品系)為1999年從埃及農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)和農(nóng)墾部水產(chǎn)研究中心實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)的奧利亞羅非魚, 其卵子在鱖精子異源刺激后, 經(jīng)雌核發(fā)育和群體選育培育而成的新品系。每種羅非魚隨機(jī)取150尾進(jìn)行強(qiáng)化培育,每天投喂1次羅非魚專用膨化飼料, 投喂量為魚體重的3%—8%。在培育結(jié)束后將羅非魚拉回實(shí)驗(yàn)室在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)32℃暫養(yǎng)14d, 此時(shí)AX奧利亞羅非魚體重(145±40) g, AE奧利亞羅非魚體重(130±35) g。病原菌用無乳鏈球菌GX1101在中國典型微生物保藏中心編號(hào)為 CCTCC NO: M 2020547, 保存在本實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱, 經(jīng)復(fù)壯后使用。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間保持水溫(33±1)℃, 感染實(shí)驗(yàn)在加熱棒控溫的獨(dú)立養(yǎng)殖桶中進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)感染實(shí)驗(yàn)①: 對(duì)強(qiáng)化培育結(jié)束后的兩種奧利亞羅非魚分別注射1.3×107cfu/mL無乳鏈球菌, 評(píng)估兩種奧利亞羅非魚對(duì)無乳鏈球菌的抗病力。菌濃度經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定, 高于半致死濃度。每種羅非魚設(shè)置3個(gè)平行組, 每個(gè)平行組10尾魚, 每尾魚腹腔注射無乳鏈球菌0.2 mL。人工感染后進(jìn)行為期7d的觀察, 統(tǒng)計(jì)7d內(nèi)存活率, 繪制Kaplan-Meier生存曲線。感染無乳鏈球菌期間羅非魚禁食。

感染實(shí)驗(yàn)②: 兩種奧利亞羅非魚各取120尾, 分4組暫養(yǎng)在160 L水族箱中7d, 后進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)。其中3組羅非魚每尾魚腹腔注射0.2 mL的無乳鏈球菌, 為保證在感染后有足夠存活數(shù)量的羅非魚進(jìn)行血液和組織樣品的采集, 菌液注射濃度低于預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的半致死濃度, 最終菌液濃度確定為2.2×106cfu/mL; 剩余1組腹腔注射等量的無菌生理鹽水, 用于分析血清生化指標(biāo)和脾臟促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)變化, 評(píng)估兩種奧利亞羅非魚對(duì)無乳鏈球菌的耐受性。

樣品采集感染實(shí)驗(yàn)②中生理鹽水腹腔注射后, 在無乳鏈球菌腹腔注射后7h、24h、48h、72h、120h和168h每種奧利亞羅非魚隨機(jī)取6尾魚進(jìn)行血液和脾臟的采集。采用尾靜脈取血法, 將抽取的血液收集到1.5 mL離心管, 室溫靜置2—4h后,以4000 r/min, 4℃的條件離心10min, 抽取上層血清于新的1.5 mL離心管中, -20℃保存待用。另外取羅非魚新鮮抗凝血液100 μL用于測(cè)定呼吸暴發(fā)強(qiáng)度。無菌操作采集脾臟, 放入加有1 mL TRIzol的凍存管中, 液氮速凍后保存在-80℃冰箱, 直至分析。

羅非魚血清生化指標(biāo)測(cè)定通過日立7600全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血液的血清生化指標(biāo), 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、球蛋白(GLO)、葡萄糖(GLU)、乳酸脫氫酶(LDH)、甘油三酯 (TG)和膽固醇(TC), 試劑盒從日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社采購; 堿性磷酸酶(AKP)試劑盒從四川邁克生物科技股份有限公司采購; 超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒從寧波美康生物科技有限公司采購。溶菌酶(LZM)活力按照南京建成生物工程研究所的溶菌酶試劑盒說明書方法測(cè)定。血液呼吸暴發(fā)采用NBT(硝基四氮唑藍(lán))還原法[12]測(cè)定。

