展立芬 卓 越 艾 坤 曾學(xué)究 梁柔筠 丁強(qiáng)盛 胡曉妹 劉 熹 張 泓

神經(jīng)源性膀胱（neurogenic bladder，NB）是脊髓遭受外傷、車禍及物理打擊等外源性傷害和炎癥、水腫等內(nèi)源性損傷后最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，同時(shí)也是臨床治療的難點(diǎn)和熱點(diǎn)［1］。隨著疾病的進(jìn)展，患者膀胱長(zhǎng)期的病理改變可使雙腎功能受到不同程度損傷，最終導(dǎo)致腎衰竭，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全。研究［2］表明NB 患者的膀胱超聲表現(xiàn)具有一定特征，且與脊髓損傷相關(guān)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究［3-4］表明，NB 大鼠膀胱順應(yīng)性下降，且出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化。目前NB 大鼠模型建立成功的依據(jù)主要為尿流動(dòng)力學(xué)改變。基于此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用超聲觀察NB大鼠膀胱形態(tài)學(xué)改變，并分析其與尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性，旨在探討超聲評(píng)估NB 大鼠膀胱功能的應(yīng)用價(jià)值。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器及試劑

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF 級(jí)SD 大鼠27 只（根據(jù)前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中72%模型建立成功率［3］和樣本量估算［5］得出），均購(gòu)自湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［許可證號(hào)：SYXK（湘）2019-0004］，體質(zhì)量（200±20）g，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由飲水與攝食，參照GB 14925-2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 環(huán)境及設(shè)施》和GB 5749-2022《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》配備大鼠的生存環(huán)境及飼養(yǎng)條件；飼養(yǎng)環(huán)境溫度24～26℃，濕度50%～70%，背景噪音30～50 dB、光-暗周期12 h。所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遵照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》［6］對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行處置，所有操作均經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫審號(hào)：LL2021091504）。

2.主要實(shí)驗(yàn)儀器：F3導(dǎo)尿管（150301J，上海上醫(yī)康鴿醫(yī)用器材有限責(zé)任公司）；15 道生理記錄儀（MP150-WSW，美國(guó)BIOPAC 公司）；彩色多普勒超聲診斷儀（EZU-MT28-S1，日本日立公司），凸陣探頭，頻率3.5～10.0 MHz。

3.主要實(shí)驗(yàn)試劑：戊巴比妥鈉、醋酸鈉林格溶液（江蘇恒豐強(qiáng)生物技術(shù)有限公司）；青霉素鈉（哈藥集團(tuán)制藥總廠）；耦合劑（江蘇省醫(yī)療器械有限公司）。

二、實(shí)驗(yàn)分組及模型建立

1.分組：將27 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)表法分為空白對(duì)照組8 只、假手術(shù)組8 只和模型組11 只。其中空白對(duì)照組未進(jìn)行任何處理，正常飼養(yǎng)；假手術(shù)組暴露皮膚、筋膜與肌肉，待暴露脊髓后依次縫合并予抗感染處理；模型組采用手術(shù)建立脊髓橫斷損傷后NB 大鼠模型。

2.建模方法：以改良Hassan Shaker 脊髓全斷法為基礎(chǔ)，結(jié)合本團(tuán)隊(duì)前期研究［7］改良的方法進(jìn)行T8 節(jié)段脊髓完全性橫斷損傷。具體為：術(shù)前2 d 稱重大鼠后經(jīng)腹腔注射青霉素鈉（配置20 萬(wàn)U，每只每次注射0.35 ml）預(yù)防感染，術(shù)前1 d禁食不禁水。腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，消毒備皮后沿大鼠背部正中線以T8～T9為中心做一長(zhǎng)約2～3 cm縱向切口，依次切開(kāi)皮膚、皮下筋膜，鈍性分離兩側(cè)肌肉，暴露T8、T9棘突及其相鄰椎弓，直至脊髓充分暴露，然后采用牙科鉤將椎間隙中的脊髓勾起，用手術(shù)刀沿牙科鉤平口快速切斷脊髓，并反復(fù)勾刮以保證無(wú)神經(jīng)纖維殘留。觀察大鼠的心跳和呼吸無(wú)異常后，于肌肉筋膜皮膚創(chuàng)緣撒下少量青霉素干粉（廣州白云山天心制藥股份有限公司），然后逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚，采用5%絡(luò)合碘消毒切口及周圍，確認(rèn)創(chuàng)口無(wú)活動(dòng)性出血后將大鼠以頭尾四肢伸展位俯臥平放于電熱毯上復(fù)溫，等待其蘇醒。術(shù)后喂養(yǎng)：每籠2只大鼠，定時(shí)護(hù)理及手法排尿，限時(shí)限量喂水，每8 h（7∶00、15∶00、22∶00）給水1次，每次水量10 ml，皮下注射醋酸鈉林格溶液（10 ml/kg）預(yù)防酸堿失衡和電解質(zhì)紊亂，腹腔注射青霉素鈉（用法同前）抗感染。

