張瀅瀅 韓 冬 陳 瀟 陽 歡 李冠樺 曾 琳 汪遠(yuǎn)華 方靖琴 王建民 李 陶

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指非心臟疾病引起彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，可導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全或呼吸衰竭，是臨床常見的危重癥之一，具有起病急、發(fā)展快、病死率高等特點(diǎn)，易導(dǎo)致患者預(yù)后不良［1］。以往臨床診斷ALI 主要依靠X 線、CT等，存在重復(fù)性差、耗時(shí)長、不適用于床旁等局限，而肺超聲憑借便捷、動(dòng)態(tài)、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，在ALI 的臨床診療中發(fā)揮越來越重要的作用。油酸致肺損傷動(dòng)物模型在病因上能較好地模擬嚴(yán)重創(chuàng)傷、多發(fā)性骨折、脂肪栓塞等所致ALI 的病理生理過程，被廣泛應(yīng)用于肺損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，但以往研究［2］多關(guān)注油酸致肺損傷小型動(dòng)物模型的評估、致傷病理及監(jiān)測手段，而對大型動(dòng)物模型的研究較少?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以與人體構(gòu)造更為相似的大型哺乳動(dòng)物山羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)對象，構(gòu)建油酸誘導(dǎo)的山羊ALI 模型，采用四分區(qū)法進(jìn)行肺超聲檢查并獲得肺超聲評分（lung ultrasound score，LUS），旨在探討其對山羊ALI的診斷價(jià)值。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性山羊16 只，體質(zhì)量17～27 kg，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。納入標(biāo)準(zhǔn)：一般情況良好，致傷前全肺LUS為0分。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在基礎(chǔ)疾病，一般情況差，致傷前全肺LUS≥1 分。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：AMUWEC20202140）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.分組及模型構(gòu)建：將山羊禁食、禁水8 h后稱重，按照隨機(jī)數(shù)表法分為輕傷組和重傷組，每組各8只。兩組體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。參考既往研究［3-5］關(guān)于油酸致肺損傷小動(dòng)物模型及本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，輕傷組經(jīng)耳緣靜脈注射劑量為0.05 ml/kg 分析純油酸（上海麥克林生化科技股份有限公司），于30 min內(nèi)分3 次完成注射；重傷組經(jīng)耳緣靜脈注射劑量為0.10 ml/kg 分析純油酸，于30 min 內(nèi)分4 次完成注射。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)山羊解剖后肺病理分析及肺濕干比作為ALI輕、重傷模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)。

2.肺超聲檢查：使用邁瑞M9便攜式彩色多普勒超聲診斷儀，C5-1s 凸陣探頭，頻率5.0 MHz。經(jīng)山羊耳緣靜脈注射丙泊酚（西安力邦制藥有限公司）10 ml短效麻醉，然后將山羊固定于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臺(tái)，胸部備皮。檢查左肺時(shí)山羊取右側(cè)臥位，檢查右肺時(shí)取左側(cè)臥位。采用四分區(qū)法［3］，以雙側(cè)胸壁第5 肋為界分為左上、左下、右上、右下4 個(gè)肺區(qū)；于致傷前及致傷后1 h、3 h、6 h 沿肋間隙涂抹耦合劑（重慶安碧捷科技股份有限公司）后依次連續(xù)性滑動(dòng)掃查各肺區(qū)，盡量避開肋骨遮擋，確保無漏診區(qū)域，記錄各肋間彗星尾征（B 線）數(shù)目并參照LUS 標(biāo)準(zhǔn)［6］進(jìn)行評分。具體為：0 分，未發(fā)現(xiàn)B 線；1 分，見單根或數(shù)根B 線，獨(dú)立或相互融合，總面積＜檢查區(qū)域1/2；2 分，見數(shù)根B 線，獨(dú)立或相互融合，總面積＞檢查區(qū)域1/2。見圖1。各肋間評分之和為該肺區(qū)LUS，4個(gè)肺區(qū)LUS之和為全肺LUS。