總RNA的提取和cDNA合成將保存在-80℃冰箱中的脾臟樣品取出, 放入Sceintz-48型高通量組織研磨機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)中研磨勻漿。用TRIzol法提取總RNA。用Nanodrop超微量紫外分光光度計(jì)(Thermo公司)測(cè)定提取的總RNA的濃度及純度, 并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。通過 PrimeScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)合成cDNA, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和內(nèi)參基因β-actin的基因序列見表1, 在7900HT Fast Real Time PCR儀(ABI公司)上進(jìn)行qRT-PCR測(cè)定基因的表達(dá)量。20 μL反應(yīng)體系為: SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo公司) 10 μL, cDNA模板 1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, 無RNA水7.4 μL; PCR擴(kuò)增程序: 95℃5min; 95℃ 15s, 60℃ 1min, 40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-1β和IL-6的相對(duì)表達(dá)量。

表1 本研究所用引物序列Tab.1 Primer sequence used in the study

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行圖表制作, 使用SPSS 25.0 和Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。使用Log-rank檢驗(yàn)兩種奧利亞羅非魚人工感染后生存曲線的差異, 并用P值顯示兩種奧利亞羅非魚生存曲線的差異顯著性。方差齊性通過Levene’s 檢驗(yàn)后, 采用One-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析, Duncan’s多重比較差異顯著性, 顯著性水平為0.05。血清生化指標(biāo)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示, 定量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后生存曲線

由圖1可知, 在人工感染無乳鏈球菌后, 奧利亞羅非魚AE品系羅非魚在感染后7d內(nèi)的存活率為30%, AX品系在感染后7d內(nèi)的存活率為10%。AE品系在感染后各時(shí)間點(diǎn)生存曲線一直高于AX品系,Log-rank檢驗(yàn)后顯示P=0.0477, 有顯著性差異。

圖1 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后的生存曲線Fig.1 Kaplan-Meier survival curve for two blue tilapia species in the S.agalactiae challenge test

2.2 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血液生化指標(biāo)變化

兩種奧利亞羅非魚在感染后ALT活性都呈現(xiàn)升高趨勢(shì), 在感染后168h達(dá)到最大值。AE奧利亞羅非魚在感染后7h顯著升高(P＜0.05), AX奧利亞羅非魚在感染后24h顯著升高(P＜0.05)。感染前兩種奧利亞羅非魚ALT活性沒有顯著性差異(P＞0.05),在感染后7—168h, AE奧利亞羅非魚的血清ALT活性顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖2a)。兩種奧利亞羅非魚在感染后血清AST活性都顯著性升高(P＜0.05), 呈先上升后下降再上升的趨勢(shì), 且都在感染后48h達(dá)到最大值。在感染前、感染后7h和72h, AE奧利亞羅非魚的血清AST活性顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖2b)。

圖2 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(a)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(b)含量變化Fig.2 Changes of serum alanine aminotransferase (a) and aspartate aminotransferase (b) in two blue tilapia species infected with S.agalactiae

兩種奧利亞羅非魚感染后血清白蛋白與球蛋白比值(A/G)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì), AE奧利亞羅非魚在感染后7h血清A/G比值顯著降低(P＜0.05), 而AX奧利亞羅非魚在感染后24h血清A/G比值顯著下降(P＜0.05)。AE奧利亞羅非魚血清在感染前和感染后7h 的A/G比值和AX奧利亞羅非魚沒有顯著性差異, 在感染后24h和48h顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05)。AE奧利亞羅非魚的血清A/G比值始終低于AX奧利亞羅非魚(圖3a)。

圖3 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清白蛋白/球蛋白(a)和球蛋白(b)含量變化Fig.3 Changes of serum albumin/globulin (a) and globulin (b) contents in two blue tilapia species infected with S.agalactiae

