李強(qiáng)虎,辛 勇

(1．徐州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇 徐州 221004;2．徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 徐州 221006)

臨床治療中,通過(guò)科學(xué)、足量的放療能夠有效控制食管癌進(jìn)展[1],但并非所有食管癌患者均對(duì)放療敏感,部分患者因?qū)Ψ暖熌褪芏斐芍委熓?其影響因素包括患者自身特征、腫瘤本身、放射劑量效應(yīng)關(guān)系等[2]。隨著近年來(lái)基因檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展,通過(guò)基因檢測(cè)預(yù)測(cè)食管癌患者對(duì)放療的敏感性,并制定個(gè)體化放療方案。相關(guān)研究[3]顯示,DNA損傷修復(fù)能力與放療敏感性密切相關(guān),DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因在其中發(fā)揮重要作用,其單核苷酸多態(tài)性(SNP)能夠改變DNA修復(fù)蛋白功能,進(jìn)而影響損傷修復(fù)能力。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶P1基因(GSTP1)、切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)在核苷酸修復(fù)中發(fā)揮重要作用[4]。為此,本研究主要探討GSTP1和ERCC1基因多態(tài)性與食管癌患者放療敏感性及預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年4月—2020年2月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的食管癌患者200例。其中,男144例,女56例;年齡61～75歲,平均(66.31±5.08)歲。根據(jù)放療結(jié)束后的療效將患者分為放療敏感組(完全緩解、部分緩解)、放療不敏感組(穩(wěn)定、進(jìn)展)。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),患者均自愿參與并簽署知情同意書。

入選標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)內(nèi)鏡檢查和病理檢查確診為食管癌;無(wú)放療禁忌證,接受多西他賽單藥化療和同期放療;完成3 a隨訪研究。

排除標(biāo)準(zhǔn):有重要器官功能異常或癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者;接受過(guò)手術(shù)治療、放療、化療的患者。

1.2 方 法

1.2.1 治療方案

食管癌患者放療方案:采取適形放射治療,總劑量為原發(fā)腫瘤靶區(qū)60 Gy,2 Gy/次,1次/d,5次/周,30次為1個(gè)療程。放療第1天開(kāi)始同期進(jìn)行化療,化療方案:多西他賽40 mg,1次/周,6次為1個(gè)療程,共2個(gè)療程。

1.2.2 療效評(píng)價(jià)

患者放療1個(gè)療程后,參照實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST1.1)判斷食管癌患者的療效,分為完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定、進(jìn)展。其中,完全緩解:靶病灶完全消失;部分緩解:靶病灶最大徑與治療前相比減少30%及以上;穩(wěn)定:處于部分緩解和進(jìn)展之間的狀態(tài);進(jìn)展:靶病灶最大徑與治療前相比增加20%及以上,或出現(xiàn)新發(fā)腫瘤病灶。將完全緩解、部分緩解納入放療敏感組,穩(wěn)定、進(jìn)展納入放療不敏感組。治療后對(duì)患者進(jìn)行3 a隨訪,利用電話、門診復(fù)查、住院復(fù)查等方式進(jìn)行,記錄患者生存情況。

1.2.3 GSTP1和ERCC1基因型檢測(cè)

采集患者外周靜脈血4 mL,放入EDTA抗凝管中4 ℃保存待測(cè),使用Qiagen全血基因組DNA提取試劑盒獲得基因組DNA。PCR擴(kuò)增引物由上海士鋒生物有限公司合成。GSTP1上游引物:5′-AAAGTCCCCTCTTTAAAC CGC-3′,下游引物:5′-CTGACTGATGGAGTACTTGTT-3′;ERCC1上游引物:5′-CCGTCATTAGGCGGTCGGAA-3′,下游引物:5′-CTCATGTAGTGGTCGTC GTAG-3′。PCR反應(yīng)體系20 μL,包括dNTP Master Mix 6 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA模板3 μL、雙蒸餾水9 μL。擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性1 min,95 ℃變性40 s,60 ℃復(fù)性1 min,共45個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min。檢測(cè)儀器自帶軟件收集熒光信號(hào)并分析得出SNP分型,同時(shí)將標(biāo)本送至基因科技(上海)股份有限公司進(jìn)行直接測(cè)序。

1.2.4 MBP-1、PTEN、Cyclin D1、PLCE1基因表達(dá)檢測(cè)

取適量的患者食管癌組織,加入RIPA蛋白裂解液充分研磨,將組織懸液以12 000 r/min 4 ℃恒溫離心15 min,收集上清液;應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定髓磷脂堿性蛋白1(MBP-1)、磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)、G1/S-特異性周期蛋白-D1(Cyclin D1)、磷脂酶Cε1(PLCE1)基因蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同性別、病理類型的食管癌患者GSTP1和ERCC1基因多態(tài)性分析