圖1 山羊檢查體位及LUS示意圖

3.血?dú)夥治鰴z測：于致傷前及致傷后1 h、3 h、6 h使用一次性動(dòng)脈血?dú)忉槻杉窖蛴蚁轮蓜?dòng)脈血約1 ml，使用手持式i-STAT 動(dòng)脈血?dú)鈾z測儀（美國雅培公司）進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)鈾z測，記錄氧分壓（PaO2）、氧飽和度（SaO2）及氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）。

4.炎癥因子檢測：于致傷前及致傷后1 h、3 h、6 h使用一次性靜脈采血針采集山羊頸內(nèi)靜脈血約20 ml，置入促凝采血管中，使用TDZ4-WS 低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）室溫下以4000 r/min 離心10 min，取上清液送至我院檢驗(yàn)科檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。

5.病理組織學(xué)檢測：致傷后6 h完成各項(xiàng)檢測后處死山羊，取出山羊肺臟，由我院武器殺傷生物效應(yīng)評估研究室1名中級實(shí)驗(yàn)師（不了解實(shí)驗(yàn)分組情況）對肺臟大體損傷情況進(jìn)行判定，并提取雙肺上、下部組織各1 塊（提取位置固定），置于10%中性福爾馬林標(biāo)本固定液（重慶博藝化學(xué)試劑公司）中固定。將標(biāo)本送至病理科，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋，制作成厚4 nm 切片，進(jìn)行HE 染色。參照Mikawa 等［7］方法進(jìn)行病理損傷評分，具體為：將組織切片通過KF-PRO-005 數(shù)字病理掃描系統(tǒng)（寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司）掃描入電腦保存，并應(yīng)用K-Viewer 軟件（1.7.0.17）進(jìn)行觀察，每個(gè)肺區(qū)隨機(jī)選取8 個(gè)視野，分別于100 倍和400 倍鏡下觀察山羊肺損傷情況并進(jìn)行評分（表1），100倍鏡下各指標(biāo)評分之和為該視野評分，取8個(gè)視野評分平均值為該肺區(qū)病理損傷評分，4 個(gè)肺區(qū)評分之和為全肺病理損傷評分。稱取肺濕重，然后將其放入DHG-9070A 鼓風(fēng)干燥箱（上海鴻都電子科技有限公司）烘烤（溫度80℃，每日烘烤12 h，連續(xù)烘烤7 d）后稱取肺干重，計(jì)算肺濕重與肺干重比值即為肺濕干比。

表1 肺病理損傷評分標(biāo)準(zhǔn)

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，采用非配對t檢驗(yàn)或雙因素方差分析、Sidak 多重檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（Q1，Q3）表示，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析致傷后1 h、3 h、6 h全肺及各肺區(qū)LUS 預(yù)測山羊ALI 嚴(yán)重程度的診斷價(jià)值；曲線下面積（AUC）比較采用Z檢驗(yàn)。采用線性回歸法分析全肺及各肺區(qū)LUS 與肺濕干比、病理損傷評分的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

16 只山羊均經(jīng)耳緣靜脈注射分析純油酸，其中1 只（輕傷組）于致傷后5 h 死亡，解剖發(fā)現(xiàn)死因?yàn)槲竷?nèi)容物反流誤吸；其余15 只均建模成功并完成實(shí)驗(yàn)。

一、肺超聲檢查結(jié)果

15 只山羊致傷前肺超聲檢查均未發(fā)現(xiàn)B 線，LUS均為0分；致傷后，全肺LUS隨著時(shí)間增加呈逐漸上升趨勢。重傷組致傷后1 h、3 h、6 h 全肺LUS 分別為（10.00±4.14）分、（19.63±6.07）分、（24.38±4.90）分，均高于輕傷組［（3.43±3.64）分、（10.00±3.83）分、（13.29±5.47）分］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖2。

圖2 輕、重傷組致傷前后各時(shí)間點(diǎn)全肺LUS 變化趨勢圖（與輕傷組比較，*P＜0.05，***P＜0.001，****P＜0.000 1）

分區(qū)LUS 比較結(jié)果顯示，兩組致傷后1 h、3 h、6 h右下肺LUS 比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；其余3個(gè)肺區(qū)LUS 比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。輕傷組致傷后同一時(shí)間點(diǎn)左上肺與左下肺、右上肺與右下肺LUS比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；重傷組致傷后6 h左下肺LUS 高于左上肺，致傷后3 h、6 h右下肺LUS 均高于右上肺，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 兩組各時(shí)間點(diǎn)各肺區(qū)LUS比較 分