兩種奧利亞羅非魚在感染前血清GLO無顯著性差異(P＞0.0 5), 在感染后4 8 h 顯著性升高(P＜0.05)。在感染后7h和168h, AE奧利亞羅非魚的血清GLO含量顯著高于AX奧利亞羅非魚(圖3b)。

兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清AKP活性先升高后降低, 在感染后72h達(dá)峰。AE奧利亞羅非魚的血清AKP活性在感染前和感染后7h顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖4a)。

圖4 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清堿性磷酸酶(a)和超氧化物歧化酶(b)含量變化Fig.4 Changes of serum alkaline phosphatase (a) and superoxide dismutase (b) contents in two blue tilapia species infected with S.agalactiae

兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清SOD活性先升高后降低, 在感染后48h達(dá)峰, AX奧利亞羅非魚在感染后72h就恢復(fù)到感染前水平,AE奧利亞羅非魚在感染后168h恢復(fù)到感染前水平。兩種奧利亞羅非魚的血清SOD水平在感染前和感染后7h沒有顯著性差異(P＞0.05), AE奧利亞羅非魚的血清SOD水平在感染后24h、120h和168h顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖4b)。

AE奧利亞羅非魚在感染后7h血清GLU含量顯著升高并達(dá)峰, 之后逐漸降低; AX奧利亞羅非魚在感染后GLU含量呈下降趨勢(shì)。感染前AE奧利亞羅非魚的GLU含量顯著低AX奧利亞羅非魚(P＜0.05),感染后兩種羅非魚的GLU含量沒有顯著性差異(P＞0.05; 圖5a)。

圖5 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清葡萄糖(a)和乳酸脫氫酶(b)含量變化Fig.5 Changes of serum glucose (a) and lactate dehydrogenase (b) contents in two blue tilapia species infected with S.agalactiae

兩種奧利亞羅非魚感染后血清LDH活性先升高后降低, 在感染后7h顯著升高(P＜0.05), 并都在感染后48h達(dá)峰; AE奧利亞羅非魚在感染后120h恢復(fù)到感染前水平, AX奧利亞羅非魚在感染后168h恢復(fù)到感染前水平。AE奧利亞羅非魚在感染后7—72h LDH活性顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05),在感染前、感染后120h和168h兩種奧利亞羅非魚的LDH活性沒有顯著差異(P＞0.05; 圖5b)。

AE奧利亞羅非魚感染后血清TC含量在感染后7h顯著降低(P＜0.05); AX奧利亞羅非魚則先升高后降低再升高, 在感染后48h恢復(fù)到感染前水平。AE奧利亞羅非魚在感染后24h TC含量顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖6a)。

圖6 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清膽固醇(a)和甘油三酯(b)含量變化Fig.6 Changes of serum cholesterol (a) and triglyceride (b) contents in two blue tilapia species infected with S.agalactiae

兩種奧利亞羅非魚感染后血清TG含量先降低后升高, AE奧利亞羅非魚在感染后24h最低, AX奧利亞羅非魚在感染后48h最低, 感染后168h時(shí)AX奧利亞羅非魚恢復(fù)到感染前水平。AE奧利亞羅非魚在感染后24h的TG含量顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖6b)。

兩種奧利亞羅非魚感染后血清LZM都升高后降低, AE奧利亞羅非魚在感染后7h顯著升高(P＜0.05), 在感染后120h恢復(fù)至感染前水平; AX奧利亞羅非魚在感染后LZM始終顯著高于感染前水平(P＜0.05)。AE奧利亞羅非魚在感染前和感染后7h的LZM顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 而在感染后72—120h顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖7a)。

圖7 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清溶菌酶活性(a)和呼吸暴發(fā)(b)變化Fig.7 Changes of serum lysozyme activity (a) and respiratory burst (b) contents in two blue tilapia species infected with S.agalactiae