3.成模及剔除標(biāo)準(zhǔn)：①成模標(biāo)準(zhǔn)為造模后大鼠后肢完全癱瘓，僅能以前肢拖動(dòng)身體，并出現(xiàn)膀胱排尿障礙（即造模后大鼠立即進(jìn)入脊髓休克期，膀胱脹大明顯，表現(xiàn)為逼尿肌無(wú)反應(yīng)性尿潴留；待大鼠膀胱儲(chǔ)尿功能明顯下降，膀胱不再脹大，表現(xiàn)為尿潴留；當(dāng)大鼠膀胱逼尿肌產(chǎn)生無(wú)抑制性收縮，下腹部及籠內(nèi)墊料保持經(jīng)常性潮濕），尿流動(dòng)力學(xué)檢查示大鼠膀胱最大容量降低，膀胱壓力（如基礎(chǔ)壓、漏尿點(diǎn)壓力）升高，膀胱順應(yīng)性明顯降低，即為逼尿肌-括約肌協(xié)同失調(diào)型膀胱，提示造模成功［7］。②剔除標(biāo)準(zhǔn)為造模后大鼠若出現(xiàn)雙后肢自主運(yùn)動(dòng)，休克期后尿潴留或自主排尿、自噬或死亡。

三、觀測(cè)指標(biāo)

1.一般情況觀察：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察各組大鼠活動(dòng)、食量、水量、排尿、排便、自噬和死亡等情況，記錄模型組大鼠尿量、糞便量。

2.膀胱超聲檢查：根據(jù)前期研究［7］證實(shí)脊髓損傷后NB 大鼠的成模時(shí)間為手術(shù)后18 d，本實(shí)驗(yàn)各組大鼠于建模后第19 天行膀胱超聲檢查。檢查當(dāng)日上午8 點(diǎn)采用手法排尿，結(jié)束后禁水，下午1 點(diǎn)進(jìn)行超聲檢查。受檢大鼠經(jīng)乙氟烷呼吸麻醉成功后行腹部剃毛，充分暴露腹部并均勻涂抹耦合劑，將超聲探頭置于大鼠恥骨區(qū)域，采集膀胱縱切面和橫切面圖像，分別測(cè)量膀胱左右徑、前后徑、上下徑及膀胱壁厚度，計(jì)算膀胱容積（膀胱容積=左右徑×前后徑×上下徑×0.75）。然后檢查者輕壓探頭，觀察并記錄恥骨上區(qū)域的膀胱充盈和排空狀態(tài)［8］。以上檢查均由同一具有中級(jí)職稱的超聲醫(yī)師完成。

3.尿流動(dòng)力學(xué)檢查：各組大鼠于超聲檢查結(jié)束后進(jìn)行尿流動(dòng)力學(xué)檢查，各組平行交替進(jìn)行，記錄膀胱壓力曲線。采用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）經(jīng)腹腔注射麻醉成功后將大鼠固定，用三通管連接15道生理記錄儀、微量灌注泵及F3 導(dǎo)尿管并排空管道內(nèi)空氣，注入生理鹽水充盈管道，排空大鼠膀胱后于膀胱頂部開(kāi)一瘺口，將F3 導(dǎo)尿管插入膀胱，然后用手術(shù)縫線固定導(dǎo)管和膀胱肌肉，以0.6 ml/min速率［9］注入常溫生理鹽水。記錄注入相同容積生理鹽水情況下膀胱容積和膀胱壓力的變化，包括：①膀胱基礎(chǔ)壓力，即導(dǎo)管置入膀胱后的初始?jí)毫χ?；②膀胱最大壓力，即全過(guò)程中膀胱壓力的峰值；③膀胱最大容量，即尿道口首次流出液體時(shí)的灌注容積；④灌注時(shí)間，即尿道口首次流出液體時(shí)的灌注時(shí)間；⑤漏尿點(diǎn)壓力，即尿道口首次流出液體時(shí)的膀胱壓力值。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)膀胱容積與膀胱壓力變化的比值觀察膀胱順應(yīng)性。