二、ROC曲線分析

ROC 曲線分析顯示，致傷后1 h、3 h、6 h 全肺LUS預(yù)測ALI 嚴(yán)重程度的AUC 均＞0.8；各時(shí)間點(diǎn)右下肺LUS 預(yù)測ALI 嚴(yán)重程度的AUC 均＞0.9，其中致傷后1 h右下肺LUS 的預(yù)測效能最高（AUC=0.938）；不同時(shí)間點(diǎn)同一肺區(qū)LUS 的AUC 比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3和表3。

表3 致傷后各時(shí)間點(diǎn)全肺及各肺區(qū)LUS預(yù)測ALI嚴(yán)重程度的效能

圖3 致傷后各時(shí)間點(diǎn)全肺及各肺區(qū)LUS預(yù)測ALI嚴(yán)重程度的ROC曲線圖

三、血?dú)夥治黾把装Y因子檢測結(jié)果

重傷組致傷后3 h、6 h PaO2、SaO2、PaO2/FiO2均低于輕傷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。致傷后TNF-α 隨著時(shí)間增加呈逐漸上升趨勢，但兩組致傷后各時(shí)間點(diǎn)與致傷前、輕傷組與重傷組各時(shí)間點(diǎn)TNF-α比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 兩組各時(shí)間點(diǎn)血?dú)夥治鲋笜?biāo)及炎癥因子比較

四、病理組織學(xué)檢查結(jié)果

肺大體觀察顯示，輕傷組表現(xiàn)為以散在點(diǎn)狀出血為主，重傷組表現(xiàn)為全肺彌漫性出血，以雙肺下葉為著（圖4A、B）。重傷組肺濕干比高于輕傷組（7.36±0.97 vs.5.86±0.50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 兩組山羊肺大體圖及病理圖（HE染色，×100）

組織學(xué)病理分析顯示，與輕傷組比較，重傷組肺出血區(qū)域明顯增加，肺泡間隔明顯增厚且充血嚴(yán)重，肺泡間隔中觀察到更多的中性粒細(xì)胞聚集（圖4C、D）。重傷組全肺病理損傷評分高于輕傷組［（17.63±3.15）分vs.（13.86±4.07）分］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。兩組間各肺區(qū)病理損傷評分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；重傷組左下肺病理損傷評分高于左上肺、右下肺病理損傷評分高于右上肺，輕傷組右下肺病理損傷評分高于右上肺，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；兩組內(nèi)左下肺與右下肺、左上肺與右上肺病理損傷評分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

表5 兩組全肺及各肺區(qū)病理損傷評分比較 分

五、肺超聲與肺濕干比及病理損傷的關(guān)系

肺超聲檢查結(jié)果與肺大體損傷及病理組織學(xué)損傷部位相符。對于重度肺損傷，病理組織學(xué)顯示肺出血明顯，肺泡間隔明顯增厚且充血嚴(yán)重，肺超聲檢查可見數(shù)根獨(dú)立或相互融合的B 線，LUS 較高；而輕度肺損傷則相反，病理組織學(xué)顯示肺出血較輕，肺泡間隔增厚和充血不明顯，肺超聲檢查可見少量B 線，LUS較低。

相關(guān)性分析顯示，致傷后6 h 全肺、左下肺、右上肺及右下肺LUS 均與肺濕干比呈正相關(guān)（r=0.641、0.498、0.495、0.634，均P＜0.05），尤以右下肺的相關(guān)性最高；左上肺LUS 與肺濕干比無相關(guān)性。致傷后6 h全肺、左下肺及右下肺LUS 均與病理損傷評分呈正相關(guān)（r=0.754、0.571、0.624，均P＜0.05），尤以右下肺的相關(guān)性最高；左上肺、右上肺LUS 均與病理損傷評分無相關(guān)性。見表6。