兩種羅非魚的呼吸暴發(fā)程度在感染后7h顯著性下降(P＜0.05)。感染后兩種奧利亞羅非魚呼吸暴發(fā)都顯著降低(P＜0.05); AE奧利亞羅非魚在感染前和感染后24h呼吸暴發(fā)強(qiáng)度顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 在其他時(shí)間點(diǎn)則沒有顯著性差異(P＞0.05; 圖7b)。

2.3 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后脾臟促炎性細(xì)胞因子表達(dá)變化

兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后脾臟TNF-α表達(dá)顯著升高(P＜0.05), 在感染后7h達(dá)峰, 之后顯著性下降(P＜0.05), 但在感染后168h都顯著高于感染前水平; AE奧利亞羅非魚的脾臟TNF-α表達(dá)在感染前和感染后120h都顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 在其他時(shí)間點(diǎn)沒有顯著性差異(P＞0.05;圖8a)。

圖8 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后脾臟中TNF-α (a)、IL-1β (b)和IL-6 (c)相對(duì)表達(dá)量變化Fig.8 Changes of relative expression of TNF-α (a), IL-1β (b) and IL-6 (c) in two blue tilapia species infected with S.agalactiae

兩種奧利亞羅非魚在感染后脾臟IL-1β表達(dá)先升高后降低, AE奧利亞羅非魚IL-1β表達(dá)在感染后48h達(dá)峰, 之后顯著性下降(P＜0.05), 在感染后168h恢復(fù)到感染前水平; AX奧利亞羅非魚IL-1β表達(dá)在感染后72h達(dá)峰, 在感染后168h仍顯著高于感染前水平(P＜0.05)。AE奧利亞羅非魚在感染后7h、72—168h這些時(shí)間點(diǎn)IL-1β表達(dá)都顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖8b)。

兩種奧利亞羅非魚在感染后IL-6表達(dá)先升高后降低, 在感染后7h達(dá)到峰值, AE奧利亞羅非魚在感染后48h恢復(fù)到感染前水平; AE奧利亞羅非魚在感染前和感染后48—168h的IL-6表達(dá)顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 而在感染后24h顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖8c)。

3 討論

3.1 兩種奧利亞羅非魚人工感染無乳鏈球菌后存活率分析

鏈球菌病是羅非魚產(chǎn)業(yè)影響最大的細(xì)菌性疾病, 病原菌主要是無乳鏈球菌, 發(fā)病時(shí)間集中在每年的6—10月, 病程短, 死亡率高。統(tǒng)計(jì)感染后的存活率能夠初步說明魚體的抗病能力的差異和免疫強(qiáng)弱[19]。目前對(duì)鏈球菌病的防治主要依賴抗生素,但抗生素的有效性只在病情暴發(fā)的早期應(yīng)用時(shí)才能發(fā)揮作用[20]。除了抗生素外, 生態(tài)防治方法包括益生菌、魚蝦混養(yǎng)和魚菜(藥)共生等方式。此外,免疫防治是控制鏈球菌病的重要方法和未來趨勢(shì),已經(jīng)研發(fā)出不同類型的疫苗, 但距離批文和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還有一定的距離。因此, 提高羅非魚內(nèi)在抗病能力, 篩選和培育抗病品種(系)是防控鏈球菌病的根本辦法。水溫32℃以上羅非魚鏈球菌病容易暴發(fā), 提高魚體的抗病力能顯著降低感染病原菌后的死亡率[18,21,22]。抗病力(Disease resistance)是宿主通過預(yù)防感染或抑制宿主內(nèi)病原體復(fù)制來限制其宿主內(nèi)病原體載量的能力[23], 簡單來說就是宿主及其免疫系統(tǒng)如何對(duì)外來病原體負(fù)荷做出反應(yīng)。水產(chǎn)養(yǎng)殖中將抗病力定義為疾病暴發(fā)期間或人工感染期間個(gè)體的存活率(和/或死亡率)[24]。本研究顯示奧利亞羅非魚AE品系在無乳鏈球菌脅迫下生存曲線一直高于AX品系, 表明AE奧利亞羅非魚對(duì)無乳鏈球菌的抗病力強(qiáng)于AX奧利亞羅非魚。