4.病理組織學(xué)檢查：超聲檢查和尿流動(dòng)力學(xué)檢查結(jié)束后，各組分別選6只大鼠處死后取膀胱組織，于冰上剪取大小為0.5 cm×0.5 cm 的組織塊，采用4%多聚甲醛固定48 h，乙醇梯度脫水、浸蠟并包埋，連續(xù)切片（厚約3 μm），每個(gè)樣本選4張行HE染色，然后于100倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0 和GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析法分析各組大鼠膀胱超聲指標(biāo)與尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組大鼠一般情況

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M剔除3只造模失敗大鼠，8只造模成功大鼠納入研究，術(shù)后各項(xiàng)體征逐步穩(wěn)定。假手術(shù)組大鼠無(wú)死亡且傷口基本恢復(fù)，其活動(dòng)、進(jìn)食、飲水、排尿及排便等與空白對(duì)照組基本一致。與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠食量減少，體質(zhì)量下降，活動(dòng)量減少，毛色灰暗。

二、各組超聲檢查結(jié)果比較

1.空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠膀胱均呈扁平狀圓形無(wú)回聲，膀胱周圍組織呈高回聲；模型組大鼠膀胱呈橢圓形無(wú)回聲，膀胱周圍組織呈高回聲，且膀胱呈過(guò)度充盈狀態(tài)及排尿后尿潴留，其中1只大鼠膀胱內(nèi)可見(jiàn)絮狀物。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠膀胱超聲圖

2.各組膀胱上下徑、左右徑、前后徑、容積及膀胱壁厚度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組膀胱上下徑、左右徑及前后徑、膀胱壁厚度均增加，膀胱容積增大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；空白對(duì)照組與假手術(shù)組各超聲指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1和圖2。

表1 各組大鼠膀胱超聲指標(biāo)比較（）

表1 各組大鼠膀胱超聲指標(biāo)比較（）

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，#P＜0.05

圖2 各組大鼠膀胱壁厚度測(cè)量圖

三、各組尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

各組尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠膀胱最大壓力升高，膀胱最大容量增加，灌注時(shí)間延長(zhǎng)，漏尿點(diǎn)壓力升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）?？瞻讓?duì)照組與假手術(shù)組各尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 各組尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（）

表2 各組尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（）

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，#P＜0.05。1 cmH2O=0.098 kPa

四、各組病理組織學(xué)檢查結(jié)果比較

空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠膀胱組織中移行上皮細(xì)胞排列緊密整齊，細(xì)胞固有膜完整，未見(jiàn)炎性浸潤(rùn)及組織水腫樣改變，逼尿肌層肌纖維束排列整齊、組織結(jié)構(gòu)緊密，肌纖維無(wú)增生及纖維化改變；模型組大鼠膀胱組織中移行上皮細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞固有膜結(jié)構(gòu)疏松破壞，可見(jiàn)組織水腫及出血性改變，肌纖維排列紊亂，伴局部纖維結(jié)締組織增生。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠膀胱組織病理圖（HE染色，×100）

五、相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，各組大鼠膀胱壁厚度與膀胱最大壓力、膀胱最大容量、灌注時(shí)間和漏尿點(diǎn)壓力均呈線性相關(guān)（均P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 膀胱超聲指標(biāo)與尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析