表6 致傷后6 h全肺及各肺區(qū)LUS與肺濕干比、病理損傷評分的相關(guān)性分析

討 論

ALI 作為一種臨床危重癥，患者死亡率較高（約40%），當(dāng)病情達(dá)到一定程度時(shí)可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征，導(dǎo)致患者死亡率進(jìn)一步升高［8］。新型冠狀病毒肺炎疫情發(fā)生以來，在患者“從普通呼吸道癥狀進(jìn)展為ALI，并轉(zhuǎn)入重癥加強(qiáng)護(hù)理病房進(jìn)一步治療，甚至死亡”的疾病轉(zhuǎn)歸模式下，公眾再度關(guān)注到ALI的危害性。目前臨床診斷ALI 常規(guī)依據(jù)胸部X 線或CT 表現(xiàn)同時(shí)結(jié)合PaO2/FiO2、呼氣末正壓，但X 線或CT 檢查存在操作不便捷、有放射性等局限，不能滿足臨床快速診斷及動(dòng)態(tài)評估的需求。肺超聲作為一種非侵入性的影像學(xué)檢查方法，具有操作便捷、可床旁實(shí)時(shí)監(jiān)測、重復(fù)性好等優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。2016 年修正的柏林定義［9］提議將“肺超聲提示雙側(cè)B 線和/或肺實(shí)變，且無伴發(fā)積液”作為胸部X 線診斷ALI的替代手段，也有學(xué)者［10］預(yù)測超聲將可能正式納入新的ALI 診斷標(biāo)準(zhǔn)。既往研究［11-12］顯示LUS 能準(zhǔn)確預(yù)測ALI 嚴(yán)重程度，與CT具有相似的診斷效能。但肺超聲檢查依賴操作者經(jīng)驗(yàn)和水平、主觀性較強(qiáng)，在診斷ALI時(shí)存在檢查方法、評分標(biāo)準(zhǔn)未統(tǒng)一的問題［13］，且難以提供具體病因診斷，需結(jié)合其他臨床和影像學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合分析。本實(shí)驗(yàn)通過注射不同劑量油酸構(gòu)建山羊ALI輕、重傷模型，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)山羊致傷后下肺無論是大體觀察還是組織病理分析，其損傷程度均較上肺更嚴(yán)重，表明山羊肺損傷程度的不均一性。