雜交是防止品種退化及創(chuàng)制優(yōu)良品種的有效方法, 其中遠(yuǎn)緣雜交是指種間或種間以上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的兩個(gè)物種之間的雜交[25]。奧利亞羅非魚屬鱸形目、鱺魚科, 鱖屬鱸形目、鮨科。母本奧利亞羅非魚和父本鱖的遠(yuǎn)緣雜交可獲得能正常發(fā)育的雜交子代, 人工授精到魚苗階段的成活率為0.3%—0.5%[26,27]。雜交子代與奧利亞羅非魚在形態(tài)學(xué)上沒有顯著差異[26], 與母本奧利亞羅非魚有85.8%的遺傳相似性, 但與父本鱖卻只有4.9%的遺傳相似性[27]。染色體核型分析表明, 子代與奧利亞羅非魚的核型相似, 染色體數(shù)目均為2n=44, 而鱖為2n=48[28]。只有鱖染色體整套丟失而奧利亞羅非魚染色體得到自然加倍的個(gè)體才可以得到存活[29]。一般認(rèn)為, 由于種間生殖隔離的存在, 遠(yuǎn)緣雜交難以形成可育品系[25]。而本研究中的AE奧利亞羅非魚為1999年從埃及農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)和農(nóng)墾部水產(chǎn)研究中心實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)的奧利亞羅非魚, 與鱖進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交, 獲得的雜交后代可育可自繁, 歷經(jīng)6個(gè)世代的群體選育形成新品系。形態(tài)學(xué)、遺傳標(biāo)記和染色體核型等方面表明, 它們可能為異精雌核發(fā)育的奧利亞羅非魚,鱖精子在受精卵的發(fā)育過程中主要起刺激作用[26—29]。本研究中的AX奧利亞羅非魚為1983年從美國奧本大學(xué)引進(jìn)的奧利亞羅非魚經(jīng)群體選育形成的新品種, 而AE奧利亞羅非魚可能因?yàn)槿诤狭瞬糠謥碜愿副诀Z的遺傳物質(zhì), 從而提高了抗病力。類似的,新品種異育銀鯽“中科 5號(hào)”利用銀鯽獨(dú)特的異精雌核生殖, 篩選獲得整入團(tuán)頭魴父本遺傳信息, 從而比異育銀鯽“中科3號(hào)”抗病能力更強(qiáng)[30]。

在無乳鏈球菌入侵羅非魚后, 激活宿主免疫系統(tǒng), 觸發(fā)魚體對(duì)感染的抵抗力?？共×Φ闹攸c(diǎn)是通過殺死入侵的病原菌來保護(hù)宿主, 而疾病耐受性(Disease tolerance)是針對(duì)感染進(jìn)化的保守防御策略,其不對(duì)宿主病原體負(fù)荷產(chǎn)生直接的負(fù)面影響[31], 它依賴于組織損傷控制, 降低宿主對(duì)病原體或針對(duì)病原體的免疫反應(yīng)造成的組織損傷[32], 簡而言之就是宿主如何修復(fù)病原體或激活的免疫系統(tǒng)造成的損害。維持血液等各種生理系統(tǒng)平衡的機(jī)制有助于宿主對(duì)感染的耐受, 當(dāng)組織損傷的程度或宿主生理學(xué)的改變超過了耐受機(jī)制的能力時(shí), 就會(huì)出現(xiàn)感染的病理結(jié)果; 相反, 較強(qiáng)的耐受性有助于減少發(fā)病率和死亡率[32]。

