孫文君，吳基正，李元

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650202；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明 650202）

氮素被稱為“生命元素”[1]，在植物生命活動(dòng)中居首要地位[2]，占植物生長(zhǎng)所需礦質(zhì)元素的40%以上，是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。目前，環(huán)境中的氮大多來(lái)源于空氣中的N2，多數(shù)植物生長(zhǎng)可利用的氮形態(tài)主要為而這些氮形態(tài)能否被利用取決于不同的氮轉(zhuǎn)化效應(yīng)，包括豆科植物-根瘤菌共生體系的固氮作用[2]。生物固氮能將大氣中的分子態(tài)氮還原成氨，為植物提供氮素，可減少化肥的使用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)方面發(fā)揮著重要作用[3]。

紫花苜蓿（Medicago SativaL.）是豆科苜蓿屬深根性多年生牧草[4]，有產(chǎn)量高、品質(zhì)好、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，故有“牧草之王”的美稱[5]。紫花苜蓿與根瘤菌形成固氮能力較強(qiáng)的生物固氮體系，根瘤菌為紫花苜蓿提供氨，可調(diào)節(jié)整個(gè)細(xì)胞的代謝水平以適應(yīng)外界環(huán)境的脅迫，亦可通過(guò)外排、氧化或隔離等作用機(jī)制來(lái)解毒，使紫花苜蓿在重金屬污染區(qū)域正常生長(zhǎng)[6-8]。重金屬鎘（Cd）的生物毒性及化學(xué)活性較強(qiáng)，在生物體內(nèi)不參與酶促反應(yīng)與氮代謝過(guò)程，是生物生長(zhǎng)的非必需元素，其含量超標(biāo)會(huì)影響植物正常生長(zhǎng)和細(xì)胞代謝，從而降低農(nóng)作物的品質(zhì)與產(chǎn)量，嚴(yán)重影響土壤的生態(tài)環(huán)境，目前土壤Cd污染已引起了國(guó)內(nèi)外科研人員的廣泛關(guān)注[9-11]。有研究發(fā)現(xiàn)在礦區(qū)自然分布的紫花苜蓿對(duì)Cd 的耐受能力高于Cr、Zn、Cu 和Pb 幾種重金屬[10]。紫花苜蓿被認(rèn)為是修復(fù)Cd 污染土壤的理想作物[12]。但紫花苜蓿與根瘤菌的生物固氮過(guò)程極其復(fù)雜，易受到重金屬、寒、旱等環(huán)境因素的影響[13]，故探究紫花苜蓿根瘤菌氮代謝對(duì)Cd的響應(yīng)具有重要意義。

目前，對(duì)于Cd 脅迫下紫花苜蓿的生理生化和生長(zhǎng)特性已有較深入的研究，但關(guān)于接種根瘤菌后紫花苜蓿氮代謝對(duì)Cd響應(yīng)的研究較少。本研究通過(guò)研究接種根瘤菌后紫花苜蓿氮代謝酶活和氮素含量對(duì)Cd污染土壤的響應(yīng)，明確Cd 污染條件下紫花苜蓿接種根瘤菌的氮代謝機(jī)理，為Cd 污染土壤紫花苜蓿提高氮素累積，以及合理利用紫花苜蓿、根瘤菌提供基礎(chǔ)性研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與紫花苜蓿品種

試驗(yàn)于2021 年6—10 月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院試驗(yàn)基地溫室大棚進(jìn)行。供試土壤取自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東校區(qū)后山農(nóng)場(chǎng)，屬紅壤土，其pH值5.82，有機(jī)質(zhì)含量為15.02 g·kg-1，全氮含量為1.77 g·kg-1，堿解氮含量為116.4 mg·kg-1，全磷含量為1.5 g·kg-1，有效磷含量為63.25 mg·kg-1，全鉀含量為12.18 g·kg-1，速效鉀含量為57.79 mg·kg-1，總Cd含量為0.38 mg·kg-1，經(jīng)風(fēng)干后的土樣過(guò)篩并進(jìn)行高溫滅菌，混勻后裝盆備用。

紫花苜蓿由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院草業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，品種為“ 維多利亞”和“WL525HQ”。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用溫室土培試驗(yàn)，外源Cd（濃度為50 mg·kg-1，采用CdCl2·2.5H2O 與去離子水配制）與過(guò)2 mm 篩的土壤反復(fù)混合均勻，在溫室下穩(wěn)定7 d，種植紫花苜蓿至開(kāi)花期前（種植期為100 d）。共分為8 個(gè)處理（表1），各處理重復(fù)3 次。試驗(yàn)用花盆規(guī)格為49 cm×15 cm×19 cm，每盆裝入6.0 kg土壤。