目前肺超聲檢查常用的分區(qū)方法包括前胸部四分區(qū)法、八分區(qū)法、經(jīng)典十二分區(qū)法、二十八分區(qū)法等，均存在一定的優(yōu)缺點(diǎn)［14-16］。有學(xué)者［17］認(rèn)為肺超聲評估的區(qū)域越多，觀察到的肺部面積越大，獲得的LUS則更準(zhǔn)確；也有研究［18］發(fā)現(xiàn)簡化分區(qū)法同樣能反映危重癥患者肺損傷程度，且更便捷。本實(shí)驗(yàn)研究對象為山羊，其胸部特點(diǎn)雖與人體結(jié)構(gòu)相似，但又有所不同，更類似于人類的“雞胸”結(jié)構(gòu)。故本實(shí)驗(yàn)采用四分區(qū)法，將山羊肺臟分為右上、右下、左上及左下4個(gè)區(qū)域，并通過計(jì)數(shù)B 線的方法進(jìn)行評分，結(jié)果顯示15 只山羊致傷前肺超聲檢查均未發(fā)現(xiàn)B 線，全肺LUS 均為0 分；致傷后1 h，全肺LUS 均升高，且隨著時(shí)間增加呈逐漸上升趨勢，體現(xiàn)了山羊致傷后肺臟病理發(fā)展過程；重傷組在致傷后各時(shí)間點(diǎn)全肺LUS 均高于輕傷組（均P＜0.05），且隨著時(shí)間增加差異逐漸增大，與既往研究［11-12］結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)肺超聲檢查結(jié)果與肺大體損傷及病理組織學(xué)損傷部位相符；LUS比較結(jié)果顯示，輕傷組與重傷組致傷后各時(shí)間點(diǎn)僅右下肺LUS 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；重傷組致傷后6 h 左下肺LUS 高于左上肺，致傷后3 h、6 h 右下肺LUS 高于右上肺，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），表明致傷后不同肺區(qū)LUS 并不均衡，下肺LUS 均高于上肺，與Mento 等［16］、Castelao 等［19］及鐘海蓮等［20］研究結(jié)果相符。分析原因?yàn)椋悍纬晥D像中B 線的出現(xiàn)是由于肺微血管內(nèi)皮屏障和肺泡上皮屏障被破壞，導(dǎo)致富含蛋白質(zhì)的肺泡水腫液在肺泡和肺間質(zhì)中不斷積累［21］，而重力因素可能導(dǎo)致水腫液趨向于下肺，從而引起下肺B 線數(shù)量增加，故下肺LUS 更高。相關(guān)性分析顯示致傷后6 h全肺、左下肺、右上肺及右下肺LUS均與肺濕干比呈正相關(guān)（均P＜0.05），全肺、左下肺及右下肺LUS均與肺病理損傷評分呈正相關(guān)（均P＜0.05）；ROC 曲線分析顯示，致傷后各時(shí)間點(diǎn)全肺LUS 預(yù)測ALI 嚴(yán)重程度的AUC均＞0.8，表現(xiàn)出較好的診斷效能，其中致傷后1 h右下肺LUS 的預(yù)測效能最高（AUC=0.938），提示LUS可作為預(yù)測ALI 嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，且右下肺LUS的預(yù)測效能較全肺更高，能更早地反映肺損傷程度和變化，故右下肺可作為早期評估ALI 病情嚴(yán)重程度的首選檢查部位。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組致傷后PaO2、SaO2、PaO2/FiO2均有所下降，且重傷組致傷后3 h、6 h 各血?dú)夥治鲋笜?biāo)均低于輕傷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），符合ALI 的病理生理學(xué)變化，進(jìn)一步證實(shí)建模成功。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，各血?dú)夥治鲋笜?biāo)降低出現(xiàn)時(shí)間晚于LUS 變化，與郭雪芹等［3］研究結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)炎癥因子TNF-α 致傷后雖隨著時(shí)間增加呈上升趨勢，但與致傷前比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，輕、重傷組間該指標(biāo)比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析其原因可能為：致傷后TNF-α 變化趨勢較慢，其水平可能尚未達(dá)峰，且ALI是一種復(fù)雜的肺部炎癥疾病，其發(fā)生和進(jìn)展受多種因素的影響，而TNF-α 僅為其中一種炎癥介質(zhì)，其水平可能受其他炎癥因子的調(diào)節(jié)和相互作用影響。后續(xù)研究中將增加炎癥因子指標(biāo)，分析ALI相關(guān)炎癥因子與LUS 可能存在的相關(guān)性，同時(shí)對重癥加強(qiáng)護(hù)理病房中ALI 患者行分區(qū)肺超聲檢查，對本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步行臨床驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)的局限性：①山羊?qū)儆诖笮筒溉閯?dòng)物，考慮到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理問題，納入樣本量較?。虎贚US、病理損傷評分受研究者主觀影響結(jié)果可能產(chǎn)生偏倚；③由于山羊胸部結(jié)構(gòu)與人體存在差異，本實(shí)驗(yàn)結(jié)論尚需臨床進(jìn)一步驗(yàn)證；④本實(shí)驗(yàn)通過四分區(qū)法發(fā)現(xiàn)右下肺可作為早期評估ALI 病情嚴(yán)重程度的首選檢查部位，雖然加快了檢查速度、提高了檢診效率，但由于檢查范圍相對較小，可能存在漏診，且本實(shí)驗(yàn)僅分析了LUS的診斷效能，未能將其他檢查指標(biāo)共同納入分析，考慮到肺超聲檢查本身存在不足，其結(jié)果準(zhǔn)確性需在今后研究和臨床實(shí)踐中進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功建立了油酸誘導(dǎo)的山羊ALI 模型，結(jié)果表明應(yīng)用LUS 可準(zhǔn)確評估山羊ALI 早期嚴(yán)重程度和變化，具有一定的診斷價(jià)值；不同肺區(qū)LUS 存在差異，其中右下肺LUS 與其嚴(yán)重程度的相關(guān)性最高。