討 論

NB是脊髓損傷后常見(jiàn)且嚴(yán)重的并發(fā)癥，患者的主要臨床癥狀為排尿困難及尿潴留［10］，可對(duì)腎臟造成損傷，甚至引起腎衰竭，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全［11］?；謴?fù)膀胱功能是改善脊髓損傷患者生活質(zhì)量的首要目標(biāo)［12］，《神經(jīng)源性膀胱護(hù)理實(shí)踐指南（2017 版）》［13］強(qiáng)調(diào)應(yīng)將膀胱功能測(cè)定作為評(píng)估脊髓損傷程度及其治療效果的輔助手段。臨床評(píng)估NB 患者膀胱功能的常用手段為尿流動(dòng)力學(xué)檢查［14］、排尿日記［15］和下尿路功能評(píng)定［16］。尿流動(dòng)力學(xué)檢查可以觀察患者充盈期逼尿肌壓力、膀胱順應(yīng)性、最大尿流率和殘余尿量；排尿日記通過(guò)記錄排尿次數(shù)、單次排尿量、漏尿事件次數(shù)來(lái)評(píng)估排尿情況；下尿路功能評(píng)定可通過(guò)國(guó)際下尿路癥狀評(píng)分對(duì)患者癥狀進(jìn)行評(píng)價(jià)。上述方法均可反映患者膀胱功能，但缺乏可視化資料。超聲具有非侵入性、便捷、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前臨床腎臟、輸尿管和膀胱疾病的常用檢查方法，具有良好的診斷敏感性，可以直觀地反映膀胱狀態(tài)，提供可視化資料，輔助臨床醫(yī)師進(jìn)行診斷及評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析NB 大鼠的膀胱超聲表現(xiàn)及其與尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性，旨在探討超聲評(píng)估NB 大鼠膀胱功能的應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠的T8 脊髓節(jié)段進(jìn)行完全性橫斷后成功制備NB 大鼠模型。與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，建模后第19 天模型組大鼠食量減少，體質(zhì)量下降，活動(dòng)量減少，毛色灰暗；尿流動(dòng)力學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)模型組大鼠膀胱最大容量、膀胱最大壓力、灌注時(shí)間和漏尿點(diǎn)壓力均較空白對(duì)照組和假手術(shù)組增加（均P＜0.05）；病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)模型組大鼠膀胱逼尿肌組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，膀胱肌層和膀胱壁黏膜層明顯增加；膀胱超聲檢查也發(fā)現(xiàn)模型組大鼠膀胱壁厚度、前后徑、左右徑、上下徑及膀胱容積均大于空白對(duì)照組和假手術(shù)組（均P＜0.05）。各種檢查結(jié)果均符合T8 節(jié)段脊髓完全性橫斷損傷后以膀胱增大和尿潴留為主的NB 表現(xiàn)，與本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究［17］結(jié)論一致。相關(guān)性分析顯示，膀胱壁厚度與膀胱最大壓力、膀胱最大容量、灌注時(shí)間和漏尿點(diǎn)壓力均呈線性相關(guān)（均P＜0.05），提示隨著膀胱壁逐漸增厚，膀胱最大壓力減小、漏尿點(diǎn)壓力升高、膀胱最大容量減小、灌注時(shí)間增加，符合NB的病變過(guò)程［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：①各組大鼠尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、病理組織學(xué)檢查結(jié)果和超聲影像資料間存在一致性；②為超聲評(píng)估NB 大鼠膀胱功能狀態(tài)奠定了基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠膀胱超聲圖像提示有結(jié)石樣改變，考慮與尿鈣排泄增多［18］、膀胱神經(jīng)肌肉功能障礙等因素有關(guān)［19］。與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠膀胱壁增厚，膀胱容積增大，推測(cè)可能為脊髓橫斷損傷后支配膀胱的神經(jīng)節(jié)段異常導(dǎo)致膀胱儲(chǔ)尿與排尿紊亂，膀胱壁肌肉代償性病變所致。病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，模型組大鼠膀胱組織病理改變明顯，與其膀胱功能異常相符合。超聲檢查簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、安全、可重復(fù)性好，可對(duì)不同階段NB 的膀胱狀態(tài)進(jìn)行可視化分析，且不影響膀胱功能，降低了尿反流到腎臟的風(fēng)險(xiǎn)和由此引起的感染擴(kuò)散。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用超聲觀察了脊髓橫斷損傷NB大鼠膀胱形態(tài)學(xué)變化，并發(fā)現(xiàn)膀胱壁厚度與尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)呈線性相關(guān)，提示通過(guò)可視化超聲影像資料與尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)可以共同反映膀胱功能。但本實(shí)驗(yàn)存在以下局限：①未比較干預(yù)治療前后膀胱超聲指標(biāo)變化情況；②未應(yīng)用超聲觀察大鼠自我恢復(fù)過(guò)程中膀胱變化。后續(xù)研究中本課題組將適當(dāng)延長(zhǎng)超聲檢查時(shí)間，深入探討超聲在評(píng)估干預(yù)治療前后膀胱功能變化中的應(yīng)用價(jià)值，并進(jìn)一步觀察膀胱組織超微結(jié)構(gòu)與膀胱超聲檢查結(jié)果的關(guān)系，為臨床應(yīng)用超聲評(píng)估膀胱功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和應(yīng)用依據(jù)。