表1 試驗(yàn)處理設(shè)置Table 1 The experimental treatments

1.2.1 種子萌發(fā)

挑選顆粒飽滿、大小均勻的紫花苜蓿種子，依次用75%乙醇浸泡10 min、蒸餾水沖洗5 次，20%次氯酸鈉浸泡10 min、蒸餾水沖洗5 遍后浸泡30 min，平鋪在培養(yǎng)皿（9 cm）中，放入25 ℃的培養(yǎng)箱，催芽1 d。

1.2.2 根瘤菌培養(yǎng)

用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g）培養(yǎng)中華根瘤菌225038菌株（北納細(xì)胞微生物保藏管理中心），接種根瘤菌至固體培養(yǎng)基平板上。28 ℃培養(yǎng)3 d 后，挑取單個(gè)菌落接種到液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)制成菌懸液，培養(yǎng)至OD 值為0.8～1.2時(shí)可進(jìn)行接種。

1.2.3 根瘤菌接種及處理

用無(wú)菌鑷子將催芽至1～2 cm 的紫花苜蓿種子移入土壤中，在每株紫花苜蓿根周?chē)尤? mL 菌懸液，每個(gè)花盆中種植20 株，待紫花苜蓿長(zhǎng)出第一片子葉時(shí)，補(bǔ)加等量菌懸液，于溫室中培養(yǎng)，期間定時(shí)觀察結(jié)瘤情況。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

待植株生長(zhǎng)至100 d時(shí)，以盆為單位收獲植株，將整株紫花苜蓿于105 ℃殺青30 min，后置于70 ℃烘至恒質(zhì)量，研磨備用?？偟坎捎脛P氏定氮法測(cè)定[14]，硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量使用5%硫酸-過(guò)氧化氫提取比色法測(cè)定[15-16]，游離氨基酸采用茚三酮溶液顯色法測(cè)定[17]，可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[18]，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測(cè)定[19]。地上、地下部硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、天冬酰胺合成酶（AS）和谷氨酸脫氫酶（GDH）的活性使用酶活性測(cè)定試劑盒（Solarbio，北京索萊寶科技有限公司）測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用SPSS進(jìn)行方差分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，用Origin 2018繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種根瘤菌對(duì)Cd脅迫下紫花苜蓿NR的影響

Cd 脅迫對(duì)紫花苜蓿的NR 活性產(chǎn)生不同程度的抑制作用（圖1）。0 mg·kg-1Cd處理下，接種根瘤菌與不接種的維多利亞、WL525HQ 地上部NR 活性差異不顯著（P＞0.05），接種根瘤菌的WL525HQ地下部NR活性較不接種處理顯著增強(qiáng)51.04%（P＜0.05）。50 mg·kg-1Cd 處理下，與未接種相比，接種根瘤菌WL525HQ 地上部NR 活性提高164.66%（P＜0.05），維多利亞地下部NR 活性提升99.46%（P＜0.05）。與0 mg·kg-1相比，50 mg·kg-1Cd 處理未接種的維多利亞地上、地下部NR 活性分別下降29.89%、70.42%，WL525HQ 地上、地下部NR 活性分別下降85.01%、79.98%。

圖1 硝酸還原酶（NR）活性對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)Figure 1 Response of NR activity to Cd stress

2.2 接種根瘤菌對(duì)Cd脅迫下紫花苜蓿NiR的影響

0 mg·kg-1Cd 處理下，接種根瘤菌與未接種的維多利亞植株的NiR 活性差異顯著（P＜0.05），地上、地下部NiR 活性分別提高12.99%、5.11%（P＜0.05）。50 mg·kg-1Cd 處理下，與未接種組相比，接種根瘤菌維多利亞地上部NiR活性顯著提高13.93%（P＜0.05）。與0 mg·kg-1相比，50 mg·kg-1Cd處理未接種的維多利亞地下部NiR活性下降33.29%，WL525HQ地上、地下部NiR活性分別下降61.43%、63.67%（圖2）。

圖2 亞硝酸還原酶（NiR）活性對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)Figure 2 Response of NiR activity to Cd stress

2.3 接種根瘤菌對(duì)Cd脅迫下紫花苜蓿GS的影響

0 mg·kg-1Cd處理下，與未接種相比，接種根瘤菌的WL525HQ 地上、地下部GS 活性分別提高8.66%、30.56%（P＜0.05）。但接種根瘤菌對(duì)維多利亞植株GS活性影響不顯著（P＞0.05）。與0 mg·kg-1相比，50 mg·kg-1Cd處理下未接種的維多利亞地上部GS活性降低11%（圖3）。