3.2 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血液生化指標(biāo)變化分析

血液學(xué)檢查是評(píng)估魚類生理狀態(tài)和健康的常用方法之一[33], 當(dāng)羅非魚受無乳鏈球菌感染后, 組織或器官受到損害, 可以在血清酶學(xué)指標(biāo)上反映出來。谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶是評(píng)價(jià)肝臟是否受損的重要指標(biāo)[34]。肝臟急性損傷或壞死性病變導(dǎo)致血清 ALT 和 AST 水平顯著升高, 具有重要的魚病診斷意義[35—37]。在本研究中, 兩種奧利亞羅非魚的血清ALT和AST活性在感染后都出現(xiàn)了顯著性升高, 且在感染后7—168h, AE品系的血清ALT活性顯著高于AX品系; 感染后7h和72h, AE品系的AST活性顯著高于AX品系, 說明奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后肝臟都受到了損傷, 且AE品系的肝臟受損可能更嚴(yán)重。

血清總蛋白包括白蛋白和球蛋白, 具有維持血管滲透壓和酸堿度, 參與代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸和機(jī)體免疫等生理功能[38]。白蛋白/球蛋白(A/G)比值一定程度上可以反映機(jī)體的免疫情況和肝臟的功能狀況[39]。在本研究中兩種奧利亞羅非魚感染后A/G均顯著下降, 大黃魚(Pseudosciaena crocea)感染哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)后A/G比值也呈下降趨勢(shì)[40]。球蛋白與機(jī)體免疫力息息相關(guān), 當(dāng)機(jī)體受到細(xì)菌、病毒等抗原侵襲時(shí), 血清球蛋白水平會(huì)增加, 通常被認(rèn)為與魚類更強(qiáng)的先天免疫反應(yīng)有關(guān)[41]。本研究中兩種奧利亞羅非魚球蛋白在感染后48h都顯著上升,說明兩種奧利亞羅非魚都及時(shí)產(chǎn)生了免疫球蛋白來對(duì)抗無乳鏈球菌的感染; 而AE品系的血清球蛋白在感染后7h和168h顯著高于AX品系, 表明AE品系在感染初期和后期對(duì)無乳鏈球菌有更大的耐受性。

堿性磷酸酶是一種參與代謝調(diào)控的非特異性磷酸水解酶, 與物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)合成、機(jī)體的非特異性免疫等密切相關(guān)[42]。Du等[34]研究表明尼羅羅非魚在無乳鏈球菌感染后血清中AKP活性先升高后降低再升高。本研究中兩種羅非魚血清中AKP活性在感染后先升高, 但隨著感染時(shí)間的延長, AKP活性降低。有報(bào)道表明這可能與隨著病程發(fā)展魚體貧血有關(guān)[43]。超氧化物歧化酶(SOD)是魚類體內(nèi)一種關(guān)鍵的抗氧化酶, 具有消除活性氧的毒性、參與由病毒或細(xì)菌引起的免疫反應(yīng)、平衡氧化與抗氧化等方面的作用[44]。之前研究表明奧利亞、吉富和奧尼羅非魚感染無乳鏈球菌48h時(shí)SOD都顯著升高[19]。類似的, 本研究中兩種奧利亞羅非魚在感染無乳鏈球菌后48h都升高至峰值; 但AE品系的血清SOD水平在感染后期顯著高于AX品系, 說明AE品系在感染后期的抗氧化能力更強(qiáng)。