本研究結(jié)果顯示,200例食管癌患者中GSTP1基因攜帶野生型GG 115例,雜合型GA 61例,突變型AA 24例。ERCC1基因攜帶野生型CC 86例,雜合型CT 99例,突變型TT 15例。GSTP1和ERCC1基因SNP分布符合Hardy-Weinberg平衡,GSTP1和ERCC1基因各位點(diǎn)的基因型分布在不同性別、病理類型的食管癌患者間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同性別、病理類型的食管癌患者GSTP1和ERCC1基因多態(tài)性分析Tab.1 Analysis of GSTP1 and ERCC1 gene polymorphisms in esophageal cancer patients with different genders and pathological types

2.2 GSTP1和ERCC1基因型與食管癌患者放療后療效分析

本研究結(jié)果顯示,200例食管癌患者經(jīng)放療后敏感(完全緩解、部分緩解)119例納入放療敏感組,不敏感(穩(wěn)定、進(jìn)展)81例納入放療不敏感組。GSTP1基因攜帶雜合型GA和突變型AA的食管癌患者放療后完全緩解、部分緩解的比例明顯高于野生型GG的患者,穩(wěn)定、進(jìn)展的比例明顯低于野生型GG的患者(P<0.001)。ERCC1基因攜帶野生型CC的食管癌患者放療后完全緩解、部分緩解的比例明顯高于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者,穩(wěn)定、進(jìn)展的比例明顯低于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者(P<0.001)。見(jiàn)表2。

表2 GSTP1和ERCC1基因型與食管癌患者放療后療效分析Tab.2 GSTP1 and ERCC1 genotypes and efficacy of radiotherapy in esophageal cancer patients

2.3 GSTP1和ERCC1基因型與食管癌患者放療后生存時(shí)間的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示,GSTP1基因攜帶雜合型GA和突變型AA的食管癌患者放療后1 a生存率、2 a生存率、3 a生存率均明顯高于野生型GG的患者(P<0.05);ERCC1基因攜帶野生型CC的食管癌患者放療后1 a生存率、2 a生存率、3 a生存率均明顯高于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 GSTP1和ERCC1基因型與食管癌患者放療后生存時(shí)間的關(guān)系Tab.3 GSTP1 and ERCC1 genotypes and survival time after radiotherapy in esophageal cancer patients

2.4 不同放療敏感性的食管癌組織中增殖、凋亡相關(guān)基因表達(dá)

本研究結(jié)果顯示,放療不敏感組食管癌患者凋亡相關(guān)基因MBP-1、PTEN表達(dá)水平明顯低于放療敏感組食管癌患者,增殖相關(guān)基因Cyclin D1、PLCE1表達(dá)水平明顯高于放療敏感組食管癌患者(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同放療敏感性的食管癌組織中增殖、凋亡相關(guān)基因表達(dá)Tab.4 Expression of proliferation and apoptosis related genes in esophageal cancer tissues with different radiosensitivity

2.5 GSTP1和ERCC1基因型與食管癌組織中增殖、凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平的關(guān)系分析

本研究結(jié)果顯示,GSTP1基因攜帶雜合型GA和突變型AA的食管癌患者凋亡相關(guān)基因MBP-1、PTEN表達(dá)水平明顯高于野生型GG的患者,增殖相關(guān)基因Cyclin D1、PLCE1表達(dá)水平明顯低于野生型GG的患者(P<0.001)。ERCC1基因攜帶野生型CC的食管癌患者凋亡相關(guān)基因MBP-1、PTEN表達(dá)水平明顯高于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者,增殖相關(guān)基因Cyclin D1、PLCE1表達(dá)水平明顯低于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 GSTP1和ERCC1基因型與食管癌組織中增殖、凋亡相關(guān)基因的關(guān)系分析Tab.5 Analysis of relationship between GSTP1 and ERCC1 genotypes and expression levels of proliferation and apoptosis related genes in esophageal cancer tissue

3 討 論

放射生物學(xué)效應(yīng)主要是通過(guò)DNA改變來(lái)實(shí)現(xiàn)的,當(dāng)人體細(xì)胞在X線作用下會(huì)發(fā)生單鏈或雙鏈斷裂,其中雙鏈斷裂主要發(fā)生在對(duì)側(cè)互補(bǔ)堿基對(duì)或間隔區(qū)堿基對(duì)[5]。DNA雙鏈斷裂是目前公認(rèn)的電離輻射所致染色體損傷,主要修復(fù)方式為切除修復(fù)[6]。近年來(lái)研究[7]顯示,惡性腫瘤患者放療的療效差異可能與DNA損傷修復(fù)水平有關(guān)。在惡性腫瘤患者分次放療中,射線能夠?qū)NA造成累積性損傷,該損傷過(guò)程在多種DNA底物及修復(fù)酶的作用下持續(xù)被修復(fù),當(dāng)患者對(duì)放療中射線所致DNA損傷修復(fù)能力較強(qiáng)時(shí),表現(xiàn)為放療敏感性低[8]。GSTP1是從哺乳動(dòng)物中分離得到的影響細(xì)胞對(duì)電離輻射敏感性的基因,參與DNA的修復(fù)過(guò)程,其編碼蛋白無(wú)直接催化活性,但能夠在堿基切除修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮蛋白支架作用,與DNA連接酶作用后參與電離輻射所致的DNA修復(fù)和堿基損傷過(guò)程[9]。相關(guān)研究[10]顯示,GSTP1基因G28152A位點(diǎn)多態(tài)性能夠降低GSTP1基因的堿基切除活性,影響腫瘤細(xì)胞對(duì)放射性的敏感性。本研究對(duì)GSTP1基因G28152A位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,攜帶雜合型GA和突變型AA的食管癌患者放療后完全緩解的比例明顯高于野生型GG的患者,放化療后1 a生存率、2 a生存率、3 a生存率均明顯高于野生型GG的患者。提示食管癌患者中GSTP1基因攜帶雜合型GA和突變型AA的放療效果更好,生存率處于較高水平;檢測(cè)GSTP1基因SNP可作為食管癌患者放療敏感性的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一。