圖3 谷氨酰胺合成酶（GS）活性對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)Figure 3 Response of GS activity to Cd Stress

2.4 接種根瘤菌對(duì)Cd脅迫下紫花苜蓿GOGAT的影響

0 mg·kg-1Cd處理下，與未接種處理相比，接種根瘤菌顯著提高WL525HQ 植株的GOGAT 活性（P＜0.05），地上、地下部分別提升95.53%、38.34%。50 mg·kg-1Cd 處理下，接種根瘤菌WL525HQ 紫花苜蓿地下部GOGAT 活性顯著提高8.42%（P＜0.05），但接種根瘤菌對(duì)維多利亞植株GOGAT 活性影響不顯著（P＞0.05）（圖4）。

圖4 谷氨酸合成酶（GOGAT）活性對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)Figure 4 Response of GOGAT activity to Cd stress

2.5 接種根瘤菌對(duì)Cd脅迫下紫花苜蓿AS的影響

0 mg·kg-1Cd處理下，與未接種處理相比，接種根瘤菌使維多利亞地上部AS 活性提升33.30%（P＜0.05），WL525HQ 地上、地下部AS 活性分別顯著增升24.37%、15.06%（P＜0.05）。50 mg·kg-1Cd 處理下，接種根瘤菌WL525HQ 地上、地下部AS 活性分別增加43.36%、41.63%。與0 mg·kg-1相比，50 mg·kg-1Cd處理降低紫花苜蓿AS 活性，且Cd 對(duì)WL525HQ 的抑制作用較維多利亞更顯著（P＜0.05）（圖5）。

圖5 天冬酰胺合成酶（AS）活性對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)Figure 5 Response of AS activity to Cd stress

2.6 接種根瘤菌對(duì)Cd脅迫下紫花苜蓿GDH的影響

0 mg·kg-1Cd 處理下，接種根瘤菌與未接種紫花苜蓿植株的GDH 活性差異不顯著（P＞0.05）。50 mg·kg-1Cd 處理下，接種根瘤菌WL525HQ 植株地上、地下部的GDH 活性較未接種處理分別下降19.59%、50.91%（P＜0.05）。與0 mg·kg-1相比，50 mg·kg-1Cd處理使WL525HQ 未接種根瘤菌植株地上、地下部GDH活性分別提升54.00%、135.00%（P＜0.05），對(duì)接種根瘤菌維多利亞植株GDH 活性的影響不顯著（P＞0.05）（圖6）。

圖6 谷氨酸脫氫酶（GDH）活性對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)Figure 6 Response of GDH activity to Cd stress

2.7 接種根瘤菌對(duì)Cd脅迫下紫花苜蓿含氮物質(zhì)的影響

0 mg·kg-1Cd 處理下，接種根瘤菌使維多利亞、WL525HQ 硝態(tài)氮含量比未接種處理分別提高15.03%、13.07%（P＜0.05），WL525HQ可溶性蛋白含量提高12.08%，維多利亞游離氨基酸、脯氨酸含量增幅最大，分別為20.24%、71.03%（P＜0.05），接種根瘤菌的WL525HQ 較未接種組總氮含量顯著提高14.28%（P＜0.05）。50 mg·kg-1Cd處理下，接種根瘤菌使維多利亞、WL525HQ 氨態(tài)氮含量增加6.87%、21.67%（P＜0.05），可溶性蛋白含量增加6.24%、5.82%（P＜0.05），游離氨基酸含量增加16.10%和18.70%（P＜0.05），維多利亞脯氨酸、總氮含量增加67.92%、9.48%（P＜0.05）。與0 mg·kg-1相比，50 mg·kg-1Cd處理降低未接種紫花苜蓿的硝態(tài)氮、氨態(tài)氮、可溶性蛋白及總氮含量，增加游離氨基酸及脯氨酸含量（P＜0.05），未接種維多利亞、WL525HQ 硝態(tài)氮含量分別下降23.90%、55.55%（P＜0.05），游離氨基酸含量增加42.17%、61.84%（P＜0.05），同時(shí)50 mg·kg-1Cd 處理誘導(dǎo)紫花苜蓿的脯氨酸含量增多，維多利亞、WL525HQ 分別提高92.52%、85.85%（表2）。

表2 Cd對(duì)紫花苜蓿氮素形態(tài)和含量的影響Table 2 Effects of Cd on nitrogen form and content of alfalfa

