張翔宇 李金良 李旭廷 李思聰 張敏 王吳燕 楊銳

摘要：TLR4能識別內(nèi)毒素脂多糖（LPS），在介導(dǎo)革蘭氏陰性菌及其LPS的宿主反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是研究肉兔抗病力的重要候選基因。為了研究TLR4在不同肉兔品種的突變情況，設(shè)計(jì)引物對2個(gè)不同肉兔品種的12個(gè)個(gè)體的TLR4部分編碼區(qū)進(jìn)行序列擴(kuò)增，并比較其序列。結(jié)果表明，共檢測到3個(gè)SNP位點(diǎn)，均為非同義突變。2個(gè)非同義位點(diǎn)（G628T和C653A）位于預(yù)測蛋白的亮氨酸富集區(qū)（LRR）區(qū)域。LRR區(qū)域發(fā)生的非同義突變，尤其是亮氨酸的改變和氨基酸極性的改變可能會(huì)影響TLR4對病原的識別，這些SNP位點(diǎn)將有助于肉兔抗病分子標(biāo)記的研究。

關(guān)鍵詞：肉兔；TLR4基因；單核苷酸突變；非同義突變；抗病力

中圖分類號：S829.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）11-0100-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.025

Abstract： TLR4 could detect endotoxin by identifying lipopolysaccharide （LPS） and play a key role in host defense mediated by Gram-negative bacteria（LPS），therefore， TLR4 is a significant candidate gene for rabbit diseases resistance research. To identify nucleotide polymorphisms between two different breeds we designed primer pairs that amplified fragments of coding sequence（CDS） of 12 individuals， and compared the sequences. Comparative sequence analysis indicated that 3 SNPs were identified， all were non-synonymous SNPs. Two nonsynonymous SNPs（G628T and A653C） were located in the LRR domains of the predicted protein. The nonsynonymous SNPs in the LRR domains， especially related to leucine residues， may dramatically alter the ability to identified extracellular pathogens. The identification of these polymorphisms reported here increases the resource of genetic markers useful for association analyses with disease resistance and provides an important theoretical basis for disease resistant breeding of meat rabbits.

Key words： meat rabbits；TLR4 gene；SNP；nonsynonymous SNPs；disease resistance

Toll樣受體首次在果蠅的胚胎發(fā)育中發(fā)現(xiàn)，稱dToll。隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)人與其他哺乳動(dòng)物存在與Toll類似的一組蛋白，稱為Toll樣受體[1，2]。Toll樣受體廣泛分布于機(jī)體各組織中，在識別病原相關(guān)分子模式中起重要作用，形成機(jī)體應(yīng)對病原入侵的“第一道防線”[3]。TLR4是TLRs家族的重要成員之一，可以識別各種病原微生物成分，誘導(dǎo)機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)，TLR4基因變異可影響其受體結(jié)合配體的功能及其與配體結(jié)合以后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，對機(jī)體的病原識別和抗病性能具有重要影響[4]。研究表明，TLR4基因多態(tài)性與宿主的炎癥應(yīng)答及對傳染性疾病的易感性存在關(guān)聯(lián)[5]。TLR4屬于細(xì)胞表面TLR，其結(jié)構(gòu)分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3個(gè)部分。胞外區(qū)有18～31個(gè)亮氨酸的重復(fù)序列（Leucine-rich repeats，LRRs），胞內(nèi)區(qū)由Tol同源結(jié)構(gòu)域 （Tolhomology domain，TH domain）和Toll樣受體/白介素-同源結(jié)構(gòu)域（Toll/L-1-receptor homologous region，TIR）構(gòu)成。牛TLR4基因結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性與乳房炎的相關(guān)性研究已有較多報(bào)道，TLR4可能在宿主對乳房內(nèi)感染應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用[6]。人的TLR4基因多態(tài)性與消化系統(tǒng)疾病和呼吸系統(tǒng)疾病存在顯著關(guān)聯(lián)。兔TLR4基因多態(tài)性與消化系統(tǒng)疾病的易感性存在關(guān)聯(lián)。四川白兔是中國珍貴的本地兔種資源，具有耐粗飼、適應(yīng)能力強(qiáng)的特點(diǎn)。為了比較四川白兔與其他品種的遺傳差異，本研究檢測了2個(gè)不同品種的12只肉兔TLR4基因的遺傳多態(tài)性，以期為肉兔TLR4基因的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和DNA抽提

樣品來自2個(gè)不同品種（新西蘭白兔和四川白兔）的12只肉兔，每個(gè)品種各6只，公母各半。采集靜脈全血后-20 ℃保存。另外，采集1只新西蘭白兔的腿肌，用于目的片段的確認(rèn)和擴(kuò)增條件的優(yōu)化。利用Universal Genomic DNA Extraction Kit（TaKaRa公司）試劑盒抽提基因組DNA。

1.2 PCR擴(kuò)增和SNP的檢測

采用Web interface for Primer3（http：//frodo.wi.mit.edu/primer3）設(shè)計(jì)4對引物擴(kuò)增肉兔TLR4基因的部分編碼區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物部分重疊，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為25 μL：50～100 ng 模板DNA，上下游引物各0.4 μmol/L，2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，連續(xù)循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min。引物4的PCR程序除退火溫度為58 ℃外，其他條件與上述相同。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)明膠電泳后，利用QIA Quick PCR Purification Kit進(jìn)行純化。純化后的PCR產(chǎn)物利用ABI 3730XL進(jìn)行測序。利用Sequencher 4.7軟件進(jìn)行SNPs的檢測并進(jìn)行人工核對。