血糖濃度是魚類重要的應(yīng)激指標(biāo)[45]。作為增強(qiáng)寄主抗性的一種策略, 宿主生物代謝受到調(diào)節(jié),以剝奪病原菌生存所需的底物[46]。葡萄糖是許多病原菌的主要碳源, 研究表明, 調(diào)節(jié)宿主葡萄糖代謝的應(yīng)激反應(yīng)可以控制組織損傷, 并建立對(duì)細(xì)菌感染的疾病耐受性[47]?；|(Lateolabrax maculatus)感染哈維氏弧菌后12h 血糖急劇下降, 在感染后24—72h隨時(shí)間顯著升高[37]。Zeng等[48]研究表明葡萄糖增強(qiáng)羅非魚對(duì)遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)感染的抵抗力。本研究中AE品系感染后血清GLU先上升后下降; AX品系感染后GLU顯著下降。血糖水平降低, 最有可能旨在限制病原菌對(duì)葡萄糖的利用[46,49]; 而AE品系可能糖原動(dòng)員能力更強(qiáng), 升高的血糖增強(qiáng)了魚體對(duì)無乳鏈球菌的耐受性。血清LDH活性增高是病魚肌肉受損的表征[50]。感染無乳鏈球菌后埃及尼羅、吉富和奧尼羅非魚血清中LDH活性先升高后降低, 在感染后48h達(dá)峰[19]。本研究中兩種奧利亞羅非魚在感染后血清LDH活性變化趨勢(shì)與之相同, 與之不同的是本次實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間更長, 在感染后168h都已恢復(fù)到感染前水平。LDH活性的變化趨勢(shì)提示, 在感染無乳鏈球菌魚體初期即有肌肉損傷, 但隨著時(shí)間的推移逐漸恢復(fù)正常。

膽固醇是細(xì)胞膜的主要結(jié)構(gòu)成分, 此外, 魚類血漿膽固醇與抗病性高度相關(guān), 是魚類健康的重要指標(biāo), 因?yàn)樗c細(xì)菌感染后的死亡率顯著相關(guān)[51]。同時(shí), 膽固醇是皮質(zhì)醇等一些類固醇激素的前體,而甘油三酯是體細(xì)胞的主要能量來源, 也作為肝功能指標(biāo)[14,52]。生物絮體和海水中褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染遲緩愛德華氏菌后TC顯著降低,表明是由于遲緩愛德華氏菌感染導(dǎo)致抗病性降低[45]。3種正交子一代奧尼羅非魚感染在感染無乳鏈球菌后3d TC和TG都顯著下降[53]。這與本研究結(jié)果類似, 說明兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后抗病力下降, 引起魚體營養(yǎng)不良、脂代謝和肝功能障礙。

溶菌酶是一種非特異性免疫抗菌酶, 具有抵抗魚類病原菌的活性。史氏鱘(Aclpenser Schrenckii)感染嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)后血清、肝臟和黏液中LZM活力出現(xiàn)不同程度升高[54]。有研究表明LZM可作為羅非魚抗病品系的選育指標(biāo), 與抗鏈球菌病能力正相關(guān)[19]。同樣, 具有較高溶菌酶活性的虹鱒(Oncorhynchus mykiss)對(duì)殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)[55]、鯉(Cyprinus Carpio)對(duì)嗜水氣單胞菌感染表現(xiàn)出更強(qiáng)的抵抗力[56]。本研究發(fā)現(xiàn)兩種品系在感染后7h的血清LZM活力都有顯著升高。AE品系的LZM在感染前和感染后7h顯著高于AX品系, 提示AE品系可能抗病力更強(qiáng)。呼吸暴發(fā)是一種重要的防御機(jī)制, 通過在生物體內(nèi)產(chǎn)生有毒的超氧陰離子(O2-)來幫助對(duì)抗病原菌[57]。海鱸(Dicentrarchus labrax)感染鰻弧菌(Vibrio anguillarum)后導(dǎo)致呼吸暴發(fā)強(qiáng)烈抑制[58]。有研究表明, 抗無乳鏈球菌或嗜水氣單胞菌的魚類比易感魚類表現(xiàn)出更高的呼吸暴發(fā)活性[12,59]。本研究中兩種品系呼吸暴發(fā)感染后都受到抑制, AE品系的呼吸暴發(fā)強(qiáng)度在感染前和感染后24h顯著高于AX品系, 表明AE品系比AX品系更不容易感染無乳鏈球菌。