3 討論

3.1 Cd 脅迫下接種根瘤菌對(duì)紫花苜蓿氮代謝關(guān)鍵酶的影響

GS 和GOGAT 是植物氮代謝過(guò)程中合成氨基酸的主要酶。其中，GS 參與植株氮代謝途徑的多個(gè)調(diào)節(jié)過(guò)程，也是影響氮同化的關(guān)鍵酶[31]，通過(guò)與GOGAT結(jié)合催化谷氨酰胺合成谷氨酸，GS/GOGAT 循環(huán)對(duì)植物體內(nèi)平衡具有重要的協(xié)同作用[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)Cd 對(duì)紫花苜蓿的GS 活性有一定的抑制作用（圖3），當(dāng)植物處于逆境（如受到Cd脅迫或營(yíng)養(yǎng)缺乏）時(shí)，同化增強(qiáng)且蛋白質(zhì)發(fā)生降解，使得NADH-GDH通路中的GDH 活性顯著增大，誘導(dǎo)脅迫保護(hù)分子合成，根瘤菌能同時(shí)通過(guò)增強(qiáng)GS/GOGAT 循環(huán)、NADHGDH 模式以及增加NR、NiR 的還原產(chǎn)物，促進(jìn)共生體系將無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮，從而抵抗不利環(huán)境的脅迫[34-36]。AS 是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類(lèi)氨基轉(zhuǎn)移酶，能催化谷氨酰胺的氨基向天冬氨酸轉(zhuǎn)移，天冬酰胺的形成與累積是一種解毒反應(yīng)[37]。Lam等[38]利用分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)擬南芥AS 基因ASN1過(guò)表達(dá)使體內(nèi)天冬酰胺累積量增多，改善了逆境中的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況，證實(shí)AS對(duì)植物氮代謝以及氮的“源-庫(kù)”關(guān)系調(diào)節(jié)具有至關(guān)重要的作用。

3.2 Cd脅迫下接種根瘤菌對(duì)紫花苜蓿含氮物質(zhì)的影響

氮是植物體內(nèi)核酸、氨基酸和蛋白質(zhì)等大分子有機(jī)氮化合物的重要組成元素[39]，能直接影響植物的正常生長(zhǎng)、品質(zhì)及產(chǎn)量等[40]。氨基酸含量在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫中的作用尤為重要[41]。研究表明，在受到非生物脅迫時(shí)植物體內(nèi)游離氨基酸含量不斷增加[42]。本研究表明，與無(wú)Cd 處理相比，Cd 處理使紫花苜蓿的游離氨基酸含量增多，是由于細(xì)胞受到脅迫損傷，植物需積累大量游離氨基酸以抵御Cd 的毒害[43]。已有研究發(fā)現(xiàn)，較高含量的脯氨酸可以減弱逆境脅迫引起的滲透損傷[44]，植物對(duì)脯氨酸的累積能力與抵御逆境的能力有一定的相關(guān)性[45]，因而其可以作為脅迫指示劑。本研究中，接種根瘤菌處理使紫花苜蓿共生體系脯氨酸含量增多，說(shuō)明接種根瘤菌的紫花苜?？剐杂兴岣?，在處于相同逆境時(shí)，根瘤菌協(xié)助植株通過(guò)產(chǎn)生更多的脯氨酸來(lái)緩解Cd 的脅迫。這表明接種根瘤菌能夠減少Cd 脅迫對(duì)紫花苜蓿造成的細(xì)胞損傷，增強(qiáng)胞間穩(wěn)定性，維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的平衡，從而使紫花苜蓿具有更強(qiáng)的氮代謝能力與滲透調(diào)節(jié)能力。有研究顯示，豆科植物-根瘤菌共生系統(tǒng)的固氮量約占生物固氮總量的65%[46]。李凱等[47]也發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌的大豆產(chǎn)量及含氮量顯著增加。本試驗(yàn)接種根瘤菌處理后也得出同樣結(jié)果，兩種紫花苜蓿的含氮量均有不同程度的提高，說(shuō)明接種根瘤菌通過(guò)促進(jìn)Cd脅迫下紫花苜蓿的氮代謝過(guò)程提高了植物對(duì)氮素的吸收。

4 結(jié)論

（1）Cd 脅迫影響紫花苜蓿氮代謝，通過(guò)接種根瘤菌調(diào)節(jié)氮代謝關(guān)鍵酶活性介導(dǎo)紫花苜蓿的氮代謝，緩解了Cd對(duì)紫花苜蓿氮代謝的毒害作用。

（2）接種根瘤菌使紫花苜?？扇苄缘鞍?、游離氨基酸和脯氨酸含量增加，提高了紫花苜蓿的滲透調(diào)節(jié)能力。

因此，接種根瘤菌能通過(guò)調(diào)節(jié)紫花苜蓿氮代謝過(guò)程來(lái)緩解Cd造成的傷害，使紫花苜蓿積累更多的氮素。