ERCC1編碼一種高度保守的單鏈DNA內(nèi)切酶,其表達(dá)產(chǎn)物與相應(yīng)的DNA切除修復(fù)酶通過(guò)互補(bǔ)基因相互結(jié)合而生成XPF-ERCC1核酸酶復(fù)合體,作為特異性核酸內(nèi)切酶,發(fā)揮損傷識(shí)別、切除DNA 5′端的雙重作用[11]。ERCC1基因C118T位點(diǎn)核苷酸C向T改變,會(huì)造成密碼子中AAC排列轉(zhuǎn)變?yōu)锳AT,雖然上述兩種核苷酸排列均編碼天門冬氨酸,但SNP會(huì)改進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[12]。相關(guān)研究[13]顯示,卵巢癌細(xì)胞中ERCC1基因第121位密碼子由C變異為T,造成ERCC1蛋白表達(dá)下調(diào)。目前,關(guān)于ERCC1基因多態(tài)性與食管癌放療療效的相關(guān)研究較少,為此,本研究對(duì)ERCC1基因C118T位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示:ERCC1基因攜帶野生型CC的食管癌患者放療后完全緩解的比例明顯高于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者,放療后1 a生存率、2 a生存率、3 a生存率均明顯高于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者。提示食管癌患者中ERCC1基因攜帶野生型CC的放療效果更好,生存率處于較高水平;檢測(cè)ERCC1基因SNP也可作為食管癌患者放療敏感性的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

放療能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,凋亡、增殖相關(guān)基因的表達(dá)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變[14]。食管癌病情發(fā)展過(guò)程中MBP-1、PTEN屬于凋亡相關(guān)基因,Cyclin D1、PLCE1屬于增殖相關(guān)基因[15]。其中MBP-1作為c-myc啟動(dòng)子結(jié)合蛋白,可抑制其生物學(xué)活性,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16];PTEN負(fù)調(diào)控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路,抑制該信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)[17]。Cyclin D1屬于細(xì)胞周期家族成員,具有高度保守性,其可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖[18]。PLCE1可通過(guò)誘導(dǎo)抑癌基因p53活化來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[19]。本研究結(jié)果顯示,放療不敏感組食管癌患者凋亡相關(guān)基因MBP-1、PTEN表達(dá)水平明顯低于放療敏感組食管癌患者,增殖相關(guān)基因Cyclin D1、PLCE1表達(dá)水平明顯高于放療敏感組食管癌患者,提示MBP-1、PTEN、Cyclin D1、PLCE1表達(dá)水平與食管癌放療敏感性密切相關(guān)。進(jìn)一步分析顯示,GSTP1基因攜帶雜合型GA和突變型AA的食管癌患者凋亡相關(guān)基因MBP-1、PTEN表達(dá)水平明顯高于野生型GG的患者,增殖相關(guān)基因Cyclin D1、PLCE1表達(dá)水平明顯低于野生型GG的患者。ERCC1基因攜帶野生型CC的食管癌患者凋亡相關(guān)基因MBP-1、PTEN表達(dá)水平明顯高于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者,增殖相關(guān)基因Cyclin D1、PLCE1表達(dá)水平明顯低于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者。說(shuō)明GSTP1基因攜帶雜合型GA和突變型AA,ERCC1基因攜帶野生型CC可能通過(guò)上調(diào)凋亡相關(guān)基因MBP-1、PTEN表達(dá),下調(diào)增殖相關(guān)基因Cyclin D1、PLCE1表達(dá)來(lái)發(fā)揮抑制食管癌病情發(fā)展的作用,具有較高的放療敏感性。

綜上所述,食管癌患者GSTP1和ERCC1基因SNP可作為放療敏感性的預(yù)測(cè)指標(biāo),其中GSTP1基因攜帶雜合型GA和突變型AA,ERCC1基因攜帶野生型CC的患者放療預(yù)后較好,可能與上調(diào)凋亡相關(guān)基因MBP-1、PTEN表達(dá),下調(diào)增殖相關(guān)基因Cyclin D1、PLCE1表達(dá)有關(guān)。