2 結(jié)果與分析

為了檢測目的區(qū)域的多態(tài)性，設(shè)計(jì)4對引物對目的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增得到4段PCR產(chǎn)物，這些產(chǎn)物部分序列相互重疊，長度612～722 bp。序列拼接后得到2 080 bp的兔TLR4目的序列。通過對2個(gè)不同品種目的序列和參考序列（NM_001082781）的比對，共檢測到3個(gè)SNP位點(diǎn)，均為非同義突變位點(diǎn)。其中1個(gè)為轉(zhuǎn)換，2個(gè)為顛換。非同義突變在所檢測的編碼區(qū)的發(fā)生率（Polymorphism）為693 bp。突變位點(diǎn)所在基因組的位置，突變類型和氨基酸的位置見表2。檢測到的非同義突變分布在TLR4的主要預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)域，包括亮氨酸富集區(qū)（LLR）。

3 討論

TLRs在宿主識別入侵的PAMPs中起重要作用[7]，更多的證據(jù)表明TLRs在家畜識別PAMPs入侵中也同樣發(fā)揮重要作用[8]。本研究共檢測到3個(gè)SNPs，病原微生物的多樣性可能是造成肉兔TLR4編碼區(qū)序列存在多態(tài)性的主要原因。這些SNPs中或許存在對特定病原抗病力產(chǎn)生影響的SNPs。TLR4的多態(tài)位點(diǎn)主要分布在預(yù)測蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。豬、牛和人的TLRs多態(tài)位點(diǎn)的比較分析表明，非同義突變主要存在于胞外結(jié)構(gòu)域，尤其是LRRs區(qū)域[9]。胞外結(jié)構(gòu)域在TLR4識別病原體相關(guān)分子模式中起重要作用。TLR4的多態(tài)性可以增加對PAMPs變異的識別能力，以應(yīng)對病原微生物的快速進(jìn)化。TLR4胞外結(jié)構(gòu)域的非同義突變能提高宿主的免疫力，從而提高群體的生存能力[10]。LRRs區(qū)域的非同義突變，尤其是亮氨酸殘基的改變，可能會(huì)明顯改變宿主對胞外病原的識別能力[11]。位于兔TLR4 757位的非同義突變造成了氨基酸電荷的改變，而628和653位的突變造成了氨基酸極性的改變。無論是氨基酸電荷還是極性的改變，都有可能對TLR4蛋白的細(xì)胞外病原識別能力造成影響，進(jìn)而影響宿主的抗病力。人類的TLR4突變位點(diǎn)的研究表明，TLR4突變造成了個(gè)體抗病力的下降[12]。TLR4首先通過結(jié)合CD14和MD-2等受體，再識別模式分子。因此，突變可能影響TLR4對受體的識別，進(jìn)而影響其對病原的識別，對個(gè)體的抗病力造成不利的影響。

前期研究表明，TLR4的多態(tài)位點(diǎn)與多種炎癥反應(yīng)存在關(guān)聯(lián)。C3H/HeJ品系小鼠對脂多糖（LPS）具有高度耐受性，而C57BL/10ScCr品系野生型小鼠對革蘭氏陰性菌感染存在高度易感性，前者是由于TLR4基因胞質(zhì)區(qū)域的1個(gè)點(diǎn)突變導(dǎo)致1個(gè)氨基酸從脯氨酸變?yōu)榻M氨酸而引起的錯(cuò)義突變，而后者在TLR4基因上出現(xiàn)了缺失，說明TLR4基因是LPS信號傳遞的關(guān)鍵[13]。TLR4多態(tài)位點(diǎn)與巴斯德肺炎球菌的感染存在關(guān)聯(lián)。研究表明，TLR4蛋白259位的突變與呼吸道合胞病毒（RSV）的感染存在弱相關(guān)，TLR4兩個(gè)單倍型也與RSV的感染有相關(guān)關(guān)系[14]。另外，TLR4基因與膿毒癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘等疾病和腸炎等微生物感染所產(chǎn)生的疾病有關(guān)。TLR4基因多態(tài)性（Asp299Gly和Thr399Ileu）與胃炎相關(guān)性研究表明，TLR4基因Thr 399 Ileu突變可能是胃炎的一個(gè)致病因素，還可能與慢性炎癥有關(guān)[15]。

目前，TLR4基因編碼區(qū)內(nèi)Asp299Gly和Thr399Ile 2個(gè)SNP位點(diǎn)的研究較多，且已證實(shí)與感染性疾病密切相關(guān)[16-18]。TLR4等位基因 Asp299Gly的突變將增加人體對革蘭氏陰性菌的易感性，同時(shí)Asp299Gly等位基因與炎性反應(yīng)有相關(guān)性。膿毒癥發(fā)病的相關(guān)研究表明，Asp299Gly和Thr399Ile突變位點(diǎn)與膿毒癥的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。該位點(diǎn)的突變型較易感染革蘭氏陰性菌和患膿毒癥，且死亡率較高。另外一項(xiàng)研究表明，上述SNPs位點(diǎn)與革蘭氏陰性菌感染引起的敗血癥發(fā)生率密切相關(guān)[19]?；蚯贸∈笤囼?yàn)證實(shí)TLR4、MyD88均參與動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程，Asp299Gly與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步研究表明，與Thr399Ile相比Asp299Gly可能更易影響TLR4的功能[20]。

4 結(jié)論

對2個(gè)不同品種肉兔TLR4的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了檢測，以期為進(jìn)一步的關(guān)聯(lián)分析和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究提供理想的候選基因。檢測到的3個(gè)SNPs還將為繪制遺傳連鎖圖和疾病關(guān)聯(lián)分析提供有用的遺傳標(biāo)記。同時(shí)這些非同義SNPs也是下一步進(jìn)行疾病關(guān)聯(lián)分析的重要候選標(biāo)記。

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