3.3 兩種奧利亞羅非魚脾臟促炎性細(xì)胞因子表達(dá)差異分析

疾病耐受性和對(duì)感染的抵抗力與疾病的發(fā)展有關(guān), 脾臟是羅非魚抵抗無乳鏈球菌感染的主要靶器官, 對(duì)于細(xì)菌抗原呈遞和啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答非常重要[60]。宿主免疫反應(yīng), 如促炎細(xì)胞因子, 出現(xiàn)在受體和信號(hào)級(jí)聯(lián)之前, 在宿主防御中起著關(guān)鍵作用, 最先分泌的促炎細(xì)胞因子主要有TNF-α、IL-1β和IL-6[61]。He等[62]發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚在接種無乳鏈球菌后,TNF-α和IL-1β的表達(dá)顯著增加。本研究中兩種品系羅非魚的脾臟TNF-α、IL-1β和IL-6在感染后7h都顯著升高, 說明當(dāng)病原菌入侵后兩種羅非魚都快速產(chǎn)生了免疫應(yīng)答。IL-6是一種多效性細(xì)胞因子, 參與尼羅羅非魚對(duì)細(xì)菌感染的應(yīng)答并促進(jìn)抗體的產(chǎn)生[63]。Costa等[64]提出IL-6能夠被其他免疫因子誘導(dǎo)表達(dá), 并誘導(dǎo)抗菌肽生成, 防止機(jī)體自我損傷。炎癥是通過促炎性細(xì)胞因子和抗炎因子之間的平衡來調(diào)節(jié)的[65], 炎癥過度可能造成機(jī)體損傷[66]。AE品系在感染后24hIL-6顯著高于AX品系,但感染后48—168h卻低于AX品系;TNF-α在感染后120h顯著低于AX品系;IL-1β在感染后72—168h顯著低于AX品系, 促炎因子表達(dá)低提示炎癥程度更輕, 表明AE品系在感染前期快速誘導(dǎo)炎癥殺死病原, 但在感染后期炎癥更輕, 從而保持對(duì)無乳鏈球菌更大的耐受性。

4 結(jié)論

長期以來, 普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為, 遏制、殺死或驅(qū)逐入侵病原菌的免疫驅(qū)動(dòng)抵抗機(jī)制是對(duì)抗傳染病的主要防御策略。然而, 疾病耐受性是一種同樣重要的宿主防御感染策略, 它不會(huì)對(duì)病原菌產(chǎn)生直接的負(fù)面影響, 同時(shí)在功能上與免疫驅(qū)動(dòng)的抵抗機(jī)制相互作用, 以限制傳染病的嚴(yán)重程度[47,67]。本研究比較了奧利亞羅非魚AE品系和AX品系對(duì)無乳鏈球菌的抗病力差異, 血清生化指標(biāo)和脾臟中促炎性細(xì)胞因子表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)人工感染后7d內(nèi)AE奧利亞羅非魚生存率顯著高于AX奧利亞羅非魚。感染后兩種奧利亞羅非魚血清中的ALT、AST、GLO、AKP、SOD和LZM顯著升高; A/G、TG顯著下降, 呼吸暴發(fā)抑制; 且AE品系的血清球蛋白和SOD水平在感染后期顯著高于AX品系。定量PCR結(jié)果顯示兩種奧利亞羅非魚脾臟TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)在感染后7h都顯著升高, 但AE品系在感染后期3種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)都顯著低于AX品系。研究表明AE品系對(duì)無乳鏈球菌的抗病力強(qiáng)于AX品系, 在感染后期的抗氧化能力更強(qiáng), 炎癥程度更輕, 從而保持對(duì)無乳鏈球菌更大的耐受性。本研究初步篩選出抗病力和耐受性強(qiáng)的奧利亞羅非魚品系, 為培育抗鏈球菌病的奧尼羅非魚提供抗性的親本種質(zhì)資源。